楊 婧，趙耀偉，牛 捷，王 銳

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150000）

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酗酒及其他明確的肝損傷原因而導(dǎo)致的以肝細(xì)胞內(nèi)大量脂肪沉積為主要病理變化的臨床綜合征，與肥胖、糖尿病等代謝類疾病的發(fā)生密切相關(guān)。隨著飲食習(xí)慣的改變，NAFLD 逐漸成為最常見的慢性肝病之一。據(jù)全球流行病學(xué)調(diào)查，NAFLD 在全球的患病率為10%～30%，亞洲國(guó)家平均為11%～16%，其中我國(guó)的患病率約為15%，且按照現(xiàn)有趨勢(shì)發(fā)展，NAFLD 的發(fā)病 年 齡 會(huì) 越 來(lái) 越 低［1，2］。目 前 臨 床 治 療NAFLD 仍是以增加運(yùn)動(dòng)量，改善飲食習(xí)慣，控制體重為主，尚無(wú)理想藥物［3］。

實(shí)驗(yàn)研究表明膈下逐瘀湯能夠降低NAFLD 模型大鼠血脂和肝脂水平，表明其不僅可以抑制脂質(zhì)的吸收，還能促進(jìn)肝臟對(duì)脂質(zhì)的降解代謝［4］，從而緩解脂質(zhì)堆積對(duì)肝臟造成的負(fù)擔(dān)。楊銀花等［5］研究發(fā)現(xiàn)，血液黏稠度與脂肪肝發(fā)生率呈正相關(guān)，因此運(yùn)用膈下逐瘀湯治療脂肪肝具有豐富理論依據(jù)和實(shí)際意義。

在臨床應(yīng)用中應(yīng)準(zhǔn)確辨證，依據(jù)患者病情進(jìn)行化裁，才能取得較好臨床療效。臨床觀察表明經(jīng)準(zhǔn)確辨證，將膈下逐瘀湯進(jìn)行加減，治療血瘀痰阻型脂肪肝有效率能夠達(dá)到92.16%。此外，目前對(duì)于NAFLD 的治療多以降脂、減輕胰島素抵抗類藥物為主，與中藥組方的多成分、多通路相比存在一定差距。大多數(shù)降脂藥物具有促進(jìn)血液中的脂質(zhì)進(jìn)入肝臟代謝排泄的作用，極易導(dǎo)致肝損害和肝脂肪沉積加劇，因此藥物選擇應(yīng)更加審慎，相對(duì)而言中醫(yī)藥在這方面具有一定優(yōu)勢(shì)［6］。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為NAFLD 屬“積聚”等范疇，痰、濕、瘀、氣滯是NAFLD 發(fā)病的關(guān)鍵，病位在肝、脾，證型以實(shí)證和虛實(shí)夾雜為主，攻補(bǔ)兼施是NAFLD的基本治則［7］。NAFLD 發(fā)病過(guò)程較為漫長(zhǎng)，肝脾兩藏功能失司貫穿其整個(gè)過(guò)程。因此選方用藥時(shí)應(yīng)注重顧護(hù)肝脾。減味膈下逐瘀湯為我院在臨床治療NAFLD 的常用方，通過(guò)對(duì)活血祛瘀經(jīng)典方劑-膈下逐瘀湯進(jìn)行化裁，刪去原方中五靈脂及川芎，重用歸肝脾兩經(jīng)的枳殼，改變?cè)交钛痧觯平Y(jié)消積之力較強(qiáng)的特點(diǎn)，依據(jù)現(xiàn)代患者多陰血不足的特點(diǎn)，采取顧護(hù)肝脾策略，辨證施治，取得較好臨床療效，具有臨床推廣的價(jià)值。減味后全方為“枳殼、赤芍、當(dāng)歸、紅花、牡丹皮、桃仁、烏藥、香附、延胡索和甘草”。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究減味膈下逐瘀湯治療NAFLD 潛在的活性成分和作用靶點(diǎn)，通過(guò)構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”的作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，以期為減味膈下逐瘀湯的作用機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 非酒精性脂肪肝基因數(shù)據(jù)的差異熱圖和火山圖繪制

Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)國(guó)際高通量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的公共存儲(chǔ)庫(kù)，登錄NBCI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）以“Nonalcoholic fatty liver disease”或“NAFLD”作 為 檢 索 詞 在GEO-DataSets 檢索，選定物種為“Homo sapiens（Human）”，通過(guò)分析與篩選，獲取GSE151158 芯片數(shù)據(jù)。使用R 軟件獲取其差異基因，設(shè)定Pvalue＜0.005 and |log2（fold change）|＞1，繪制熱圖與火山圖，將疾病的差異基因?qū)氲紼xcel 表格中，得到其完整的差異基因數(shù)據(jù)［8］。

1.2 減味膈下逐瘀湯中活性化合物及靶點(diǎn)篩選

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)［9］能夠捕捉藥物、靶標(biāo)和疾病之間的關(guān)系。將減味膈下逐瘀湯方中諸味藥分別提交到數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行篩選，設(shè)定篩選條件為OB≥30%和DL≥0.18，其中OB 指藥物成分經(jīng)循環(huán)所到達(dá)部位及吸收程度和速度；DL 指藥物包含一些特定的功能基團(tuán)或者具有與大多數(shù)藥物相同或相似的物理特征，這兩個(gè)指標(biāo)是篩選藥物活性成分的關(guān)鍵參數(shù)［10］。將篩選結(jié)果導(dǎo)入Drug Bank（https：//go.drugbank.com/），獲得活性化合物所對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。

1.3 減味膈下逐瘀湯活性化合物及其靶點(diǎn)與NAFLD 基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將差異基因結(jié)果與活性化合物對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)通過(guò)處理取交集，最后應(yīng)用Cytoscape 作圖，得到活性化合物與基因靶點(diǎn)間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)一步確定減味膈下逐瘀湯發(fā)揮治療作用的主要活性化合物及其潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 減味膈下逐瘀湯治療NAFLD 基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

研究蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，有助于挖掘核心的調(diào)控基因。設(shè)定DC＞5 和BC＞600，將1.3 篩選結(jié)果，錄入String 數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)定物種為“Homo sapiens”，再將經(jīng)其處理的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 進(jìn)行可視化處理，最終得到PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 減味膈下逐瘀湯治療NAFLD 基因GO 生物功能富集分析

GO 是基因本體論聯(lián)合會(huì)所建立的應(yīng)用于不同物種，對(duì)基因和蛋白功能進(jìn)行限定和描述的數(shù)據(jù)庫(kù)［11］，因此將減味膈下逐瘀湯治療NAFLD 基因進(jìn)行富集分析，并根據(jù)其富集數(shù)目、富集顯著性繪制柱狀圖。

1.6 減味膈下逐瘀湯治療NAFLD 基因KEGG 代謝通道富集分析

KEGG 分析能從基因組和分子水平信息中了解生物系統(tǒng)的高級(jí)功能和效用，將減味膈下逐瘀湯治療NAFLD 基因進(jìn)行富集分析，并進(jìn)行可視化分析。

1.7 減味膈下逐瘀湯治療NAFLD 通路與基因網(wǎng)絡(luò)圖繪制

將上述KEGG 通路分析結(jié)果導(dǎo)入到Cytoscape中，經(jīng)Degree 處理，顯示通路與基因的對(duì)應(yīng)關(guān)系，繪制網(wǎng)絡(luò)圖。

1.8 減味膈下逐瘀湯治療NAFLD 成分-基因靶點(diǎn)對(duì)接

選取VCAM1、HSPB1、MYC 作為分子對(duì)接的靶 蛋 白，并 借 助PDB 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//www.rcsb.org/），獲 取 蛋 白3D 結(jié) 構(gòu)；使 用TCMSP 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）下載活性成分的3D 結(jié)構(gòu)保存為mol2 格式，作為分子對(duì)接配體。將上述結(jié)果導(dǎo)入SwissDock 平臺(tái)（http：//www.swissdock.ch/）進(jìn)行對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 非酒精性脂肪肝基因差異熱圖和火山圖

將從GEO-DataSets 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到的GSE151158 芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，共篩選得到63 個(gè)樣本，使用R 軟件獲取其差異基因，獲得差異基因377個(gè)。設(shè) 定Pvalue＜0.005 和|log2（fold change）|＞1［8］，進(jìn)行可視化分析，得到相應(yīng)熱圖和火山圖。圖中橫坐標(biāo)是案例個(gè)數(shù)，縱坐標(biāo)是基因或相關(guān)名稱。紅色表示該基因或相關(guān)表達(dá)明顯增加，綠色表示該基因或相關(guān)表達(dá)降低，黑色則表示在此篩選條件下表達(dá)無(wú)差異。見圖1、2。

圖1 正常人與NAFLD 差異基因熱圖Fig 1 Heat map of differential genes between normal and NAFLD

2.2 減味膈下逐瘀湯活性化合物及靶點(diǎn)

依據(jù)OB≥30%和DL≥0.18，篩選得到復(fù)方活性化合物如下：赤芍14 個(gè)，當(dāng)歸2 個(gè)，甘草88 個(gè)，紅花17 個(gè)，牡丹皮6 個(gè)，桃仁19 個(gè)，烏藥9 個(gè)，香附16個(gè)，延胡索49 個(gè)，枳殼5 個(gè)，刪除重復(fù)值篩選得到活性化合物基因307 個(gè)。刪除重復(fù)值后共得到308 個(gè)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。

2.3 減味膈下逐瘀湯活性化合物與NAFLD 基因網(wǎng)絡(luò)圖

將減味膈下逐瘀湯中活性化合物對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)與NAFLD 差異基因進(jìn)行處理，應(yīng)用Cytoscape 繪圖，得到活性化合物與基因間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，圖3 外圈不同顏色代表了該成分來(lái)自于不同藥物，內(nèi)圈代表了藥物作用靶點(diǎn)與疾病間的相關(guān)基因，網(wǎng)絡(luò)中的連線表示化合物與基因間存在聯(lián)系，連線越多則代表該因素越處于核心地位。圖示分子MOL000098 對(duì)應(yīng)最多的靶點(diǎn)；PTGS2 為主要作用靶點(diǎn)。見圖3。

圖3 減味膈下逐瘀湯治療NAFLD 分子基因網(wǎng)絡(luò)圖和活性化合物顏色與對(duì)應(yīng)藥物Fig 3 Molecular gene network diagram of Jianwei Gexia zhuyu Decoction in the treatment of NAFLD and active compounds colors and corresponding drugs

2.4 減味膈下逐瘀湯治療NAFLD 基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 正常人與NAFLD 差異基因火山圖Fig 2 Volcano map of differential gene between normal and NAFLD

對(duì)減味膈下逐瘀湯的活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)與NAFLD 的差異基因交集結(jié)果進(jìn)行拓?fù)浞治?，目的是通過(guò)不同的篩選條件，精簡(jiǎn)PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。主要有兩個(gè)篩選條件，一是度中心性（degree centrality，DC）＞5，二是中介中心性（betweenness centrality,BC）＞600，通過(guò)篩選構(gòu)建膈下逐瘀湯治療NAFLD的拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)。拓?fù)鋱D中最后篩選出的粉色矩形代表主要核心基因即VCAM1、HSPB1、MYC。見圖4。

圖4 減味膈下逐瘀湯治療NAFLD 基因的拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)Fig 4 Topological network of Jianwei Gexia Zhuyu Decoction for the treatment of NAFLD

2.5 減味膈下逐瘀湯治療NAFLD 基因GO 富集分析圖

將減味膈下逐瘀湯中有效活性成分基因進(jìn)行富集分析，根據(jù)基因富集數(shù)目與顯著程度，選取20條GO 生物過(guò)程繪制柱狀圖，結(jié)果顯示主要涉及生物過(guò)程（BP）中對(duì)脂多糖的反應(yīng)，對(duì)細(xì)菌源分子的反應(yīng)和對(duì)有機(jī)磷的反應(yīng)等；分子功能（MF）顯示主要具有DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑的活性，RNA 聚合酶Ⅱ的特異性，活化轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，結(jié)合蛋白酶等功能。提示減味膈下逐瘀湯對(duì)NAFLD 的治療主要涉及脂質(zhì)的脂多糖，有機(jī)磷的代謝和蛋白質(zhì)結(jié)合和轉(zhuǎn)錄等方面。見圖5。

圖5 減味膈下逐瘀湯治療NAFLD 基因生物過(guò)程和基因分子功能Fig 5 Biological process and molecular functionof Jianwei Gexia Zhuyu Decoction for the treatment of NAFLD

2.6 減味膈下逐瘀湯治療NAFLD 基因KEGG 富集分析圖

將膈下逐瘀湯中有效活性成分基因進(jìn)行KEGG 富集分析，結(jié)果顯示共有60 條通路，根據(jù)其富集數(shù)目與顯著程度繪制的氣泡圖，見圖6。篩選排名前20 條的通路，繪制表格，見表1。結(jié)果顯示前20 條通路主要包括：IL-17 信號(hào)通路（IL-17 signaling pathway）、糖尿病并發(fā)癥中的Wnt 受體信號(hào)通路（Wnt signaling pathway）、NF-κB 信 號(hào) 通 路（NF-kappa B signaling pathway）、TNF 信 號(hào) 通 路（TNF signaling pathway）、AGE-RAGE 信 號(hào) 通 路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、C 型凝集素受體信號(hào)通路（C-type lectin receptor signaling pathway）、Toll 樣 受 體 信 號(hào) 通 路（C-type lectin receptor signaling pathway）等。因此減味膈下逐瘀湯的有效成分可能通過(guò)以上這些通路發(fā)揮治療作用。

圖6 減味膈下逐瘀湯治療NAFLD 基因KEGG 圖Fig 6 KEGG pathway enrichment bubble plot of Jianwei Gexia Zhuyu Decoction Gexia Zhuyu Decoction for the treatment of NAFLD

2.7 減味膈下逐瘀湯治療NAFLD 通路與基因網(wǎng)絡(luò)圖

將上述KEGG 通路導(dǎo)入到Cytoscape 中，根據(jù)Degree 值大小，顯示通路與基因的富集程度，繪制網(wǎng)絡(luò)圖，見圖7。該網(wǎng)絡(luò)可以反映基因和通路之間的關(guān)系，連線說(shuō)明該基因?qū)儆谠撏?，圖形的大小則反映了連接點(diǎn)的數(shù)目，連接點(diǎn)越多圖形越大。圖示hsa04657 是基因?qū)?yīng)數(shù)目最多的通路，JUN是主要作用基因，具體通路見表1。

表1 減味膈下逐瘀湯治療NAFLD 通路Tab 1 Pathway of Jianwei Gexia Zhuyu Decoction for the treatment of NAFLD

圖7 減味膈下逐瘀湯治療NAFLD 通路與基因網(wǎng)絡(luò)圖Fig 7 Pathway and gene network diagram of Jianwei Gexia Zhuyu Decoction for the treatment of NAFLD

2.8 減味膈下逐瘀湯治療NAFLD 成分-基因靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果

運(yùn)用SwissDock 平臺(tái)將受體與配體進(jìn)行分對(duì)接，對(duì)接結(jié)果顯示，見表2。分子與標(biāo)靶蛋白的最低結(jié)合能均小于0，分子對(duì)接的結(jié)合能為負(fù)表明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合。證明減味膈下逐瘀湯中活性成分與NAFLD 核心基因可以自發(fā)結(jié)合。其中作為主要活性成分的槲皮素與VCAM1、HSPB1、MYC、JUN 對(duì)接結(jié)合能分別為：-20.071 2、-27.302 5、-33.264 6、-31.213 2 kJ/mol；黃芩素的對(duì)接結(jié)合能分別為：-37.609 5、-30.042 0、-40.846 8、-33.432 2 kJ/mol。

表2 槲皮素、黃芩素與疾病核心靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)合能（kJ/mol）Tab 2 Molecular docking binding energy of quercetin and baicalein with disease core targets（kJ/mol）

通過(guò)Swissdock 對(duì)對(duì)接結(jié)果的可視化處理，如圖8 所示，A、B、C 為槲皮素與VCAM1、HSPB1、MYC 對(duì)接模式圖；D、E、F 為黃芩素與VCAM1、HSPB1、MYC 對(duì)接模式圖。

圖8 分子對(duì)接模式圖Fig 8 Molecular docking pattern

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為痰濁、瘀血、濕熱、氣滯相互交結(jié)形成NAFLD，痰濕、血瘀既是形成本病的主要病理誘因，也是本病論治的關(guān)鍵［12］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，氣滯血瘀與氣虛血瘀是肝纖維化的主要證型，分別占病例的27%和23%［13］。因此在臨床治療中，治則以活血化瘀、祛濕化痰為主。

膈下逐瘀湯原方具有活血化瘀，行氣止痛之功，實(shí)驗(yàn)表明高脂飼料誘導(dǎo)的NAFLD 模型大鼠早期出現(xiàn)以血清、肝勻漿ALT、AST 升高的肝功能異常等現(xiàn)象，應(yīng)用膈下逐瘀湯干預(yù)后能夠明顯改善肝功能狀態(tài)［14］，此外還能明顯抑制由二磷酸腺苷誘導(dǎo)的血小板聚集［15］?；钛龇剿幙筛纳拼笫笤缙谥靖蔚母窝髁?，抑制血小板聚集，且隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)其抑制作用效果更顯著［16］。此外，經(jīng)膈下逐瘀湯干預(yù)后，電鏡下顯示周胞漿內(nèi)大小不一的圓形脂滴數(shù)量減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張程度，線粒體腫脹擴(kuò)張和嵴模糊程度均有所減輕［17］。雖然減味膈下逐瘀湯取得較好的臨床效果，但是其具體作用成分、靶點(diǎn)及通路尚未明確，現(xiàn)有研究資料較為缺乏，因此本次研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)其進(jìn)行分析，篩選復(fù)方中有效活性成分，進(jìn)一步確定其發(fā)揮治療作用的靶點(diǎn)及通路，最終為減味膈下逐瘀湯治療NAFLD 的臨床研究及運(yùn)用提供依據(jù)。

通過(guò)篩選減味膈下逐瘀湯得到活性化合物225個(gè)，將其與NAFLD 差異基因取交集后得到分子靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，圖示有效化合物168 個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)14 個(gè)。多種化合物對(duì)應(yīng)單一靶點(diǎn)，如大多數(shù)化合物作用于PTGS2；也存在某一化合物對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)，如MOL000098-槲皮素、MOL002714-黃芩素，這也從側(cè)面印證了中藥復(fù)方多靶點(diǎn)的特性。PTGS2 是前列腺素內(nèi)源性過(guò)氧化物合酶PTGS 的異構(gòu)酶之一，PTGS 及其產(chǎn)物參與炎癥反應(yīng)、凝血平衡等多種生理病理過(guò)程［18］。立即早期基因PTGS2的表達(dá)對(duì)抑制過(guò)度纖維化和炎性反應(yīng)發(fā)展有重要作用。當(dāng)細(xì)胞受到相應(yīng)刺激時(shí)，PTGS2的表達(dá)迅速上調(diào)，進(jìn)而催化花生四烯酸產(chǎn)生多種前列腺素，產(chǎn)生疼痛、炎性反應(yīng)以及抗纖維化等作用［19，20］，因此PTGS2 可能是治療NAFLD 的主要靶點(diǎn)。

槲皮素是一種廣泛存在于植物中的天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗癌等藥理作用［21］，可通過(guò)抑制肝臟炎癥因子的產(chǎn)生、減輕肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激、改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝等途徑治療NAFLD［22］；黃芩素是黃芩的主要活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、清除自由基、心腦血管保護(hù)等作用，具有肝保護(hù)、抗氧化和抗衰老作用，此外實(shí)驗(yàn)研究表明黃芩素能明顯改善快速老化小鼠模型的肝損傷情況［23］。槲皮素和黃芩素能調(diào)節(jié)大多數(shù)靶點(diǎn)，具有抗炎，調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)紊亂，改善凝血狀況和肝損傷等作用，因此其可能是減味膈下逐瘀湯發(fā)揮治療作用的主要化合物。

為進(jìn)一步確定減味膈下逐瘀湯治療NAFLD 潛在靶點(diǎn)，將篩選到的14 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治鲋谱鱌PI 圖，篩選標(biāo)準(zhǔn)分別為DC＞5，BC＞600，得到VCAM1、HSPB1、MYC3 個(gè)潛在基因；JUN是富集數(shù)目最多的基因。VCAM-1 即血管細(xì)胞黏附分子-1，是一種重要的細(xì)胞粘附分子，參與免疫細(xì)胞的粘附、遷移以及造血細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，此外VCAM-1 不僅可以在IL-1、TNF-α、IFN-γ 等炎性細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下表達(dá)，它的表達(dá)也能誘導(dǎo)細(xì)胞因子及一些趨化因子的產(chǎn)生［24］；HSPB1 是小分子熱休克蛋白亞家族的重要成員，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的增殖，分化和細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，普遍表達(dá)于多種組 織 細(xì) 胞［25］；MYC基 因 包 括C-myc、N-myc和L-myc，該家族及其產(chǎn)物具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、去分化和轉(zhuǎn)化等功能［26］。Jun基因?yàn)橐活惢蚣易?，包括c-jun、junB和junD。c-jun能夠防止肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)過(guò)度激活，進(jìn)而減弱肝細(xì)胞損傷與凋亡［27］，因此，以上4 個(gè)基因可能是減味膈下逐瘀湯中活性化合物發(fā)揮治療作用的主要靶點(diǎn)。

分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果表明，作為主要活性成分的槲皮素與黃芩素均能夠和VCAM1、HSPB1、MYC、JUN 取得較好對(duì)接結(jié)果，證明減味膈下逐瘀湯活性物質(zhì)可能同這些蛋白結(jié)合發(fā)揮治療作用。本文通過(guò)對(duì)減味膈下逐瘀湯治療NAFLD 基因進(jìn)行富集分析，并繪制柱狀圖及氣泡圖，根據(jù)通路與基因網(wǎng)絡(luò)圖，篩選得DNA-binding transcription activator activity，RNA polymerase Ⅱ-specific，response to lipopolysaccharide 和IL-17 信 號(hào) 通 路。

DNA-binding transcription activator activity，RNA polymeraseⅡ-specific 即DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性表達(dá)和RNA 聚合酶Ⅱ特異性轉(zhuǎn)錄。在真核生物中，RNA 聚合酶Ⅱ負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄數(shù)以萬(wàn)計(jì)的蛋白質(zhì)編碼基因中的多樣化陣列。該過(guò)程的控制主要由成千上萬(wàn)的特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子組成的網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)，這些轉(zhuǎn)錄因子可以解讀遺傳調(diào)控信息，例如轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子和啟動(dòng)子中的信息，并將適當(dāng)?shù)膽?yīng)答傳遞給RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄機(jī)制［28］。如肝細(xì)胞核因子家族，主要包括HNF1、HNF3、HNF4、HNF6 以及CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白，這一類轉(zhuǎn)錄因子主要在肝臟富集表達(dá)，相互調(diào)控形成了一個(gè)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)網(wǎng)，并參與肝臟分化、發(fā)育以及維持成熟肝細(xì)胞正常功能［29］，參與肝臟的發(fā)育、代謝以及功能維持。

Lipopolysaccharide（LPS）即脂多糖，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人群研究均顯示LPS 與NAFLD 的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)。進(jìn)入機(jī)體內(nèi)的LPS 主要在肝臟中解毒，同時(shí)LPS 對(duì)肝臟也具有毒性作用，主要表現(xiàn)為引起肝臟組織產(chǎn)生大量的活性氧和炎癥因子，繼而引發(fā)肝損傷和炎癥反應(yīng)［30］，與NAFLD 的發(fā)生密切相關(guān)。

綜上所示，減味膈下逐瘀湯中主要有效成分槲皮素、黃芩素通過(guò)與VCAM1、HSPB1、MYC、JUN等潛在靶點(diǎn)相互作用，涉及IL-17 信號(hào)通路、脂多糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，提示減味膈下逐瘀湯通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂、改善凝血狀況，干預(yù)NAFLD 進(jìn)程，體現(xiàn)其多靶點(diǎn)、多通路的治療特性。本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)減味膈下逐瘀湯治療NAFLD 的分子機(jī)制進(jìn)行探究，為進(jìn)一步深入研究減味膈下逐瘀湯治療NAFLD 作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

本文設(shè)計(jì)思路由楊婧、王銳教授提供；趙耀偉負(fù)責(zé)靶點(diǎn)篩選、通路富集、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、分子對(duì)接；牛捷負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)可視化及數(shù)據(jù)處理。