吳潔 張柯欣 安彤 李思奇 朱赟 陳剛 莊昉成 高孟

杭州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院與法醫(yī)學(xué)院，杭州 310053

CD137 配體（CD137L），又名 4-1BBL，屬于 TNF超家族成員，是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，以延伸的三葉樣螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)揮其生物學(xué)功能。它作為CD137 的高親和力配體，表達(dá)于巨噬細(xì)胞、B 細(xì)胞、DC 和多種腫瘤細(xì)胞等活化的APC 表面[1]。 作為一對(duì)重要的共刺激分子，CD137L 與CD137 通過在免疫細(xì)胞間傳遞活化、增殖或者凋亡信號(hào)來調(diào)節(jié)T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[2]。 CD137L 與其受體結(jié)合，可啟動(dòng)雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)：正向信號(hào)可刺激T 細(xì)胞活化和增殖，反向信號(hào)可刺激B 細(xì)胞增殖[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)，CD137L 及其受體在正常組織及炎癥中表達(dá)不顯著，而在腫瘤組織中呈現(xiàn)高水平表達(dá)， 這種表達(dá)異常與腫瘤發(fā)生、惡化存在一定的相關(guān)性[6-8]。因此，以CD137L 與其受體結(jié)合作為靶點(diǎn)開展相關(guān)研究已成為當(dāng)前抗腫瘤免疫研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。 本研究擬采用重組技術(shù)用腺病毒表達(dá)人的CD137L， 并探索該重組腺病毒在小鼠模型中的抗腫瘤免疫效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料及儀器

HEK293 細(xì)胞和TC-1 腫瘤細(xì)胞均購自美國菌毒種庫保管中心（ATCC），由杭州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院與法醫(yī)學(xué)院（病毒病所）建庫保存；DMEM 液體培養(yǎng)基、 胰蛋白酶、 胎牛血清， 購自 GIBCO 公司；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑購自賽默飛公司；PCR反應(yīng)試劑套盒、 兔抗羊-HRP 酶標(biāo)抗體、 兔抗羊-FITC、ECL 顯色試劑盒購自北京康為世紀(jì)；CD137L特異性單抗（sc-11817）購自英國SantaCruz 公司；小鼠特異性IFN-γ ELISPOT kit 購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；CD137L 重疊多肽庫由南京金斯瑞公司合成；PCR 引物由北京擎科生物科技有限公司合成；SOURCE 30Q 和 Sepharose 4FF 購自 Cytiva 公司；SPF 級(jí)C57bl/6 小鼠在浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)[SYXK（浙）2018-0012]。

主要儀器包括SANYO 細(xì)胞培養(yǎng)箱、Olympus 免疫熒光顯微鏡、BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng)。

二、重組腺病毒的構(gòu)建

委托北京中美泰和生物技術(shù)有限公司對(duì)CD137L 氨基酸序列 （Genebank No. NP_003802.1）進(jìn)行表達(dá)密碼子優(yōu)化，使其能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)， 所得優(yōu)化后的核苷酸序列通過人工合成，以 Mlu Ⅰ和 Hind Ⅲ兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)插入pDC316 質(zhì)粒中，獲得pDC316-CD137L 重組穿梭質(zhì)粒。 用BglⅡ限制性內(nèi)切酶對(duì)pDC316-CD137L 重組穿梭質(zhì)粒進(jìn)行線性化， 并與腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGloxΔE1,3Cre 一 起 ， 在 脂 質(zhì) 體 Lipofectamine 2000 作用下共同轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞單層細(xì)胞，培養(yǎng)所得病毒原液再經(jīng)過3 次挑板純化，即得所需Ad5-CD137L 重組腺病毒種子。

三、重組腺病毒樣本的制備

接種HEK293 至培養(yǎng)瓶中，用含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2）， 待細(xì)胞匯合度達(dá)到 90%以上時(shí)接種Ad5-CD137L 進(jìn)行病毒擴(kuò)增， 收集細(xì)胞病變后上清， 用相對(duì)分子質(zhì)量為300 000 的膜胞進(jìn)行切向流超濾濃縮，再通過SOURCE 30Q 陰離子交換層析和Sepharose 4FF 凝膠排阻層析進(jìn)行純化，所得病毒純化液即為所需的重組病毒樣本。

四、重組腺病毒的檢測(cè)

1. 病毒滴度測(cè)定

接種HEK293 至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%以上時(shí)， 取病毒液按10-1~10-10進(jìn)行梯度稀釋， 取10-3～10-10稀釋度的病毒液分別接種至細(xì)胞培養(yǎng)板孔中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱持續(xù)培養(yǎng)5 d 后，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)各稀釋度病毒液的細(xì)胞病變情況， 計(jì)算出病毒的感染性滴度（IU）[9]。

2. 插入目的基因的鑒定

取病毒樣本經(jīng)沸水浴孵育裂解10 min 后，所得裂解產(chǎn)物以CD137L-F：GCAGAGCTGGTTTAGTGAA CCGTCA 和 CD137L-R：GGACAACCACAACTAGAA TGCAG 為引物對(duì)，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性 3 min；98 ℃變性 10 s，68 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 20 s，29 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸 5 min。 反應(yīng)結(jié)束，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，所得PCR產(chǎn)物同時(shí)送擎科生物進(jìn)行測(cè)序。

3. 目的蛋白表達(dá)的Western 印跡鑒定

取108IU 重組腺病毒Ad5-CD137L 接種至匯合度達(dá)到 90%以上 HEK293 單層細(xì)胞中，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h， 同時(shí)以空的腺病毒載體為對(duì)照。 收集感染細(xì)胞，沸水浴裂解后，行SDS-PAGE 膠電泳并轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。 經(jīng)脫脂奶粉封閉后，加 CD137L(C-20)單克隆抗體（1∶500）4 ℃孵育過夜，洗膜 3 遍后，加兔抗羊 HRP 酶標(biāo)抗體（1∶2 000）室溫孵育30 min 后，經(jīng)ECL 增強(qiáng)后曝光顯色。

4. 目的蛋白表達(dá)的免疫熒光法鑒定

分取106和108IU 的重組腺病毒Ad5-CD137L接種至匯合度達(dá)到90%以上的HEK293 單層細(xì)胞中，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng) 48 h，同時(shí)以空腺病毒載體為對(duì)照；用胰酶消化細(xì)胞，1 500 轉(zhuǎn)/min(離心半徑為3 cm) 離心5 min 棄上清， 將細(xì)胞滴在載玻片上，用封閉液作用10 min 后晾干；加CD137L(C-20)單克隆抗體（1∶100）4℃孵育過夜；洗滌 3 遍后加兔抗羊-FITC （1∶200）37 ℃孵育 1 h， 洗滌 3 遍后加95%甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

五、重組腺病毒的抗腫瘤免疫實(shí)驗(yàn)

1. 小鼠特異性細(xì)胞免疫檢測(cè)

將重組腺病毒 Ad5-CD137L 免疫 6 ～8 周齡C57BL/6 小鼠，同時(shí)以空腺病毒為對(duì)照，并以未接種的小鼠作為空白組，每組3 只小鼠，按108IU /只劑量接種；在初次免疫第14 天處死小鼠，制備脾臟淋巴細(xì)胞懸液，按每孔5×105個(gè)細(xì)胞量，接種至預(yù)包被IFN-γ 抗體的酶聯(lián)細(xì)胞免疫檢測(cè)板中， 每個(gè)樣本都作復(fù)孔。用CD137L 的重疊多肽庫作為刺激物，按照Elispot 試劑盒說明書操作檢測(cè)。 結(jié)果取兩復(fù)孔的平均值作為免疫小鼠的效應(yīng)細(xì)胞數(shù)。

2. 小鼠TC-1 腫瘤模型的抑制試驗(yàn)

培養(yǎng)TC-1 腫瘤細(xì)胞，按2×104個(gè)的細(xì)胞量將細(xì)胞接種于每只C57BL/6 小鼠左腿皮下， 獲得小鼠TC-1 腫瘤模型。 在腫瘤模型建立的24 h 后，重組腺病毒Ad5-CD137L 組和空腺病毒載體組按每只小鼠108IU 的劑量接種于小鼠大腿右側(cè)肌肉，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)10 只腫瘤模型小鼠，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組。觀察對(duì)各個(gè)小鼠的腫瘤生長情況并進(jìn)行腫瘤大小檢測(cè)，根據(jù)腫瘤半徑（r）和長度（L）計(jì)算瘤塊體積

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5.01 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用t 檢驗(yàn)。 P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、重組腺病毒Ad5-CD137L 的構(gòu)建

密碼子優(yōu)化后的CD137L 蛋白表達(dá)基因， 通過MluⅠ和HindⅢ兩個(gè)酶切位點(diǎn)插入pDC316 質(zhì)粒，獲得重組穿梭質(zhì)粒pDC316-CD137L（圖1）。 所得重組穿梭質(zhì)粒pDC316-CD137L 和腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGloxΔE1,3Cre 用脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000 共同轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞， 轉(zhuǎn)染后7~10 d 顯微鏡下觀察：HEK293 細(xì)胞形態(tài)由貼壁的梭形、多角形，胞漿透亮，逐漸改變?yōu)榧?xì)胞圓縮，胞內(nèi)顆粒增多，細(xì)胞間隙增大，出現(xiàn)明顯的病毒噬斑，隨著時(shí)間的推移最后細(xì)胞完全脫落（圖2）。

圖1 pDC316-CD137L 重組穿梭質(zhì)粒圖

圖2 重組穿梭質(zhì)粒和腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞病變圖（×100）

二、重組腺病毒的檢測(cè)結(jié)果

1. 插入目的基因的鑒定

利用特異性引物對(duì)病毒樣本基因組進(jìn)行PCR檢測(cè)， 所得PCR 產(chǎn)物在約1 000 bp 處有一特異性條帶（見圖3），條帶大小與理論相符，且所得PCR產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果也與理論一致。

圖3 重組腺病毒插入目的基因PCR 電泳圖

2. 目的蛋白表達(dá)的免疫印跡鑒定

圖 4 所示, 感染 Ad5-CD137L 重組腺病毒的HEK293 細(xì)胞在相對(duì)分子質(zhì)量約25 000 處有一條特異的免疫印跡條帶， 而感染空腺病毒的HEK293細(xì)胞則未見特異性條帶。

圖4 免疫印跡法鑒定重組腺病毒目的蛋白表達(dá)的結(jié)果

3. 重組腺病毒Ad5-CD137L 蛋白表達(dá)的免疫熒光鑒定

如圖5 所示，Ad5-CD137L 感染后細(xì)胞與特異性抗體結(jié)合后通過熒光標(biāo)記二抗的捕獲，在熒光顯微鏡下可觀察到熒光細(xì)胞，而Ad5 空病毒未觀察到熒光細(xì)胞。

圖5 免疫熒光法鑒定重組腺病毒目的蛋白表達(dá)的結(jié)果（×100）

三、 重組腺病毒Ad5-CD137L 誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)特異性細(xì)胞免疫作用

空白組小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ 的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)為（4±4）SFC/5×105cells；空腺病毒免疫組為（10±5）SFC/5×105cells，與空白組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=1.707，P=0.163）；Ad5-CD137L 重組腺病毒組為（288±76）SFC/5×105cells，顯著高于空腺病毒組（t=6.315，P=0.003）。

四、 重組腺病毒Ad5-CD137L 在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤免疫效果

腫瘤模型建立后小鼠TC-1 腫瘤均處于生長初期，在第 14、21、29 和 39 天觀察腫瘤生長狀況并測(cè)量大小，結(jié)果顯示在不同的觀察時(shí)間空腺病毒組與空白組間腫瘤大小的差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t14d=0.504, t21d=0.755, t29d=2.018, t39d=1.884，P 均>0.05）。

腫瘤模型建立第14 天時(shí)，Ad5-CD137L 重組腺病毒組的腫瘤體積小于空白組，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t14d=2.908，P=0.012）; 第 21、29 和 39 天時(shí)，Ad5-CD137L 重組腺病毒組相比空腺病毒組、空白組的腫瘤體積均縮小，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t21d=8.275、7.798；t29d=4.492、7.113；t39d=5.101、10.540；P 均<0.001）。 具體結(jié)果見圖 6。

圖6 重組腺病毒Ad5-CD137L 抑制TC-1 小鼠腫瘤模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果

討 論

腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)的CD137L/CD137 異常表達(dá)已在很多腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，包括直腸癌、黑色素瘤、卵巢癌等惡性腫瘤[10-12]。目前，已有一些CD137 抗體藥物被批準(zhǔn)開展用于惡性腫瘤免疫治療的臨床試驗(yàn)，并且展現(xiàn)出一定的抗腫瘤治療效果[13-14]。 因此推測(cè)，基于表達(dá)CD137L 的重組腺病毒作為腫瘤免疫治療的策略具有一定的可行性。

由于在臨床應(yīng)用中已表現(xiàn)出良好的安全性[15-16]，本文選擇非復(fù)制型的5 型腺病毒作為載體。 本研究構(gòu)建的表達(dá)CD137L 的重組5 型腺病毒載體， 在免疫小鼠體內(nèi)產(chǎn)生顯著的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，同時(shí)在抗腫瘤免疫效果試驗(yàn)中，Ad5-CD137L 重組腺病毒組腫瘤大小明顯縮小， 表明Ad5-CD137L 重組腺病毒能在一定程度上抑制了TC-1 腫瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的增殖，展現(xiàn)了出較好抗腫瘤免疫效果。 Zhang等[17]構(gòu)建了一個(gè)共表達(dá)PD-1 和CD137L 的重組腺病毒，該重組腺病毒也能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，且具有抑制體內(nèi)肝癌細(xì)胞增殖的效果，與本研究的結(jié)果具有相似的效果。

綜上所述， 以CD137L/CD137 為靶抗原開展藥物研究，通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)抗腫瘤免疫治療有著一定的臨床應(yīng)用潛力。應(yīng)用生物技術(shù)，將CD137L 通過病毒載體在體內(nèi)表達(dá)或CD137L cDNA 定向轉(zhuǎn)移至腫瘤細(xì)胞并高效表達(dá)，進(jìn)而與T 細(xì)胞表面CD137 結(jié)合，共刺激T細(xì)胞，這種轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)修飾腫瘤細(xì)胞的策略在抗腫瘤免疫治療及疫苗制備中具有廣闊應(yīng)用前景[18-20]。后續(xù)，我們將開展進(jìn)一步的研究，包括免疫劑量效應(yīng)、免疫細(xì)胞的分化情況、不同腫瘤模型的適應(yīng)性以及高等級(jí)非人靈長類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等，從而進(jìn)一步驗(yàn)證臨床前研究的可行性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明吳潔：整理資料、論文撰寫；張柯欣、安彤、李思奇：收集資料；朱赟、陳剛：處理數(shù)據(jù)，分析統(tǒng)計(jì)；莊昉成、高孟：設(shè)計(jì)、指導(dǎo)、修改稿件