張淼 李子昂 嚴(yán)宗輝 楊娟 李坤珂 楊利敏

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)是一種常見的慢性代謝性疾病，自2000年以來，我國T2DM的發(fā)病率呈快速上升趨勢[1]。糖尿病并發(fā)癥是給患者帶來身體及精神上傷害的主要因素，其中糖尿病眼病是最常見并發(fā)癥之一，它能引起患者視力減退，最終導(dǎo)致失明。干眼癥是一種受多因素影響的眼表疾病，以淚膜穩(wěn)態(tài)失衡為主要特征，并伴有眼部不適癥狀，其主要病理生理機(jī)制為淚膜不穩(wěn)定、淚液滲透壓升高、眼表炎癥、損傷以及神經(jīng)感覺異常[2]。穩(wěn)定的淚膜是眼部健康的標(biāo)志，淚膜保護(hù)和濕潤角膜，并形成了光線進(jìn)入視覺系統(tǒng)的第一個界面，干眼患者會有視力下降和視力波動的主訴。有研究顯示，干眼癥與糖尿病眼病之間具有顯著相關(guān)性[3]。至今為止，中樞神經(jīng)系統(tǒng)對干眼癥的調(diào)控作用尚無相關(guān)報道。韁核(habenular nucleus, Hb)是中腦內(nèi)與大腦和腦干多個腦區(qū)具有密切纖維聯(lián)系的重要中繼站，參與機(jī)體多種生理功能的調(diào)節(jié)[4]。有研究顯示，韁核損毀可改善T2DM大鼠的葡萄糖代謝紊亂[5]，但其對T2DM干眼癥是否有改善作用尚不清楚，本研究通過高脂高糖飲食結(jié)合低劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)T2DM大鼠模型，觀察電損毀韁核對T2DM大鼠淚膜破裂時間及淚液分泌的影響，探討韁核對T2DM干眼癥的調(diào)控作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物與試劑

實(shí)驗(yàn)研究。SD雄性大鼠(清潔級，大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)24只，體重(210±30)g；飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境內(nèi)[室溫(23±2)℃]，相對濕度45%～55%，實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)良好，所有動物自由進(jìn)食進(jìn)水。1周后用電子天平秤稱取、記錄大鼠體重，并用苦味酸為大鼠標(biāo)記實(shí)驗(yàn)編號。標(biāo)記后將大鼠隨機(jī)分為正常組(Control)、模型組(T2DM)、T2DM假手術(shù)組和T2DM損毀組，每組大鼠6只。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.T2DM大鼠模型制備:按照大鼠體重稱取適量高脂高糖餅干喂養(yǎng)2周后，對大鼠進(jìn)行稱重，按照體重計算每只大鼠需要注射的STZ劑量，按35 mg/kg劑量對大鼠進(jìn)行一次性尾靜脈注射。注射STZ后大鼠繼續(xù)進(jìn)行高脂高糖餅干喂養(yǎng)，整個過程自由飲水。在整個造模期間要對大鼠血糖進(jìn)行多次復(fù)測，密切觀察大鼠血糖變化。直到大鼠空腹血糖持續(xù)高于11.1 mmol/L，并出現(xiàn)多食、多飲、多尿及體重減輕的癥狀并持續(xù)2周則被視為模型穩(wěn)定。

2.Hb損毀:大鼠需禁食12 h，戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉。應(yīng)用鼠腦立體定位儀，根據(jù)鼠腦圖譜定位Hb(前囟后3.4～3.8 mm，中線旁0.6～0.9 mm，硬腦膜下4.2～4.6 mm)所在的位置。應(yīng)用牙科鉆顱骨表面鉆孔，電極尖端置入Hb并通電損毀(電流：2 mA，時長：1 min)，應(yīng)用相同方法損毀另一側(cè)Hb。損毀完成后縫合頭部皮膚，并消毒。假手術(shù)組大鼠經(jīng)歷相同的手術(shù)過程，但電極無電流通過。

3.淚膜破裂時間(breakup time，BUT)檢測: 在常溫、濕度適宜、避光室內(nèi)環(huán)境下進(jìn)行。使用抗生素滴眼液濕潤但無多余殘留藥液的熒光素試紙接觸下眼瞼瞼緣，使熒光素液體均勻涂布于眼表，在手持裂隙燈下觀察角膜情況,運(yùn)用秒表進(jìn)行計時,記錄最后一次眨眼后角膜表面出現(xiàn)首個黑斑的時間,每只眼至少測量3次,記錄結(jié)果取平均值。

4.淚液分泌試驗(yàn)(Schirmer Ⅰ test，S I t)：Schirmer試紙(5 mm × 35 mm)頭端在起始線處折起，置入下眼瞼外中1/3交界處的結(jié)膜囊內(nèi)，測量5 min內(nèi)淚液浸濕試紙的長度。Schirmer Ⅰ試驗(yàn)是無麻醉測試，反映主淚腺的分泌功能。

5.眼壓檢測:手持式回彈眼壓計(TonoLab，Icare，Espoo，F(xiàn)inland)測量眼內(nèi)壓(intraocular pressure,IOP)，打開眼壓計，安裝探針，將眼壓計靠近大鼠眼睛，無需眼部麻醉，調(diào)整好距離，輕按測量按鈕，依次完成6次測量，獲得平均值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。兩組間或同一組實(shí)驗(yàn)前后數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)及 組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般情況

與正常對照組相比，T2DM大鼠體重減輕且精神狀態(tài)較差，制備模型中后期大鼠出現(xiàn)煩渴和多尿癥狀，而且由于喂食了高脂肪和高糖飼料，大鼠糞便呈黃色。注射STZ后個別大鼠會出現(xiàn)爛尾情況，且后期大鼠出現(xiàn)腹脹、消化不良、食欲下降，有個別大鼠造模過程中因血糖過高而死亡。T2DM韁核損毀組大鼠在對外界的刺激反應(yīng)方面較T2DM組大鼠有所緩解，多尿癥狀也有所改善，精神狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)。

二、Hb損毀降低T2DM大鼠血糖水平

高脂高糖飲食結(jié)合低劑量單次STZ尾靜脈注射1個月后，與實(shí)驗(yàn)前/正常對照組相比大鼠血糖水平明顯升高(P<0.01)，Hb損毀后，大鼠血糖水平明顯降低(P<0.01)，但假手術(shù)組大鼠在手術(shù)前后血糖水平并無顯著性變化。見圖1。

圖1 四組大鼠血糖水平的變化

三、Hb損毀可延長T2DM大鼠淚模破裂時間

與實(shí)驗(yàn)前/正常對照組相比，T2DM大鼠淚膜破裂時間明顯縮短(P<0.01)。Hb損毀后，大鼠淚膜破裂時間明顯延長(P<0.001)，而假手術(shù)組大鼠并無明顯變化，且Hb損毀組大鼠的淚膜破裂時間較假手術(shù)組亦明顯延長(P<0.001)。見圖2。

圖2 大鼠淚膜破裂時間

四、Hb損毀可增加T2DM大鼠淚液分泌量

與實(shí)驗(yàn)前/正常對照組相比，T2DM大鼠淚液分泌明顯減少(P<0.01)。Hb損毀后，大鼠淚液分泌明顯增加(P<0.001)，而假手術(shù)組大鼠淚液分泌量并無明顯變化。Hb損毀組大鼠的淚液分泌量較假手術(shù)組明顯增加(P<0.001)。見圖3。

圖3 大鼠淚液分泌的變化

五、Hb損毀可降低T2DM大鼠眼壓

與實(shí)驗(yàn)前/正常對照組相比，T2DM大鼠眼壓增高(P<0.01)。Hb損毀后，大鼠眼壓顯著降低(P<0.01)，而假手術(shù)組大鼠手術(shù)前后眼壓無明顯變化。Hb損毀組大鼠的眼壓較假手術(shù)組明顯降低(P<0.001)。見圖4。

圖4 大鼠實(shí)驗(yàn)前后眼壓的變化

討 論

糖尿病眼病是最常見的并發(fā)癥之一，也是糖尿病早期最易出現(xiàn)的并發(fā)癥，干眼癥與糖尿病眼病之間具有顯著相關(guān)性[3]。因此揭示糖尿病性干眼癥的病理機(jī)制及其調(diào)控機(jī)理將有利于臨床干眼癥的治療。本研究通過動物實(shí)驗(yàn)再次證明T2DM中干眼癥的高發(fā)率，同時發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)對T2DM干眼癥具有重要的調(diào)控作用，此發(fā)現(xiàn)為臨床T2DM干眼癥的治療和預(yù)防提供了新的思路。

T2DM是一種慢性代謝疾病，患者特征表現(xiàn)為高血糖、相對缺乏胰島素、有胰島素抗性等癥狀，本研究采用的高脂高糖飲食結(jié)合低劑量STZ誘導(dǎo)的T2DM大鼠模型與人類T2DM最為相似的動物模型[6]，在此模型基礎(chǔ)上的研究也是最可靠和有效的。本研究結(jié)果顯示，所有T2DM大鼠均存在淚膜破裂時間縮短和淚液分泌減少的癥狀，這與國內(nèi)外其他實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果完全一致[7]。糖尿病病程、血糖水平等是影響干眼發(fā)生發(fā)展的主要危險因素，且隨著病程的進(jìn)展，患者多伴有外周神經(jīng)病變，角膜平均敏感度顯著降低，淚膜穩(wěn)定性降低發(fā)生干眼幾率和嚴(yán)重程度明顯增加[8，9]。長期體內(nèi)高血糖水平會影響機(jī)體正常生理代謝，引起免疫炎癥反應(yīng)激活、細(xì)胞凋亡增加和性激素失衡，導(dǎo)致眼表結(jié)構(gòu)發(fā)生改變和角膜周圍神經(jīng)病變，淚液分泌功能、淚液成分、角膜上皮表面絨毛結(jié)構(gòu)和滲透壓受到影響，導(dǎo)致淚膜不穩(wěn)，誘使干眼發(fā)生。其中角膜神經(jīng)病變可影響淚液的反射性刺激分泌，淚液中的水、蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽、葡萄糖、尿素和酶，共同組成眼表的第一道防御屏障，當(dāng)淚液成分和量發(fā)生改變，淚液和眼表神經(jīng)肽的合成異常且通過缺陷受體發(fā)出錯誤信號，會導(dǎo)致眼表保護(hù)清除功能異常，影響對角膜的營養(yǎng)功能，從而加重干眼癥[10]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，T2DM大鼠眼壓顯著升高，這與其他實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果[11]及人類糖尿病患者眼壓升高的臨床癥狀完全一致[12]，其發(fā)生機(jī)理可能與淚膜穩(wěn)定性下降及淚液分泌失調(diào)有關(guān)。Hb損毀在改善干眼癥狀的同時亦可降低T2DM大鼠眼壓水平，說明干眼癥狀與眼壓之間存在著某種聯(lián)系，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)在機(jī)體多種生理功能的調(diào)節(jié)方面起著不可忽視的作用，Hb已經(jīng)證明參與了機(jī)體多種生理功能的調(diào)節(jié)[4]。但關(guān)于Hb對T2DM眼功能的調(diào)控作用尚無報道。我們的前期研究已經(jīng)證實(shí)，Hb損毀可降低T2DM大鼠血糖水平[5]，但對T2DM并發(fā)癥是否有影響尚未可知。本研究通過電損毀的方式移除T2DM大鼠的Hb，發(fā)現(xiàn)消除Hb后不僅可降低T2DM大鼠血糖水平，而且可明顯改善T2DM大鼠的干眼癥狀，同時也降低了T2DM大鼠的眼壓。糖尿病眼部病變主要涉及視神經(jīng)細(xì)胞和血管變性、炎癥反應(yīng)以及淚腺中糖基化產(chǎn)物增加和結(jié)膜杯狀細(xì)胞顯著減少等機(jī)制，Hb損毀改善T2DM大鼠干眼癥狀很可能是通過對外周神經(jīng)興奮性及外周淋巴循環(huán)功能的調(diào)節(jié)而發(fā)產(chǎn)生作用，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究加以揭示。