劉燕嬌，文 成，李 丹，高 佩，朱國東

（五邑大學(xué)生物科技與大健康學(xué)院，江門 529030）

鉑類化療藥是臨床上廣泛使用的藥物，具有較高的抗腫瘤活性，但因其非靶向體內(nèi)分布以及無選擇性進(jìn)而殺傷正常細(xì)胞造成嚴(yán)重的不良反應(yīng)，從而限制了其臨床應(yīng)用［1］。脂質(zhì)體作為鉑類化療藥的運輸載體，可以提高藥物靶向性，減少藥物不良反應(yīng)，但是如果載藥脂質(zhì)體到達(dá)腫瘤部位后不能有效地釋放藥物，會影響治療效果［2］。比較典型的例子是SPI-077 脂質(zhì)體，在臨床Ⅱ期研究中治療頭頸癌、晚期非小細(xì)胞肺癌以及復(fù)發(fā)的卵巢癌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SPI-077 雖然在腫瘤部位靶向積累，但由于極其緩慢的藥物釋放，其抗腫瘤效果遠(yuǎn)低于游離順鉑化療藥［3］。因此，開發(fā)具有可控釋放藥物性能的鉑類脂質(zhì)體對于腫瘤治療至關(guān)重要。

分泌性磷脂酶A2（secretory phospholipase A2，sPLA2）在大部分腫瘤類型中高表達(dá)，包括前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌和結(jié)直腸癌等［4-7］。研究人員以這種酶作為觸發(fā)脂質(zhì)體釋放藥物的刺激物，研究酶響應(yīng)性脂質(zhì)體以提高載藥脂質(zhì)體在靶點部位的藥物釋放能力［8-11］。sPLA2是一種酯酶，傾向于水解脂質(zhì)體中磷脂的sn-2 位酯鍵，破壞磷脂膜釋放藥物，且水解產(chǎn)物為1 分子溶血磷脂和1 分子脂肪酸可作為膜滲透增強(qiáng)劑進(jìn)一步觸發(fā)藥物釋放［11］。因為sPLA2對水解底物有選擇性，所以脂質(zhì)體對sPLA2的響應(yīng)性與脂質(zhì)體組成成分有關(guān)，研究表明該酶更傾向于水解破壞由帶負(fù)電荷的磷脂形成的脂質(zhì)體，比如帶磷脂酰乙醇胺（PE）或磷脂酰甘油（PG）等磷脂頭的脂質(zhì)［9-10］，但是較高含量的陰離子磷脂形成的脂質(zhì)體會激活補(bǔ)體反應(yīng)使載藥脂質(zhì)體的體內(nèi)不良反應(yīng)增加。目前進(jìn)入臨床研究階段的酶敏感脂質(zhì)體LiPlaCis，脂質(zhì)體配方中通過加入物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)為25%陰離子磷脂二棕櫚酰磷脂酰甘油（distearoyl phosphoglycerol，DSPG）以確保脂質(zhì)體對sPLA2的響應(yīng)性，但是，動物實驗和臨床Ⅰ期安全性評價實驗表明，引入過高的PG 陰離子磷脂會激活補(bǔ)體反應(yīng)，造成嚴(yán)重的肝毒性和輸液反應(yīng)等副作用［10，12］，因此，需要尋找能提高酶刺激響應(yīng)性的其他兩親性分子用于構(gòu)建酶響應(yīng)性脂質(zhì)體，使酶響應(yīng)性脂質(zhì)體能在靶點部位可控釋放藥物的同時也具有較高的生物相容性。

石膽酸是膽酸類化合物，是人體內(nèi)膽固醇代謝的次級膽酸，其疏水甾核結(jié)構(gòu)和甲基基團(tuán)形成疏水凸面，其羥基和羧基形成親水凹面，是一個面兩親性分子，可自身相互作用形成膠束，也可與磷脂、膽固醇等形成混合膠束，用于運輸藥物，相比于不含石膽酸改造的脂質(zhì)體，加入石膽酸改造脂質(zhì)體的優(yōu)勢在于石膽酸能提高脂溶性藥物溶解性，并且可作為膜滲透性增強(qiáng)劑，促進(jìn)藥物透過生物障礙，包括皮膚、血腦屏障、腸壁、鼻黏膜和角膜［13］。另外，De Luca 等［14］研究表明膽酸類分子（5 μmol/L）能顯著提高sPLA2的活性（P=0.012）。將這類能提高sPLA2的活性和提高細(xì)胞膜滲透性的膽酸類分子與磷脂共制備成脂質(zhì)體，其酶響應(yīng)性如何目前還沒有相關(guān)研究［8-11］。

本研究選擇石膽酸（lithocholic acid，LCA）和3-酮石膽酸（3-keto lithocholic acid，kLCA）兩種面兩親性膽酸類分子與磷脂制備成脂質(zhì)體，LCA 相比于其他的膽酸類分子，其甾核含羥基個數(shù)最少（只有1個3α-OH），疏水性更強(qiáng)，不易造成包封藥物的早期泄漏。本研究以二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2k（DSPE-PEG2k）兩種磷脂為基礎(chǔ)，加入LCA 或者kLCA 構(gòu)建脂質(zhì)體，研究其sPLA2酶刺激響應(yīng)釋放藥物的特性和體外抗腫瘤效果。面兩親性分子LCA 或者kLCA 改造脂質(zhì)體的制備流程及其響應(yīng)sPLA2刺激觸發(fā)藥物釋放的示意圖見路線1。

Scheme 1 Schematic diagram of the preparation of facial amphiphiles-included liposomes(LCA-Lip),(n(DPPC):n(LCA):n(DSPE-PEG2k)=95∶10∶5); kLCA-Lip, (n(DPPC): n(kLCA): n(DSPE-PEG2k) = 95∶10∶5) and subjection to secretory phospholipase A2 (sPLA2) degradation for drug release.

1 材 料

1.1 藥品與試劑

1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酰膽堿（dipalmitoyl phosphatidylcholine，DPPC）、1，2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-［甲氧基（聚乙二醇）-2000］（distearoyl phosphoethanolamine-PEG2k，DSPE-PEG-2k）（美國Avanti Polar Lipids 公司）；石膽酸（Lithocholic Acid，LCA，英國Fluorochem 有限公司）；3-酮基-5β-膽烷-24-羧酸（3-keto lithocholic acid，kLCA）按文獻(xiàn)方法合成［15］；磷酸標(biāo)準(zhǔn)液（上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司）；曲拉通X-100、5（6）-熒光素［5（6）-carboxyfluorescein，CF］（北京百靈威公司）；細(xì)胞膜綠色熒光探針（DiO，北京索萊寶科技有限公司）；奧沙利鉑（oxaliplatin，L-OHP，上海阿拉丁生化科技股份公司）；細(xì)胞計數(shù)試劑盒（CCK-8，上海陶術(shù)生物科技有限公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，上海依科賽生物制品有限公司）；胰酶（0.25% trypsin-EDTA）、雙抗（pen strep）、RPMI 1640 和DMEM 培養(yǎng)基（美國賽默飛公司）；蜂毒型分泌性磷脂酶（bee venom secretory phospholipase A2，Bv sPLA2）、sPLA2（human type IIA）試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司）；實驗用水為超純水（電阻＞3 MΩ，美國密里博Milli-Q 純水儀）；乙腈、甲醇和三氯甲烷為色譜級；其他溶劑為分析級，未經(jīng)進(jìn)一步處理直接使用。

1.2 儀 器

超高效液相色譜-三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Sciex 公司）；高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；納米粒度與Zeta 電位儀（美國麥奇克公司）；Gen5 多功能酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器公司）；CytoFLEX 流式細(xì)胞儀、高速冷凍離心機(jī)（美國貝克曼貝爾特公司）；中型擠壓儀（美國Northern Lipids公司）。

1.3 細(xì)胞株

人結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞和人結(jié)直腸癌Colo205細(xì)胞購自廣州賽庫生物技術(shù)有限公司。

2 方 法

2.1 脂質(zhì)體的制備

脂質(zhì)體通過薄膜水化-凍融循環(huán)擠出法制備。首先按配方要求將定量的磷脂、LCA、kLCA 或DiO（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，3%磷脂）先溶于三氯甲烷中，然后使用微量玻璃進(jìn)樣針將其轉(zhuǎn)移到圓底燒瓶中，使用減壓旋蒸儀除去有機(jī)溶劑三氯甲烷以形成均勻薄膜。痕量有機(jī)溶劑通過過夜真空干燥除去。加入所要包封物質(zhì)的水溶液（100 mmol/L 熒光素CF 水溶液或9 g/L的奧沙利鉑水溶液），在55 ℃中水化2 min，然后渦旋2 min，重復(fù)此步驟使薄膜全部水化成脂質(zhì)體混懸液?；鞈乙涸谝旱獌鼋Y(jié)，然后在55 ℃下水浴溶解，重復(fù)此凍融循環(huán)6 次。使用中型擠壓儀使混懸液擠壓通過兩層聚碳酸酯膜（100 nm）5 次以上，獲得分散均一的單層囊泡脂質(zhì)體。未包封的熒光素CF 或者DiO 通過G75凝膠柱分離除去，未包封的奧沙利鉑通過透析法透析48 h除去，透析袋截留相對分子質(zhì)量大小為7 kD。制備好的脂質(zhì)體放在4 ℃下保存待用。

2.2 包封率和載藥量分析

脂質(zhì)體磷脂濃度通過Bartlett 無機(jī)磷酸鹽分析法測定［16］。通過透析法分析載藥脂質(zhì)體包封率。采用高效液相色譜法測定奧沙利鉑質(zhì)量［17］。將待分析載藥脂質(zhì)體混懸液2 mL 加入透析袋（截留相對分子質(zhì)量為7 kD），透析液為400 mL，24 h 透析完成時取出保留液20 μL（其間換透析液兩次），加入10%曲拉通20 μL 破膜，并用超純水定容到1 mL 后進(jìn)樣分析測定包裹的奧沙利鉑質(zhì)量。取透析液1 mL 進(jìn)樣分析測定未被包裹的奧沙利鉑質(zhì)量。包封率（entrapment efficiency，EE，%）= 包載的藥物質(zhì)量./（包載的藥物質(zhì)量+未被包載的藥物質(zhì)量）× 100；載藥量（loading efficiency，LD，%）=包載的藥物質(zhì)量/脂質(zhì)體載體的質(zhì)量×100。

2.3 電位和粒徑分布分析

載藥脂質(zhì)體的電位、粒徑大小及分散度通過納米粒度與Zeta 電位儀檢測，檢測時的磷脂濃度為2.5 mmol/L。

2.4 酶刺激響應(yīng)性分析

脂質(zhì)體對sPLA2酶刺激響應(yīng)性通過考察包裹熒光素CF 脂質(zhì)體的CF 釋放特性進(jìn)行分析。首先把包裹熒光素CF的脂質(zhì)體和氯化鈣加入玻璃試管中，用Tri-HCl 緩沖液稀釋使磷脂和氯化鈣的最終濃度分別為50 μmol/L 和1 mmol/L，實驗組加入sPLA2酶（100 μg/L），對照組不加sPLA2酶，然后放置在27 ℃水浴中孵育，首先在0 h 取樣品200 μL，通過酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度F0，作為熒光背景強(qiáng)度，檢測激發(fā)光波長為480 nm，發(fā)射光波長為510 nm，然后分別在不同時間點取樣品200 μL檢測熒光強(qiáng)度Ft，最后加入10%曲拉通X-100 10 μL 破膜后檢測總的熒光強(qiáng)度Ftriton。熒光素CF 釋放率=（Ft-F0）/（Ftriton-F0）×100%。

2.5 體外血液穩(wěn)定性分析

為了預(yù)測載藥脂質(zhì)體在體內(nèi)生理條件下的穩(wěn)定性，使用10%，50%FBS體外模擬生理條件，使用透析法分析載藥脂質(zhì)體的藥物泄漏率。首先使用0%，10%，50% FBS/HEPES 緩沖液（HEPES 緩沖液含5%葡萄糖和10 mmol/L，pH 7.4）稀釋載藥脂質(zhì)體并定容到2 mL，最終使藥物質(zhì)量濃度統(tǒng)一為58 μg/mL，待分析液加入到透析袋（截留相對分子質(zhì)量為7 kD）中，透析液為HEPES 緩沖液15 mL，放在37 ℃搖床上振蕩，在24 h和48 h時，收集透析液1 mL進(jìn)樣測量載藥脂質(zhì)體泄漏的奧沙利鉑峰面積Afree，另外取相同體積的脂質(zhì)體，使用曲拉通破膜，定容到15 mL，取1 mL 進(jìn)樣分析載藥脂質(zhì)體總的奧沙利鉑的峰面積Atol。采用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀測定奧沙利鉑峰面積。奧沙利鉑脂質(zhì)體藥物泄漏率（%）=Afree/Atol×100。

液相色譜條件：反向色譜柱為Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；進(jìn)樣體積為5 μL；流動相為10%甲醇和90%水（含0.1%甲酸）；流速為0.5 mL/min；柱溫為40 ℃。

質(zhì)譜條件：離子源，ESI 源；掃描模式，正離子模式的多反應(yīng)監(jiān)控模式（MRM）；采集離子對，母離子Q1 mass/子離子Q3 mass（m/z）：397.90/96.0；離子化電壓，5.5 kV；離子化溫度，550 ℃；去族電壓，60 V；碰撞電壓，52 eV。

2.6 sPLA2酶的收集與定量

結(jié)腸癌Colo205細(xì)胞分泌的磷脂酶A2（secretory phospholipase A2from Colo205 cells culture conditioned medium，CCM sPLA2）來 源 于 體 外 培 養(yǎng)Colo205 細(xì)胞的上清液，通過超濾管濃縮上清液的CCM sPLA2到合適濃度。將3×106個Colo205細(xì)胞接種于T75 培養(yǎng)皿中，使用含有10%FBS，1%雙抗的全培RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，24 h 貼壁后，棄掉舊培養(yǎng)基，使用PBS 緩沖液潤洗1 次，然后加入不含F(xiàn)BS 和酚紅的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)孵育48 h，收集細(xì)胞上清液，18 瓶T75共收集上清液350 mL。使用高速離心機(jī)，轉(zhuǎn)速為6 000 r/min離心10 min，除去死細(xì)胞和其他沉淀物，收集上清液。使用超濾管（截留相對分子質(zhì)量為3 kD）濃縮上清液，轉(zhuǎn)速為6 000 r/min，最終濃縮體積為2 mL。使用sPLA2（human type IIA）免疫檢測試劑盒檢測酶的質(zhì)量濃度為（11.19±30）mg/L。CCM sPLA2放在-80 ℃保存待用。

2.7 體外細(xì)胞攝取分析

脂質(zhì)體體外細(xì)胞攝取量通過流式細(xì)胞儀分析測定。制備4 g/L DiO 儲備液，取DiO 4 mg 溶于氯仿1 mL 中，使用甲醇稀釋成4 000，400，40，4 μg/L 4 個標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，通過酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度，激發(fā)光波長和發(fā)射光波長分別為484 nm 和501 nm，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，以DiO濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性方程和相關(guān)系數(shù)分別為y=0.736x+51.56，R2=0.998，表明DiO 熒光強(qiáng)度在4~4 000 μg/L 質(zhì)量濃度范圍間線性相關(guān)性好。制備待測樣品溶液，取DiO 標(biāo)記的脂質(zhì)體100 μL，加入甲醇900 μL，在65 ℃下加熱2 min，超聲2 min 破膜，然后移取200 μL 加入96 孔板中，使用酶標(biāo)儀測定DiO 熒光強(qiáng)度，然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線推出DiO 標(biāo)記脂質(zhì)體的DiO質(zhì)量濃度。

Colo205細(xì)胞或者HT-29細(xì)胞以每孔2×105個的細(xì)胞密度接種于6 孔板中，24 h 細(xì)胞貼壁后，移棄舊培養(yǎng)液，加入使用無FBS 培養(yǎng)基稀釋的DiO標(biāo)記脂質(zhì)體（3 μmol/L DiO）1 mL，孵育箱避光培養(yǎng)2 h 后，移棄培養(yǎng)藥液，用冷的PBS 清洗兩次，加入胰酶200 μL，消化并收集細(xì)胞，使用超速離心機(jī)在1 800 r/min 轉(zhuǎn)速中離心5 min，然后用冷的PBS緩沖液600 μL 重懸，再次離心，離心完成后重懸，使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞攝取脂質(zhì)體情況。

2.8 抗腫瘤活性分析

采用CCK-8分析法考察藥物抑制細(xì)胞增殖的能力。將Colo205 和HT-29 細(xì)胞接種于96 孔板上，細(xì)胞密度分別為每孔6×103個和5×103個，使用含有10%FBS，1%雙抗的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，24 h 貼壁后，移棄舊培養(yǎng)基，加入使用培養(yǎng)基兩倍梯度稀釋后的藥液（游離奧沙利鉑，載藥脂質(zhì)體，奧沙利鉑濃度范圍為0.43~110 μmol/L；空白脂質(zhì)體，其最高磷脂濃度與載藥脂質(zhì)體的最高磷脂濃度相同），空白對照組加入新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h 后，加入CCK-8 10 μL，37 ℃避光孵育2 h后，通過酶標(biāo)儀檢測吸收度A，檢測波長為450 nm。細(xì)胞存活率（%）=Atest/Ablank×100。

2.9 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均檢測3 次以上，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表達(dá)。粒徑分布數(shù)據(jù)用Origin v9.0 軟件處理，穩(wěn)定性、細(xì)胞內(nèi)吞、抗腫瘤活性數(shù)據(jù)用GraphPad Prism v8.0 軟件處理。采用GraphPad Prism v8.0 軟件的非線性回歸方法分析藥物半數(shù)抑制濃度（IC50），采用GraphPad Prism v8.0 軟件的雙因素方差分析方法對熒光素CF 釋放數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用GraphPad Prism v8.0 軟件的單因素方差分析方法對穩(wěn)定性和細(xì)胞內(nèi)吞數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 脂質(zhì)體配方的設(shè)計與理化性質(zhì)表征

膽酸類分子與磷脂膜共存時，膽酸類分子濃度超過一定的閾值會破環(huán)磷脂膜結(jié)構(gòu)。研究表明，膽酸類分子與磷脂的物質(zhì)的量比例小于0.11的時候，膽酸類分子（如去氧膽酸和鵝去氧膽酸）會完全嵌入磷脂膜內(nèi)；當(dāng)其比例高于0.11時，膽酸類分子和磷脂會形成膠束［18］。因此，加入物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)為9% LCA 或者9% kLCA 以制備脂質(zhì)體LCA-Lip 或者kLCA-Lip。所制備脂質(zhì)體的磷脂主要為兩親性磷脂DPPC，加入5% DSPE-PEG2k 磷脂以提高脂質(zhì)體體內(nèi)循環(huán)半衰期［19］。所制備載藥脂質(zhì)體粒徑大小、多分散指數(shù)（polymer dispersity index，PDI）如圖1和表1所示。制備的脂質(zhì)體粒徑分散均一（PDI ＜0.11），粒徑大小約為100 nm。如表1 所示，LCA-Lip 和kLCA-Lip的電位大小與CLip 相似，均為-20 mV 左右，表明LCA 或者kLCA所帶的羧基并沒有影響脂質(zhì)體表面電荷大小，可能是聚合物DSPE-PEG2k的加入，屏蔽了其羧基所帶來的電荷干擾［20］。在奧沙利鉑包封率及載藥量方面，如表1 所示，LCA-Lip 和kLCA-Lip 與C-Lip 相比沒有顯著性差異（EE：LCA-LipvsC-Lip，P=0.89，kLCA-LipvsC-Lip，P= 0.71；LD：LCA-LipvsC-Lip，P= 0.34，kLCA-LipvsC-Lip，P= 0.94），而LCA-Lip 比kLCA-Lip 略高（EE：LCA-LipvskLCALip，P= 0.46；LD：LCA-LipvskLCA-Lip，P=0.50），P＜0.05 為具有顯著性差異，結(jié)果表明，LCA的3-α 位羥基的改變可能會影響其構(gòu)建的脂質(zhì)體對藥物的包載率，LCA 分子在磷脂膜中以3-α羥基之間的氫鍵相互作用形成二聚體，而kLCA的3-α 酮基脂溶性較高，兼容于磷脂膜可單獨存在，不一定以二聚體形式相交，這種差別可能造成所構(gòu)建磷脂膜性質(zhì)的不同從而導(dǎo)致脂質(zhì)體的藥物包封率和載藥量的差異。

Table 1 Characterization of liposomes in three formulations prepared by the thin-film hydration method(± s,n = 3)

Table 1 Characterization of liposomes in three formulations prepared by the thin-film hydration method(± s,n = 3)

PDI: Polymer dispersity index; LD: Loading efficiency; EE: Encapsulation efficiency

Group C-Lip LCA-Lip kLCA-Lip Size/nm 105±1 96±4 105±2 PDI 0.11±0.02 0.09±0.00 0.10±0.01 Zeta potential/mV-20.4±0.3-19.6±0.3-19.6±0.1 LD/%2.1±0.2 1.8±0.2 2.1±0.3 EE/%4.3±0.3 4.7±1.7 3.6±0.6

3.2 酶刺激響應(yīng)性分析

熒光素CF 釋放實驗可以用來推斷包裹親水性藥物脂質(zhì)體在刺激物作用下的釋放特性［9］。熒光素CF 包封在脂質(zhì)體水性內(nèi)腔時會發(fā)生高濃度熒光自淬滅現(xiàn)象（50 ~ 100 mmol/L），當(dāng)熒光素CF被釋放出來后，恢復(fù)去淬滅狀態(tài)，其熒光強(qiáng)度可以被酶標(biāo)儀檢測［21］。在哺乳動物中，sPLA2有11種被表征出來的亞型（IB，IIA，IIC，IID，IIE，IIF，III，V，X，XIIA，XIIB），不同亞型的分泌型磷脂酶存在于不同組織部位和細(xì)胞部位，在不同生理病理部位中扮演著不同的角色，有其獨特的酶功能［22］。蜂毒型（bee venom，Bv）sPLA2類似于人源性sPLA2-III，有相似結(jié)構(gòu)，且經(jīng)濟(jì)易得，常用來代替人源性sPLA2-III用于研究酶功能［9，23-24］，但Bv sPLA2和人源性sPLA2-III 具有不同的底物親和性，sPLA2-III 對PG 磷脂有強(qiáng)親和力而Bv sPLA2沒有這種選擇性［25］。Colo205細(xì)胞分泌的sPLA2含有多種磷脂酶亞型，主要的磷脂酶亞型為sPLA2-IIA［10，26］。sPLA2-III和sPLA2-IIA在不同的腫瘤細(xì)胞中超表達(dá)［4-7，23，27］，所以本研究選用Bv sPLA2和CCM sPLA2兩種不同來源的酶研究脂質(zhì)體的酶響應(yīng)釋放藥物特性。如圖2-A 所示，在Bv sPLA2作用的48 h 范圍內(nèi)，LCA-Lip 和kLCA-Lip熒光釋放率和C-Lip 相比，LCA 并沒有明顯提高脂質(zhì)體的響應(yīng)性，而kLCA 實際上降低了脂質(zhì)體的酶響應(yīng)性。如圖2-B 所示，在CCM sPLA2作用的31 h范圍內(nèi)，包含LCA 及kLCA的脂質(zhì)體的釋放效能遠(yuǎn)優(yōu)于普通脂質(zhì)體，特別在24 h 時LCA-Lip 和kLCALip的熒光素CF 釋放率為70%左右，而C-Lip 僅釋放了20%熒光素CF。此外從圖中可以看出kLCA的出現(xiàn)可以縮短酶作用延滯時間，孵育作用2 h 后明顯提高熒光素釋放率，而C-Lip 和LCA-Lip 需要較長的作用時間才能獲得較高的釋放率。以上實驗結(jié)果表明，對于不同亞型的sPLA2，LCA 和kLCA可以提高或降低脂質(zhì)體的響應(yīng)性。Bv sPLA2雖然類似于人源性sPLA2-III，但其底物選擇性并不盡相同，Bv sPLA2的響應(yīng)性熒光素CF 釋放分析結(jié)果可能不能代表人源性sPLA2-III的酶響應(yīng)性熒光素CF釋放特性，因此基于CCM sPLA2作用下的熒光素CF 釋放特性，表明LCA-Lip 和kLCA-Lip 酶響應(yīng)性優(yōu)于C-Lip。

3.3 體外血液穩(wěn)定性

納米藥物載體在體內(nèi)血液循環(huán)中應(yīng)避免早期藥物泄漏，使更多包載藥物到達(dá)腫瘤部位，減少藥物不良反應(yīng)和提高藥物療效。通過靜脈給藥的載藥脂質(zhì)體，血循環(huán)系統(tǒng)中的磷脂酶、高密度脂蛋白以及調(diào)理素會破壞脂質(zhì)體的基本結(jié)構(gòu)，造成脂質(zhì)體藥物泄漏或者被網(wǎng)狀巨噬系統(tǒng)清除［28］。本研究檢測脂質(zhì)體在0%，10%或50%FBS/HEPES 緩沖液條件下孵育的藥物泄漏率以初步評估其在體內(nèi)的血液循環(huán)穩(wěn)定性。實驗結(jié)果如圖3所示，加入10%或者50%FBS孵育24 h或者48 h，載藥脂質(zhì)體的藥物泄露率并沒有顯著性地提高，在24 h 或者48 h時均沒顯著性差異，結(jié)果表明，F(xiàn)BS 對C-Lip，LCALip以及kLCA-Lip均影響不大，不會造成載藥脂質(zhì)體的藥物快速泄漏，kLCA-Lip 在10% FBS/HEPES緩沖液條件下釋放率比在50%FBS/HEPES 緩沖液高，但沒有顯著性差異，可能是FBS 中的蛋白與kLCA-Lip 之間復(fù)雜的相互作用造成［29］。另外，如圖3 所示在相同孵育條件下，加入面兩親性分子LCA 或者kLCA 改造的脂質(zhì)體的藥物泄漏率與CLip 脂質(zhì)體相比，雖沒有顯著性差異，但藥物泄漏率均比C-Lip 脂質(zhì)體高，這可能是LCA 或者kLCA在一定程度上造成磷脂膜的缺陷從而加速脂質(zhì)體內(nèi)部藥物的釋放，與前人研究一致［30-32］。

Figure 2 Release rate of 6-CF from liposomal formulations C-Lip, LCA-Lip or kLCA-Lip induced by (A) sPLA2 from bee venom (Bv sPLA2) or (B)sPLA2 from Colo205 cells culture conditioned medium (CCM sPLA2) at 27 °C; Inset figures describe the release pattern of the mentioned systems in the absence of sPLA2 at 27°C(± s,n = 3)*P ＜0.05, **P ＜0.01, ***P ＜0.001, ****P ＜0.000 1 vs group of C-Lip+sPLA2 and determined by Two-Way ANOVA.ns:Not significant

Figure 3 Leakage of oxaliplatin (L-OHP) from C-Lip, LCA-Lip and kLCA-Lip which were incubated in HEPES buffer including 0%, 10%, or 50%FBS for 24 h(A)and 48 h(B)at 37°C(± s,n = 3)

3.4 體外細(xì)胞攝取實驗

為了考察LCA 或者kLCA 是否對脂質(zhì)體的細(xì)胞內(nèi)吞程度造成影響，本研究使用流式細(xì)胞儀分析Colo205細(xì)胞和HT-29細(xì)胞對DiO 標(biāo)記脂質(zhì)體的攝取量。如圖4 所示，對于HT-29 和Colo205 細(xì)胞，DiO 標(biāo)記的C-Lip，LCA-Lip 和kLCA-Lip 均可以被細(xì)胞內(nèi)吞，相比于不含兩親性分子的C-Lip，加入LCA 或者kLCA的脂質(zhì)體的內(nèi)吞程度顯著性降低，且面兩親性分子抑制Colo205 細(xì)胞內(nèi)吞脂質(zhì)體的程度比HT-29細(xì)胞的強(qiáng)。結(jié)果表明，相比于C-Lip，加入面兩親分子LCA 或者kLCA 改造的脂質(zhì)體會減弱脂質(zhì)體細(xì)胞內(nèi)吞程度，且對不同類型的細(xì)胞抑制內(nèi)吞的程度也不一樣。

Figure 4 Flow cytometric histograms illustrating fluorescence from (A) HT-29 cells or (B) Colo205 cells incubated with DiO-labelled liposomes;Quantitative analysis of cellular uptake efficiency of DiO-labelled liposomes by (C)HT-29 cells or(D)Colo205 cells.Cells were treated with different DiO-labelled liposomes(3 μmol/L DiO)for 2 h.The flow cytometric analysis was performed in triplicate(± s,n = 3)*P ＜0.05, **P ＜0.01, ***P ＜0.001, ****P ＜0.000 1;ns represents not significant and data were analyzed by One-Way ANOVA

3.5 體外抗腫瘤活性

Pourhassan 等［10］研 究 表 明，Colo205 細(xì) 胞 上清液中的sPLA2-IIA 酶質(zhì)量濃度為（185.43 ±92.46）μg/L，HT-29 細(xì)胞上清液中的sPLA2-IIA 酶濃度為（0.01 ± 0.01）μg/L，因此本研究選擇分泌sPLA2的Colo205 細(xì)胞和不分泌sPLA2的HT-29 細(xì)胞作為實驗對象，研究載藥面兩親性分子LCA 或者kLCA 改造脂質(zhì)體對高表達(dá)sPLA2腫瘤細(xì)胞的增殖抑制能力是否更強(qiáng)。采用CCK-8 法分析載藥脂質(zhì)體抑制癌細(xì)胞增殖能力。陽性對照組為游離奧沙利鉑和載藥C-Lip，實驗組為載藥LCA-Lip 和載藥kLCA-Lip。如圖5 所示，游離奧沙利鉑的IC50小于大部分載藥脂質(zhì)體配方，歸根于游離奧沙利鉑不用經(jīng)過藥物釋放這個過程，直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖。如圖5-A 所示，載藥LCA-Lip 和載藥kLCALip 抑制高表達(dá)sPLA2的Colo205 細(xì)胞增殖的能力強(qiáng)于載藥C-Lip，與游離奧沙利鉑的細(xì)胞毒性相似。如圖5-B 所示，載藥LCA-Lip 和載藥kLCA-Lip 抑制不表達(dá)sPLA2的HT-29 細(xì)胞增殖的能力與載藥CLip 相似，且其IC50明顯大于游離奧沙利鉑，是游離奧沙利鉑IC50的2.6 ~ 2.9 倍。實驗結(jié)果表明，載藥LCA-Lip 和載藥kLCA-Lip 相比于載藥C-Lip，其抑制分泌sPLA2的Colo205 細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)，抑制不分泌sPLA2的HT-29 細(xì)胞增殖能力相近，結(jié)合前面的熒光釋放及細(xì)胞內(nèi)吞實驗結(jié)果，LCA-Lip 和kLCA-Lip 相比于C-Lip，酶響應(yīng)度更高而細(xì)胞內(nèi)吞程度較低，這些結(jié)果表明，在Colo205 細(xì)胞分泌的sPLA2酶作用下，能比C-Lip 釋放更多的藥物，從而提高其細(xì)胞毒性。

為了確定在載藥脂質(zhì)體殺死癌細(xì)胞過程中脂質(zhì)體載體本身對癌細(xì)胞的殺傷性大小，本研究進(jìn)一步分析了空白脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性。如圖5-C 所示，奧沙利鉑C-Lip 抑制50% Colo205 細(xì)胞增殖的磷脂濃度為534 μmol/L，相對應(yīng)磷脂濃度的空白脂質(zhì)體的Colo205 細(xì)胞增殖率為58%（黑色箭頭指向處），說明奧沙利鉑C-Lip 可通過脂質(zhì)體載體本身的毒性來抑制Colo205 細(xì)胞增殖，結(jié)合內(nèi)吞實驗結(jié)果，空白C-Lip 抑制細(xì)胞存活可能是通過內(nèi)吞作用造成細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)引起細(xì)胞凋亡［33-34］，也可能是sPLA2的水解產(chǎn)物溶血磷脂和脂肪酸提高細(xì)胞滲透性導(dǎo)致細(xì)胞膜裂解或者引起細(xì)胞凋亡程序從而殺死細(xì)胞［35］。奧沙利鉑LCA-Lip和奧沙利鉑kLCA-Lip 抑制50% Colo205 細(xì)胞增殖的磷脂濃度分別為173 和257 μmol/L，相對應(yīng)磷脂濃度的空白LCA-Lip 和空白kLCA-Lip 對Colo205 細(xì)胞增殖率分別為88%和82%（黑色箭頭指向處），說明載體本身對細(xì)胞毒性較小，也進(jìn)一步表明載藥LCA-Lip和載藥kLCA-Lip 在有效藥物濃度下，其載體生物相容性高，毒性較小。如圖5-D 所示，奧沙利鉑CLip 抑制50% HT-29 細(xì)胞增殖的磷脂濃度為376 μmol/L，相對應(yīng)磷脂濃度的空白脂質(zhì)體的HT-29細(xì)胞增殖率為56%（黑色箭頭指向處），說明奧沙利鉑C-Lip可通過脂質(zhì)體載體本身的毒性殺傷HT-29細(xì)胞，這可能是細(xì)胞內(nèi)吞引起的應(yīng)激效應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。類似于空白C-Lip，空白LCA-Lip 和空白kLCA-Lip 同樣能抑制HT-29 細(xì)胞的存活，這可能是脂質(zhì)體被內(nèi)吞后，LCA 或kLCA 被釋放出來殺死細(xì)胞。Katona 等［36］發(fā)現(xiàn)LCA 可以激活結(jié)腸癌細(xì)胞（HT-29，HCT-116）的caspase-2 和caspase-8，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死?？瞻字|(zhì)體毒性實驗表明，空白LCA-Lip 和空白kLCA-Lip 在較高濃度下有一定毒性，需要提高脂質(zhì)體的藥脂比，在安全的濃度范圍內(nèi)使用新型配方。

Figure 5 Cytotoxicity on free L-OHP,L-OHP-loaded liposomes and blank liposomes against sPLA2-secreting Colo205 cells and non sPLA2-secreting HT-29 cells.Free L-OHP and L-OHP-loaded liposomes were added to (A) Colo205 cells or (B) HT-29 cells; Blank liposomes were added to (C)Colo205 cells or (D) HT-29 cells.The lipid concentration of the blank liposome corresponding to the lipid concentration of L-OHP loaded liposomes at the value of IC50 were indicated by the arrows.Cells proliferation was determined by CCK-8 assay and the results represent as the percentage of untreated control group(± s,n = 3)

4 結(jié) 論

本研究使用面兩親性分子LCA 或者kLCA 構(gòu)建sPLA2酶響應(yīng)性脂質(zhì)體（LCA-Lip，kLCA-Lip），實驗結(jié)果表明，相比于普通脂質(zhì)體C-Lip，LCA-Lip 和kLCA-Lip 脂質(zhì)體對腫瘤細(xì)胞來源的sPLA2具有更佳酶刺激響應(yīng)性，且在運載鉑類藥物奧沙利鉑時，對高表達(dá)sPLA2的腫瘤細(xì)胞有更強(qiáng)的增殖抑制能力。本研究發(fā)現(xiàn)面兩親性分子LCA 或者kLCA 改造的脂質(zhì)體具有一個新的功能特點，即對腫瘤部位超表達(dá)的sPLA2具有較高的響應(yīng)性，補(bǔ)充并拓展了此類脂質(zhì)體在抗腫瘤領(lǐng)域中的應(yīng)用。