朱銀雪，王德祥，孔 影，陸文捷，葉 慧，郝海平

（中國藥科大學(xué)藥物代謝動力學(xué)重點實驗室，南京 210009）

蛋白質(zhì)是生命活動的基礎(chǔ)，參與生命體內(nèi)運輸、催化、調(diào)節(jié)等多種過程，而這些生物學(xué)功能與蛋白質(zhì)的序列密切相關(guān)。為了探究蛋白質(zhì)的序列與功能的關(guān)聯(lián)，將特定的氨基酸定點突變成其他氨基酸，研究蛋白質(zhì)相應(yīng)的功能改變，是研究該問題的經(jīng)典手段［1-2］。但是，氨基酸的突變通常局限于20 種常用的氨基酸，而天然氨基酸自身攜帶的功能基團有限，難以滿足改變、甚至賦予蛋白質(zhì)以更加豐富的、多樣的生物學(xué)功能的需求［3-4］。

近年來，通過基因密碼子拓展技術(shù)，向蛋白質(zhì)中引入非天然氨基酸，賦予目標蛋白以新的生物學(xué)功能的研究取得了重要進展［5］?；蚓幋a的非天然氨基酸種類繁多，攜帶的官能團包括烯基、鹵代烷烴、磺?；?、炔基、疊氮、醌甲基、喹啉基、磷酸基、乙?；龋?］。這類化學(xué)基團能夠通過親核取代、光激活、點擊化學(xué)等多種反應(yīng)賦予蛋白質(zhì)以新的特性，幫助闡明蛋白質(zhì)及其特定結(jié)構(gòu)域和位點的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能。現(xiàn)有的非天然氨基酸已被編碼插入不同類型的活細胞（比如大腸埃希菌、酵母、哺乳細胞等［7-9］）中，可用于增加靶蛋白的光、熱穩(wěn)定性，定位蛋白質(zhì)在體內(nèi)的分布，揭示未知的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，研究翻譯后修飾對蛋白質(zhì)功能的調(diào)節(jié)等［10-11］。值得一提的是，向目標蛋白質(zhì)位點特異性地引入含有化學(xué)反應(yīng)性或光激活交聯(lián)基團的非天然氨基酸能夠使得目標蛋白與其相互作用的靶標蛋白在互作區(qū)域形成共價鍵，從而獲得與靶標蛋白親和力更強的類似物，在生物藥物研發(fā)領(lǐng)域具有極大的轉(zhuǎn)化價值。這是由于相較于傳統(tǒng)的小分子，高反應(yīng)活性的共價生物藥物對靶標蛋白具有更高的選擇性，能夠顯著降低脫靶的副作用［12-13］，為具有明確結(jié)合靶標的生物藥物設(shè)計帶來了新的機遇。

目前已有超過200 種非天然氨基酸能夠通過基因密碼子拓展技術(shù)引入到蛋白質(zhì)中［14-15］。本綜述根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能大致分為4 類（圖1）：化學(xué)反應(yīng)型（1 ~ 10）、光交聯(lián)型（11 ~ 16）、熒光標記型（17 ~ 19）以及翻譯后修飾型（20 ~ 21），并舉例說明了基因編碼的非天然氨基酸如何改變蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用。

圖1 基因編碼的非天然氨基酸的分類及結(jié)構(gòu)示意圖

1 基因密碼子拓展技術(shù)

基因密碼子擴展技術(shù)指的是利用生物正交的氨酰tRNA 合成酶和tRNA 分子對，將非天然氨基酸定點插入到蛋白質(zhì)中的技術(shù)。該技術(shù)首先通過進化出特異性識別非天然氨基酸的氨酰-tRNA 合成酶和正交的tRNA，合成出結(jié)合了非天然氨基酸的氨?；痶RNA，隨后，該氨?；痶RNA 識別mRNA上的無義密碼子，在目標蛋白質(zhì)的特定位點插入非天然氨基酸［5］（圖2）。

圖2 基因密碼子拓展技術(shù)示意圖

2 化學(xué)反應(yīng)型非天然氨基酸

將化學(xué)反應(yīng)型非天然氨基酸引入目標蛋白質(zhì)能調(diào)控目標蛋白與其互作蛋白的親和力，影響互作介導(dǎo)的信號傳遞，具有轉(zhuǎn)化為治療疾病的生物藥物的潛力，并且能夠用于揭示未知的蛋白質(zhì)互作關(guān)系。常規(guī)的化學(xué)交聯(lián)劑多依賴于與靶標蛋白的氨基酸的氨基、巰基等活性基團發(fā)生反應(yīng)。這種非特異性的交聯(lián)作用會導(dǎo)致目標蛋白產(chǎn)生脫靶并結(jié)合其他蛋白的風(fēng)險；使用鄰近激活的非天然氨基酸則能夠保證只有當靶蛋白的特定區(qū)域與插入了非天然氨基酸的目標蛋白足夠接近時，才會觸發(fā)共價交聯(lián)反應(yīng)。這種賦予目標蛋白共價結(jié)合靶標蛋白能力的基因編碼非天然氨基酸的技術(shù)在蛋白質(zhì)藥物研發(fā)方面已經(jīng)展現(xiàn)出巨大的轉(zhuǎn)化潛力。

2.1 靶向半胱氨酸

Xiang 等［16］首次將非天然氨基酸Ffact（p-2′-fluoroacetylphenylalanine）（1）引入ZSPA擬抗體（affibody）蛋白，利用弱親電性的C 原子與鄰近的強親核性半胱氨酸的親核取代反應(yīng)（圖3），在體外實現(xiàn)對Z 蛋白的共價交聯(lián)。此外，F(xiàn)fact還被引入哺乳細胞的1 型促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子受體（corticotropin-releasing factor receptor type 1，CRF1R）中，用于研究CRF1R 與內(nèi)源性配體尿皮質(zhì)素蛋白質(zhì)復(fù)合物的拓撲結(jié)構(gòu)，為理解受體的活化機制提供了獨特的結(jié)構(gòu)信息，有助于針對CRF1R的藥物設(shè)計［17］。

圖3 非天然氨基酸Ffact靶向半胱氨酸的反應(yīng)示意圖

為了得到可調(diào)控的半胱氨酸反應(yīng)性的非天然氨基酸，一系列含有不同鹵素原子與不同長度脂肪鏈的鹵代烷類非天然氨基酸Haloalkane Uaas（unnatural amino acids）（2）被設(shè)計出來。這些鹵代烷非天然氨基酸能夠與目標半胱氨酸殘基形成距離遠超過天然二硫鍵的共價鍵，其穩(wěn)定性也超過天然的二硫鍵，顯著提升了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，為蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究和蛋白質(zhì)工程提供了多樣性［18］。Yang等［19］在鹵代烷類非天然氨基酸的基礎(chǔ)上引入了生物正交反應(yīng)性的炔烴基團，獲得了EB3（3）。以Z蛋白和擬抗體為模型，發(fā)現(xiàn)通過EB3交聯(lián)的肽段可借助點擊化學(xué)反應(yīng)進行富集，富集后的交聯(lián)肽段的質(zhì)譜響應(yīng)比未富集的質(zhì)譜響應(yīng)提高了近30倍，提示EB3 有助于提高基于質(zhì)譜檢測的交聯(lián)蛋白、肽段的靈敏度和準確性。該方法已成功運用于捕獲微弱、瞬時以及未知的蛋白質(zhì)的相互作用，已識別出泛素結(jié)合酶（ubiquitin conjugating enzyme E2 D3，UBE2D3）與增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的弱相互作用，并鑒定出71 個與硫氧還蛋白-1（thioredoxin-1，Trx1）具有相互作用而未見報道的蛋白質(zhì)。

2.2 靶向賴氨酸

部分靶蛋白的結(jié)合界面或位點缺乏可供反應(yīng)的半胱氨酸，為實現(xiàn)共價結(jié)合這類靶標蛋白，F(xiàn)urman等［20］設(shè)計了3 種能與賴氨酸發(fā)生邁克爾加成反應(yīng) 的 非 天 然 氨 基 酸AcrK（Nε-acryloyl-（S）-lysine）、AcrF（p-acrylamido-（S）-phenylalanine）和VSF（p-vinylsulfonamido-（S）-phenylalanine）（4~6）。以ErbB2（receptor tyrosine kinase 2）抗原結(jié)合片段-受體為例，研究發(fā)現(xiàn)當ErbB2抗原結(jié)合片段插入了含有乙烯基磺酰胺的VSF 后，能夠在生理條件下與ErbB2 受體的賴氨酸發(fā)生高效的交聯(lián)，進而干擾ErbB2 受體的二聚化，誘導(dǎo)抗體依賴的細胞毒性作用，干擾細胞增殖，發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。此外，Xuan 等［21］利用芳香基異硫氰酸酯合成了非天然氨基酸pNCSF（para-isothiocyanate phenylalanine）（7），可以在溫和的條件下與賴氨酸的側(cè)鏈氨基發(fā)生親核加成反應(yīng)（圖4），亦能高效地形成蛋白質(zhì)的分子間、分子內(nèi)的交聯(lián)。

圖4 非天然氨基酸pNCSF靶向賴氨酸的反應(yīng)示意圖

2.3 靶向多種氨基酸

鑒于部分靶標蛋白質(zhì)參與結(jié)合的位點不含有半胱氨酸和賴氨酸，因此研究能夠靶向多種氨基酸的非天然氨基酸具有重要價值。Xuan等［22］設(shè)計出攜帶芳基氨基甲酸鹽基團的非天然氨基酸FPheK（8），具有交聯(lián)鄰近的賴氨酸、半胱氨酸以及酪氨酸的能力。然而，F(xiàn)PheK需要在堿性條件下與賴氨酸、酪氨酸反應(yīng)，并且具有中度至重度的細胞毒性，因此主要適用于體外實驗。Wang 等［23-24］通過將芳基氟硫酸鹽基團引入到酪氨酸和賴氨酸的側(cè)鏈，設(shè)計出基于硫（Ⅵ）-氟置換反應(yīng)與鄰近的賴氨酸、組氨酸以及酪氨酸反應(yīng)的非天然氨基酸FSY（fluorosulfate-L-tyrosine）和FSK（fluorosulfonyloxybenzoyl-L-lysine）（9 ~ 10）。這類非天然氨基酸沒有明顯的細胞毒性，具有廣泛應(yīng)用到活細胞的潛力。此外，相比于FSY，F(xiàn)SK 具有更長且柔韌的側(cè)鏈，增加了交聯(lián)鄰近蛋白質(zhì)的可能性。Li 等［25］將FSY 引入人類程序性細胞死亡蛋白-1（human programmed cell death protein-1，PD-1），發(fā) 現(xiàn)PD-1（FSY）能夠共價結(jié)合人類程序性細胞死亡-配體1（human programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1），阻斷PD-L1/PD-1 的結(jié)合和信號通路的激活，逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對T 細胞的免疫抑制作用，促進T 細胞增殖并增強細胞因子的釋放，更加有效地殺傷腫瘤細胞（圖5）。該研究提示：應(yīng)用基因編碼的非天然氨基酸技術(shù)可以將各種生物藥物與靶標蛋白的非共價親和作用轉(zhuǎn)化為共價結(jié)合，增強常規(guī)生物藥物的治療效果。

圖5 共價生物藥物PD-1（FSY）抑制腫瘤生長的原理圖

3 光交聯(lián)型非天然氨基酸

通過向基因編碼的非天然氨基酸引入光激活基團與鄰近氨基酸殘基產(chǎn)生反應(yīng)，能夠?qū)崿F(xiàn)光控的交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，可用于捕捉瞬時、動態(tài)變化的蛋白質(zhì)相互作用，有助于生物過程的研究和可控的藥物設(shè)計（圖6）。

圖6 殘基非選擇性的（A）和殘基選擇性的（B）光交聯(lián)非天然氨基酸的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)示意圖

3.1 殘基非選擇性的光交聯(lián)非天然氨基酸

芳基疊氮化物是應(yīng)用最廣泛的光交聯(lián)劑。Chin 等［26］通過對詹氏甲烷球菌的酪氨酰tRNA 合成酶進行突變，篩選出一種新的正交氨酰tRNA 合成酶/tRNA 對，能選擇性地將非天然氨基酸AziF（p-azido-L-phenylalanine）（11）引入到蛋白質(zhì)中，獲得產(chǎn)率較高的重組蛋白。目前已成功運用于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathioneS-transferase，GST）二聚體拓撲結(jié)構(gòu)的研究。此外，Chin 等［27］將另一種非天然氨基酸pBpa（p-benzoyl-L-phenylalanine）（12）基因編碼至大腸埃希菌表達的蛋白質(zhì)中，利用pBpa的二苯甲酮基團共價交聯(lián)鄰近的氨基酸殘基，拓展了光交聯(lián)反應(yīng)性非天然氨基酸的多樣性。Hino 等［28］將pBpa 引入生長因子受體結(jié)合蛋白2（growth factor receptor-bound protein 2，Grb2）的SH2 結(jié)構(gòu)域，并在中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細胞中進行表達。在波長365 nm紫外光照射下，Grb2-pBpa 成功交聯(lián)了表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）以及內(nèi)源性酪氨酸激酶受體ErbB2，充分證明了pBpa 在研究體外、體內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用的價值。

上述兩種以苯丙氨酸為模板衍生的非天然氨基酸，其光激活基團與蛋白質(zhì)的骨架距離較短，只能在較近的范圍共價交聯(lián)相互作用的蛋白質(zhì)。基于該局限，Yanagisawa等［29］設(shè)計并合成了一種賴氨酸 衍 生 物TmdZLys（Nε-［（（4-（3（trifluoromethyl）-3H-diazirin-3-yl）benzyl）oxy）carbonyl］-L-lysine）（13），其雙吖丙啶基團與Cα的距離為15 ?，而pBpa與Cα距離僅為7.9 ?。以Grb2為模型蛋白，發(fā)現(xiàn)插入TmdZLys 后，Grb2 可以共價交聯(lián)EGFR的103 ~106 和112 位點，而插入pBpa的Grb2 僅能與上述位點形成弱交聯(lián)甚至無交聯(lián)。TmdZLys 這種長側(cè)鏈的非天然氨基酸增加了蛋白質(zhì)之間交聯(lián)的機會，有助于識別蛋白質(zhì)更廣泛的結(jié)合伴侶。因此，不同長度的交聯(lián)劑能夠相互補充，共同勾勒出蛋白質(zhì)相互作用的拓撲結(jié)構(gòu)。

3.2 殘基選擇性的光交聯(lián)非天然氨基酸

上述傳統(tǒng)的光交聯(lián)非天然氨基酸對鄰近的氨基酸殘基不具有選擇性，最近發(fā)展起來的殘基選擇性的光交聯(lián)非天然氨基酸則能與特定氨基酸殘基發(fā)生光交聯(lián)反應(yīng)。Tian 等［30］報道了系列的2-芳基-5-羧基四唑-賴氨酸類似物，其中含有甲基吡咯四唑基團的類似物mPyTK（N-methylpyrroletetrazole-lysine）（14）在紫外光激發(fā)后生成的羧腈亞胺可與鄰近谷氨酸的羧基反應(yīng)。因此，當mPyTK被引入哺乳細胞的Grb2 中，能夠通過光控瞬時交聯(lián)其相互作用的蛋白EGFR。此外，Hu 等［31］設(shè)計合成了鄰硝基苯甲醇類賴氨酸衍生物o-NBAK（o-nitrobenzyl alcohol derived lysine）（15），發(fā) 現(xiàn)o-NBAK 經(jīng)過光異構(gòu)化生成芳基亞硝基中間體后，能選擇性地與鄰近的賴氨酸交聯(lián)，并用于捕獲酶與底物蛋白之間的相互作用。

上述兩種殘基選擇性的光交聯(lián)非天然氨基酸僅能與特定氨基酸殘基反應(yīng)，限制了其靶向蛋白質(zhì)的范圍。Liu 等［32］設(shè)計出FnbY（（2R）-2-amino-3-fluoro-3-（4-（（2-nitrobenzyl）oxy）phenyl）propanoic acid）（16），通過光激活生成的甲基活性醌可共價交聯(lián)體內(nèi)9 種天然氨基酸殘基。以大腸埃希菌中的GST 為模型，在103 位點插入FnbY 后，發(fā)現(xiàn)GST除了與其二聚體界面鄰近的107位賴氨酸反應(yīng)，還與親核性的組氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、谷氨酰胺以及天冬酰胺反應(yīng)。與傳統(tǒng)的光交聯(lián)非天然氨基酸生成的反應(yīng)中間體普遍具有納秒至微秒級別的半衰期相比［33-34］，甲基活性醌半衰期可達到秒級別［35-36］，大大提高了蛋白質(zhì)的交聯(lián)效率。FnbY的這一特性有助于實現(xiàn)活細胞中目標蛋白的高效共價交聯(lián)，在化學(xué)生物學(xué)、生物療法和蛋白質(zhì)工程方面具有應(yīng)用價值［37］。

這類光交聯(lián)非天然氨基酸借助瞬時控制以及不同的殘基反應(yīng)性，為研究時間分辨的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用奠定基礎(chǔ)，對理解生物學(xué)過程和開展轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)相互作用為共價蛋白質(zhì)藥物的研究具有推動作用。

4 熒光標記型非天然氨基酸

對蛋白質(zhì)的熒光標記有助于探索生物大分子在細胞環(huán)境中的動態(tài)過程，實現(xiàn)細胞內(nèi)生理過程的可視化。Chatterjee 等［38］報道了一種帶熒光基團的非天然氨基酸Anap（3-（6-acetylnaphthalen-2-ylamino）-2-aminopropanoic acid）（17），可借助常規(guī)的熒光顯微鏡觀察基因編碼Anap的蛋白質(zhì)的熒光強度，已成功用于定位哺乳細胞中表達的組蛋白H3。Charbon 等［39］以香豆素為原型，設(shè)計了非天然氨基酸CouAA（coumarin-derived amino acid）（18），以FtsZ 蛋白為模型，發(fā)現(xiàn)帶熒光的CouAA 能夠在不影響FtsZ 蛋白功能的基礎(chǔ)上，確定FtsZ 蛋白的亞細胞定位。

基因密碼子拓展技術(shù)除了可以引入本身帶有熒光基團的非天然氨基酸，還可以位點特異性地插入攜帶點擊化學(xué)基團的非天然氨基酸，再通過點擊化學(xué)反應(yīng)引入熒光基團。例如，Jagadish 等［40］將攜帶疊氮基團的非天然氨基酸AziF（11）引入環(huán)肽MCoTI-I 中，利用疊氮與帶有熒光基團的二芐基環(huán)辛炔（dibenzylcyclooctyne，DBCO）的衍生物進行環(huán)加成反應(yīng)，使得環(huán)肽攜帶熒光，用于后續(xù)研究活細胞中環(huán)肽與蛋白質(zhì)的相互作用。Alamudi 等［41］對熒光探針做了篩選優(yōu)化，根據(jù)探針脂溶性、水溶性以及范德華表面積電荷確定探針的細胞通透性和非特異性結(jié)合的強弱，最終選擇分別含有環(huán)辛炔、疊氮化物基團的BODIPY 探針CO-1 和AzG-1，分別用于標記活細胞中插入了AziF（11）和CoK（Nε-（cyclooct-2-yn-1-yloxy）carbonyl）L-lysine）（19）的靶蛋白，并進行活細胞成像。

5 翻譯后修飾型非天然氨基酸

翻譯后修飾是調(diào)控蛋白質(zhì)功能的關(guān)鍵要素之一，影響著細胞中基因轉(zhuǎn)錄、增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫調(diào)控等生命過程。因此，翻譯后修飾的水平和失調(diào)與多種疾病密切關(guān)聯(lián)［42-44］?；蛎艽a子拓展技術(shù)通過向目標蛋白質(zhì)定點的引入翻譯后修飾及其模擬物，有助于闡明翻譯后修飾誘導(dǎo)的底物蛋白發(fā)生的結(jié)構(gòu)和功能的變化。針對最重要的翻譯后修飾之——蛋白質(zhì)磷酸化，Hoppmann 等［45］通過基因編碼引入pTyr（phosphotyrosine）的類似物（20），通過酸處理切除保護基團，高效地獲得特定位點酪氨酸磷酸化的目標蛋白質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠電泳以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)證明了該方法成功地向鈣調(diào)蛋白和綠色熒光蛋白位點特異性地引入了pTyr。此外，向泛素中59位酪氨酸引入磷酸化后，發(fā)現(xiàn)該位點與51 位谷氨酸的氫鍵被破壞，從而影響了Tyr59-Glu51環(huán)區(qū)，引起泛素的構(gòu)象改變，降低其與UBE2D3 結(jié)合的能力，揭示了泛素的59 位酪氨酸磷酸化在泛素化過程中的負性調(diào)節(jié)作用。

由于體內(nèi)存在多種移除翻譯后修飾的酶，Venkat 等［46］設(shè)計出一種有效模擬賴氨酸乙?；?、同時不能被去修飾酶識別的乙?；嚢彼犷愃莆铩虼阴；嚢彼酺AcK（Nε-thioacetyl-Llysine）（21）。以蘋果酸脫氫酶為模型，研究人員發(fā)現(xiàn)插入TAcK的蘋果酸脫氫酶可以被乙?；嚢彼岬奶禺愋钥贵w所識別，并且其酶活性與乙?；问较嗨啤Ｍ瑫r，該修飾不會被去乙酰化酶移除。

目前，賴氨酸泛素化、脂?；⒔z氨酸磷酸化等修飾皆通過基因密碼子拓展技術(shù)被設(shè)計和引入到目標蛋白質(zhì)中［47-50］，成為揭示翻譯后修飾調(diào)控蛋白質(zhì)的有力工具。但是，復(fù)雜的翻譯后修飾的合成和插入仍舊充滿挑戰(zhàn)，最著名的例子是糖基化修飾。糖基化是最重要和復(fù)雜的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，也是影響抗體藥物的穩(wěn)定性、安全性和生物活性的重要因素。我們期待在不久的將來能夠?qū)崿F(xiàn)定點引入糖基化修飾，生成均一性修飾的蛋白質(zhì)，用于生物藥物的藥學(xué)性質(zhì)的理性設(shè)計和優(yōu)化。

6 結(jié) 論

非天然氨基酸通過引入反應(yīng)性基團、熒光基團和翻譯后修飾基團等，賦予了蛋白質(zhì)新的特性。其中，化學(xué)反應(yīng)型和光交聯(lián)型的非天然氨基酸借助反應(yīng)性官能團與鄰近氨基酸殘基發(fā)生共價結(jié)合，可用于靶向目標蛋白結(jié)合的靶標蛋白，不僅具有發(fā)現(xiàn)目標蛋白的新互作伴侶、闡明生物學(xué)過程的潛力，還能夠用于構(gòu)建具有共價結(jié)合靶標蛋白能力的目標蛋白的衍生物，從而轉(zhuǎn)化開發(fā)出新的生物藥物。熒光標記型和翻譯后修飾型非天然氨基酸則為闡明蛋白質(zhì)的功能提供了新的手段。根據(jù)研究的科學(xué)問題，多種非天然氨基酸被不斷的優(yōu)化、改進和創(chuàng)新。我們期待基因密碼子拓展技術(shù)與不同性質(zhì)的非天然氨基酸的融合能夠用于設(shè)計出豐富多樣的生物大分子，為生物療法、生物學(xué)研究和蛋白質(zhì)工程等多個領(lǐng)域帶來重要的突破。