朱致熹，張潔琳，陳依軍

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 211198）

β-內(nèi)酰胺類抗生素是臨床使用最為廣泛的抗生素［1］。由于抗生素的濫用，細(xì)菌耐藥性已經(jīng)嚴(yán)重影響β-內(nèi)酰胺類抗生素的臨床使用。特別是耐碳青霉烯類腸桿菌（carbapenem-resistant Enterobacte-riaceae，CRE），對(duì)用于臨床治療的大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素具有多重耐藥性，其引發(fā)的感染性疾病治療困難，并伴隨高病死率［2］。依據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心（CDC）數(shù)據(jù)報(bào)道，2017 年美國感染CRE的病例為13 100 例，造成1 100 例死亡，投入治療經(jīng)費(fèi)超過1.3億美金［3］。β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性（特別是革蘭氏陰性致病菌）已經(jīng)成為威脅人類健康及造成社會(huì)經(jīng)濟(jì)損失的全球性挑戰(zhàn)。

革蘭氏陰性菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性主要原因是細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶的表達(dá)。β-內(nèi)酰胺酶可以水解該類抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán)，造成抗生素效力下降甚至喪失，引發(fā)耐藥性。β-內(nèi)酰胺酶依據(jù)作用機(jī)制分為絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶（seineβ-lactamases，SBL）與金屬β-內(nèi)酰胺酶（metallo-β-lactamases，MBL）。SBL 依賴酶活性中心的絲氨酸殘基，親核進(jìn)攻β-內(nèi)酰胺類抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán)使其失去活性［4］。MBL 依賴其活性中心的Zn2+，通過活化1分子水分子產(chǎn)生的氫氧根離子，對(duì)β-內(nèi)酰胺環(huán)進(jìn)行破壞［5］。MBL 分為B1、B2 和B3 3 個(gè)亞類。B1和B3亞類活性中心有兩個(gè)Zn2+結(jié)合位點(diǎn)（Zn1和Zn2），B2 亞類只有1 個(gè)Zn2+結(jié)合位點(diǎn)［6］。臨床相關(guān)的MBL 主要屬于B1 亞類，如亞胺培南酶（imipenemase，IMP）［7］、維羅那亞胺培南酶（verona imipenemase，VIM）［8］和新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶（New Delhi metallo-β-lactamase，NDM）［9］。B1亞類MBL 廣泛存在于革蘭氏陰性條件致病菌中，包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌與鮑曼不動(dòng)桿菌等。

包括NDM-1在內(nèi)的MBL在多重耐藥菌中的表達(dá)，已成為威脅人類健康的重要問題。MBL 具有廣泛的底物譜，可水解包括青霉素類、頭孢菌素類以及被譽(yù)為抗生素“最后一道防線”的碳青霉烯類在內(nèi)的幾乎所有β-內(nèi)酰胺類抗生素［10］。編碼MBL的基因具有高傳播性，可通過質(zhì)粒以及其他可移動(dòng)遺傳元件（如轉(zhuǎn)座子）在菌株間快速傳播，使原本不具有抗性的菌株獲得抗性［11］。此外，MBL 易變異，活性更強(qiáng)、穩(wěn)定性更高的新突變體不斷出現(xiàn)。臨床急需針對(duì)表達(dá)MBL的多重耐藥菌的有效治療策略。

β-內(nèi)酰胺類抗生素與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)方制劑，是治療耐藥菌感染的有效方法。β-內(nèi)酰胺酶抑制劑抑制細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶活性，可使細(xì)菌重新對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素敏感［12］。代表性藥物有阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦和頭孢他啶/阿維巴坦等，但它們均用于治療表達(dá)SBL 耐藥菌引起的感染，對(duì)MBL 引發(fā)的耐藥性感染無效。相較于SBL 抑制劑的開發(fā)與臨床應(yīng)用，MBL 抑制劑的開發(fā)起步較晚。自1990 年起，文獻(xiàn)中報(bào)道的MBL 抑制劑已有上千種，但目前沒有成功批準(zhǔn)上市的化合物。

依據(jù)對(duì)MBL 抑制機(jī)制的不同，目前報(bào)道MBL抑制劑主要包括變構(gòu)抑制劑、共價(jià)抑制劑、金屬配體類抑制劑、螯合劑類抑制劑等［13］。其中螯合劑類MBL 抑制劑是最早進(jìn)行開發(fā)的一類MBL 抑制劑［14］，已有多個(gè)結(jié)構(gòu)類型的化合物，可對(duì)臨床常見的MBL 具有低至微摩爾濃度甚至納摩爾濃度級(jí)別的半數(shù)抑制濃度（IC50）或抑制常數(shù)（Ki）。部分化合物在體外與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中可以有效恢復(fù)碳青霉烯類抗生素對(duì)產(chǎn)MBL 耐藥菌的抗菌效力，展現(xiàn)出與抗生素協(xié)同抗菌作用。螯合劑類MBL抑制劑對(duì)MBL抑制機(jī)制主要有兩種：（1）通過螯合作用剝離或隔絕MBL 活性中心Zn2+，使MBL 失活或降解［15］；（2）進(jìn)入MBL 活性中心，形成穩(wěn)定的MBL∶Zn（II）∶抑制劑三元復(fù)合體，抑制MBL活性［16］。

螯合劑作為MBL抑制劑參與臨床MBL耐藥菌治療的選擇性與使用安全性一直受到關(guān)注。經(jīng)典螯合劑乙二胺四乙酸（EDTA）雖然為強(qiáng)效的金屬螯合劑，但其對(duì)金屬離子的螯合不具備選擇性，進(jìn)入體內(nèi)會(huì)使大量生理金屬依賴的酶類（如Ca2+、Mg2+依賴的酶）失活，引發(fā)嚴(yán)重不良反應(yīng)［17］。近年來有多篇文章報(bào)道了一系列包括aspergillomarasmine A（AMA）和吡啶-2，6-二羧酸（DPA）在內(nèi)的新型螯合劑類MBL 抑制劑。這些化合物除具備對(duì)MBL的抑制活性，還具備對(duì)MBL的選擇性，安全性好。部分化合物表現(xiàn)出良好的藥物開發(fā)潛力，其構(gòu)效關(guān)系與機(jī)制研究為同類藥物設(shè)計(jì)與開發(fā)提供了重要信息。

本文就螯合劑類MBL 抑制劑的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，討論其化學(xué)結(jié)構(gòu)、抑制活性、與抗生素的協(xié)同作用、選擇性和作用機(jī)制（本文討論的化合物結(jié)構(gòu)以及活性相關(guān)信息見表1），為后續(xù)開發(fā)高選擇性、高活性和低毒性的MBL抑制劑提供參考。

表1 螯合劑類MBL抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)與活性相關(guān)信息

1 EDTA及其相關(guān)化合物

EDTA（1，圖1）是使用最為廣泛的合成類強(qiáng)效金屬螯合劑。EDTA 具備螯合Zn2+能力，但因?qū)ζ渌斫饘倜傅倪x擇性差、毒性強(qiáng)，不能作為MBL抑制劑臨床應(yīng)用。EDTA的鈣復(fù)合物（Ca-EDTA）是唯一獲得臨床批準(zhǔn)的EDTA 類似物，主要用于治療鉛中毒。研究顯示Ca-EDTA 可恢復(fù)亞胺培南對(duì)產(chǎn)IMP-1、IMP-2、IMP-7、IMP-10 及VIM-2 的銅綠假單胞菌的抗菌活性，對(duì)IMP-1 的IC50為55 μmol/L［18］。此外Ca-EDTA 還可提高亞胺培南和美羅培南對(duì)表達(dá)NDM-1 的肺炎克雷伯菌的抗菌活性（MIC 下降至小于2和小于4 μg/mL）［19］。

乙二胺-N，N′-二丁二酸（ethylenediamine-N，N′-disuccinic acid，EDDS，2，圖1）是一種細(xì)菌來源的天然金屬螯合劑，具有與EDTA 相似的螯合性質(zhì)，可生物降解［20］。Proschak 等［21］報(bào)道了EDDS 對(duì)B1 亞類MBL 具有抑制作用，其對(duì)NDM-1 抑制活性最強(qiáng)（IC50為0.18 μmol/L），對(duì)VIM-1 和SIM-1 較弱（IC50均為8 μmol/L），對(duì)IMP-1 無效。EDDS 與亞胺培南協(xié)同，可恢復(fù)多種攜帶MBL的臨床分離革蘭氏陰性菌菌株對(duì)亞胺培南的敏感性。近期Tehrani等［22］報(bào)道酶法合成多種EDDS衍生物，體外實(shí)驗(yàn)顯示6 種衍生物具有NDM-1 抑制活性（IC50均為微摩爾級(jí)），其中一種甲基取代衍生物表現(xiàn)出較高的美羅培南協(xié)同抗菌作用。

圖1 EDTA及其相關(guān)化合物、AMA及其衍生物化學(xué)結(jié)構(gòu)(A)；AMA螯合Zn2+示意圖(B)[27]

2 AMA及其衍生物

AMA（3，圖1）及相關(guān)化合物是近幾年受到關(guān)注的新型螯合劑類MBL 抑制劑。作為一種真菌天然產(chǎn)物，1965 年AMA 首次從米黃曲霉菌中分離與鑒定，其具有使植物葉片枯萎、斑變等毒素活性［23］。在20 世紀(jì)80 年代，AMA 被報(bào)道為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制劑［24］。2014 年，King等［25］在Nature上報(bào)道，AMA 被重新鑒定為一種選擇性金屬β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，其對(duì)NDM-1 和VIM-2 具有低至微摩級(jí)的抑制活性（對(duì)NDM-1 的IC50為4 μmol/L，對(duì)VIM-2 的IC50為9.6 μmol/L）。通過對(duì)229 種臨床分離的MBL 陽性致病菌的抑菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)AMA 可有效恢復(fù)美羅培南對(duì)攜帶NDM-1 和VIM-2 的多種革蘭氏陰性菌（腸桿菌、不動(dòng)桿菌、假單胞菌）的抗菌活性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，在注射致死劑量的NDM-1陽性肺炎克雷伯菌的小鼠模型中，單次聯(lián)合注射美羅培南（10 mg/kg）與AMA（30 mg/kg）5 d 存活率達(dá)95%，而單獨(dú)給藥美羅培南或AMA均對(duì)致死性感染無效。

在后續(xù)的一項(xiàng)研究中，King 同一課題組繼續(xù)考察AMA 與6 種β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用對(duì)19 種B1、B2 和B3 亞類MBL的抑制活性［26］。相較于其他β-內(nèi)酰胺類抗生素，碳青霉烯類抗生素尤其是美培羅南、多尼培南和亞胺培南與AMA的協(xié)同抗菌活性最佳。AMA 對(duì)B1 亞類的NDM-1 和VIM-2表現(xiàn)出最強(qiáng)抑制活性，對(duì)NDM-4、IMP-1、IMP-7 等B1 亞類MBL 具有中等抑制活性，對(duì)B2 亞類CphA和B3 亞類AIM-1 的抑制活性低，對(duì)所有SBL 沒有抑制活性。值得注意的是，AMA活性與MBL的Zn2位點(diǎn)的Zn2+親和力表現(xiàn)出相關(guān)性，對(duì)親和力低的MBL抑制活性更高。

對(duì)AMA 作用機(jī)制的研究表明，AMA 通過選擇性螯合Zn2+，導(dǎo)致MBL 活性中心低親和力Zn2位點(diǎn)Zn2+的丟失，抑制MBL 活性（圖1-B）。電感耦合質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AMA 從1 分子NDM-1 中僅移除1 個(gè)Zn2+。Bergstrom 等［27］利用平衡透析和電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP-AES），發(fā)現(xiàn)AMA可以在體外有效移除NDM-1、VIM-2 或IMP-7 活性中心的Zn2+，在微摩爾濃度條件下，2當(dāng)量的AMA可以移除1 當(dāng)量的Zn2+。近期研究發(fā)現(xiàn)，包括NDM-1 在內(nèi)的許多MBL 中Zn2位點(diǎn)較Zn1位點(diǎn)對(duì)Zn2+親和力更弱，因此研究者推測(cè)AMA可能主要通過移除Zn2位點(diǎn)的Zn2+發(fā)揮抑制作用。此外，順磁核磁分析顯示，NDM-1 活性中心并沒有形成AMA∶Zn（II）∶NDM-1三元復(fù)合體，表明AMA 可能并不直接進(jìn)入活性中心。2021 年的最新研究進(jìn)一步支持了這一推測(cè)，AMA不結(jié)合于NDM-1的活性中心，而是通過螯合游離的Zn2+，增強(qiáng)了動(dòng)態(tài)發(fā)生的Zn2位點(diǎn)Zn2+的解離，導(dǎo)致Zn2+丟失并誘發(fā)蛋白質(zhì)降解，從而導(dǎo)致NDM-1失活［15］。AMA 具有金屬離子選擇性，對(duì)Zn2+、Ni2+和Co2+具有螯合作用，而對(duì)其他生理重要的Mg2+、Ca2+等作用微弱，這可能是AMA 具有較低動(dòng)物毒性（小鼠靜脈注射給藥的LD50為159.8 mg/kg，EDTA的LD50為28.5 mg/kg）的原因之一［15，25］。

自2016 年起，一系列文章報(bào)道了AMA 及結(jié)構(gòu)類似物的合成方法。AMA 結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，具有3 個(gè)手性中心及多個(gè)游離的氨基和羧基基團(tuán)，化學(xué)全合成較為困難。至今共有6種主要的AMA 合成策略，包括4種全化學(xué)合成、1種化學(xué)酶偶聯(lián)合成及1 種全生物合成方法［28-33］。在早期合成研究中，Liao 等［28］和Koteva 等［29］全化學(xué)合成4 種AMA的立體異構(gòu)體，驗(yàn)證了真菌合成的天然AMA 為（S，S，S）-AMA。2018 年，本課題組成員參與研究并報(bào)道AMA 及其衍生物的化學(xué)酶偶聯(lián)合成方法，通過引入一種高立體、區(qū)域與化學(xué)選擇性的生物催化劑EDDS 裂解酶，縮短合成路線，獲得了AMA 及一系列相關(guān)化合物［32］。2021 年，Guo 等［33］首次從米曲霉菌中鑒定并表征了AMA合成酶。該酶催化以L-天冬氨酸和O-磷酸絲氨酸（或O-乙酰絲氨酸）為底物連續(xù)兩步反應(yīng)合成AMA，為AMA 及其衍生物提供了一種酶催化合成方法。

在對(duì)約30 種AMA 衍生物的MBL 抑制活性考察中，部分衍生物（toxin A，4；AMB，5）（圖1）具有NDM-1 的抑制活性，抑制效力達(dá)AMA 同一數(shù)量級(jí)［22，34］。值得注意的是，AMA 結(jié)構(gòu)中的羧基對(duì)其發(fā)揮抑制作用非常重要，在對(duì)羧基進(jìn)行修飾后觀察到其對(duì)NDM-1 活性喪失［31，34］。AMA的3 個(gè)手性中心的絕對(duì)構(gòu)型對(duì)NDM-1 的抑制活性影響較小，（S，S，S）-AMA的IC50在所有衍 生物中最低［34］。AMA 衍生物的合成與活性考察促進(jìn)該類化合物對(duì)MBL 抑制機(jī)制的研究，將為開發(fā)新的選擇性MBL抑制劑提供重要參考。

3 NOTA及相關(guān)化合物

1，4，7 -三氮雜環(huán)壬烷-1，4，7-三乙酸（NOTA，6，圖2-A）與1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸（DOTA，7，圖2-A）是胺類金屬螯合劑。2015 年，Somboro 等［35］首次報(bào)道NOTA 和DOTA 可協(xié)同美羅培南或亞胺培南，恢復(fù)其對(duì)表達(dá)NDM、VIM 或IMP的耐碳青霉烯類抗生素的耐藥菌的活性。其中，NOTA 效果略優(yōu)于DOTA，4 μg/mL 質(zhì)量濃度下的NOTA 可使美羅培南對(duì)多重耐藥菌的MIC 降至0.06 μg/mL。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，NOTA和DOTA在使用劑量下不會(huì)誘發(fā)溶血。

Zhang 等［36］報(bào)道一種NOTA的二硫代氨基甲酸酯衍生物（化合物8，圖2-A）為MBL 抑制劑。體外實(shí)驗(yàn)顯示，化合物8可以恢復(fù)美羅培南對(duì)多種攜帶blaNDM-1基因的臨床分離菌株的活性，但活性低于NOTA。對(duì)NOTA 及化合物8的抑制機(jī)制考察顯示，向攜帶NDM-1 的大腸埃希菌同時(shí)加入美羅培南與化合物8 可引起細(xì)菌生長率大幅下降（由100%下降至2.55%），體系中補(bǔ)加ZnCl2后耐藥菌生長率由2.55%恢復(fù)至90.30%。相應(yīng)的NOTA實(shí)驗(yàn)中也表現(xiàn)出相同現(xiàn)象，顯示出NOTA 與化合物8對(duì)NDM-1 的抑制活性可以通過補(bǔ)加Zn2+得到逆轉(zhuǎn)，作用機(jī)制可能與基于螯合作用的Zn2+剝離有關(guān)。動(dòng)力學(xué)研究顯示NOTA 和化合物8 對(duì)NDM-1的抑制符合非競爭性抑制的特征。分子對(duì)接結(jié)果顯示NOTA 和化合物8 均可能不結(jié)合于NDM-1 的活性中心，因此作者推測(cè)該類化合物可能通過螯合從活性中心動(dòng)態(tài)解離的Zn2+發(fā)揮抑制NDM-1活性。

Li 等［37］利用NOTA 對(duì)NDM-1 抑制活性，開發(fā)了一種復(fù)合納米材料IPM@AgNPs-PEG-NOTA（圖2-B）。該納米材料將SH-PEG2000-NOTA 包裹于載有亞胺培南的銀納米顆粒外層，利用NOTA 逆轉(zhuǎn)細(xì)菌對(duì)亞胺培南的耐藥性，發(fā)揮銀納米顆粒與亞胺培南的雙重抑菌作用。該納米復(fù)合材料在體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出有效殺滅產(chǎn)NDM-1的耐碳青霉烯類抗生素的鮑曼不動(dòng)桿菌的活性，相較于單獨(dú)使用亞胺培南或銀鈉米顆粒的抗菌活性均得到增強(qiáng)。IPM@AgNPs-PEG-NOTA具有良好的生物相容性，毒性低，為多功能抗耐藥菌藥物的開發(fā)提供了新思路。

圖2 NOTA相關(guān)MBL抑制劑化學(xué)結(jié)構(gòu)(A)；IPM@AgNPs-PEG-NOTA復(fù)合納米材料制備示意圖（B）[37]

4 吡啶羧酸類與吡啶甲基胺類化合物

2-吡啶甲酸（2-PDCA，9，圖3）是一種人體產(chǎn)生的天然Zn2+螯合劑，可幫助鋅的吸收［38］。2007 年，Horsfall 等［39］首次報(bào)道2-PDCA 和吡啶-2，4-二羧酸（2，4-PDCA，10，圖3）是B2 亞類CphA的競爭性抑制劑。X 射線與晶體分析結(jié)果顯示，2，4-PDCA 通過在活性中心形成CphA∶Zn（II）∶2，4-PDCA 復(fù)合體的方式螯合Zn2+，使酶失活。值得一提的是，2-PDCA 對(duì)B1 亞類NDM-1、VIM-2、IMP-1 和B3 亞類L1沒有抑制活性（IC50＞100 μmol/L）。

2017 年，Chen 等［16］報(bào)道了吡啶-2，6-二羧酸（DPA，11，圖3）是一種具有NDM-1 及其他相關(guān)MBL（VIM 和IMP）抑制潛力的化學(xué)結(jié)構(gòu)。該課題組通過使用基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)（fragment-based drug discovery，F(xiàn)BDD）策略，設(shè)計(jì)、合成并評(píng)估了3組共47 個(gè)DPA 衍生物，發(fā)現(xiàn)衍生物（12）是一種有潛力的MBL抑制劑。衍生物12對(duì)NDM-1的IC50低至80 nmol/L（DPA的IC50為0.41 μmol/L），并對(duì)B1亞類的VIM-2 和IMP-1 同樣有較強(qiáng)的抑制活性（對(duì)VIM-2 的IC50為0.21 μmol/L，對(duì)IMP的IC50為0.24 μmol/L）。體外實(shí)驗(yàn)中，衍生物12（100 mg/L）可使亞胺培南對(duì)臨床分離的攜帶blaNDM-1大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的MIC 由4 ~ 16 mg/L 降低至0.5 ~1 mg/L，與亞胺培南具有協(xié)同抗菌作用。衍生物12（10 μmol/L 以下）對(duì)Zn2+依賴金屬酶HDAC-1、HDAC-6 和hCAII 沒有明顯抑制活性，表現(xiàn)出對(duì)B1亞類MBL的高選擇性，并且對(duì)人源HEK293 細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性［16］。機(jī)制研究結(jié)果顯示，DPA 類似于EDTA，通過無選擇性的螯合NDM-1活性中心的兩個(gè)Zn2+發(fā)揮抑制作用，但衍生物12 則通過結(jié)合于NDM-1 活性中心，形成穩(wěn)定的NDM-1∶Zn（II）∶衍生物12三元復(fù)合物發(fā)揮抑制作用。隨后一項(xiàng)研究表明，衍生物12 在NDM-1 活性中心的結(jié)合主要源于苯胺的氨基與NDM-1 的211 位賴氨酸殘基的相互作用［40］。

Hinchliffe等［41］報(bào)道將DPA的一個(gè)羧基置換為磷酰甲基基團(tuán)，合成了一系列DPA 衍生物并考察對(duì)MBL 抑制活性?；衔?3（圖3）及另外兩種衍生物對(duì)NDM-1、VIM-2、IMP-1 和L1 具有競爭性抑制活性（IC50為0.3 ~ 7.2 μmol/L，Ki為0.03 ~ 1.5 μmol/L），在對(duì)真核細(xì)胞不產(chǎn)生毒性的濃度下，可有效恢復(fù)美羅培南對(duì)臨床分離的攜帶VIM-2、NDM-1 的肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌等耐藥菌的活性。共晶結(jié)構(gòu)顯示化合物13 與IMP-1及L1的結(jié)合方式不同（圖4-A 和圖4-B）。在IMP-1 活性中心中，化合物13 的吡啶N 原子、羧基與Zn2位點(diǎn)Zn2+形成配位鍵，而磷酸基團(tuán)與橋聯(lián)的水分子相互作用，形成穩(wěn)定的三元復(fù)合體。但在L1 的活性中心中，化合物13 的磷酸基團(tuán)置換Zn2位點(diǎn)的Zn2+及氫氧根離子，形成單Zn2+形式酶以發(fā)揮對(duì)L1的抑制作用。

圖3 吡啶羧酸類與吡啶甲基胺類MBL抑制劑

圖4 化合物13與IMP-1共晶結(jié)構(gòu)（PDB號(hào)：5HH4）（A）[41]；化合物13與L1共晶結(jié)構(gòu)（PDB號(hào)：5HH5）（B）[41]

依據(jù)生物電子等排體置換思路，Chen 等［42］將DPA 其中一個(gè)羧基置換為其他電子等排體，合成一系列DPA 衍生物。結(jié)合抑制活性與平衡透析實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DPA 中羧基替代為其他電子等排體時(shí)，會(huì)導(dǎo)致化合物對(duì)NDM-1抑制機(jī)制發(fā)生改變。羧基替換為磷酸基團(tuán)（14）時(shí)，其抑制機(jī)制仍為Zn2+的剝離，對(duì)NDM-1 的IC50下降至0.31 μmol/L。但當(dāng)羧基替換為四氮唑（15）時(shí)，抑制機(jī)制改變?yōu)槿獜?fù)合體的形成，對(duì)NDM-1 的IC50提高至7 μmol/L。該研究顯示電子等排體置換策略是改變化合物對(duì)MBL 作用機(jī)制的有效方案，可為后續(xù)MBL 抑制劑的開發(fā)提供參考。

6，6′-［亞乙基雙（亞胺亞甲基）］雙（2-吡啶甲酸）（H2dedpa，16，圖3）同屬于吡啶羧酸的衍生物，可用作68Ga正電子發(fā)射斷層顯像劑的無環(huán)螯合劑，用于疾病診療［43］。Shi 等［44-45］鑒定H2dedpa 為強(qiáng)效的MBL 抑制劑（對(duì)NDM-1 的IC50為0.17 μmol/L），并以該結(jié)構(gòu)為母體合成一系列衍生物，并從中找尋到活性更強(qiáng)的化合物17（對(duì)NDM-1 的IC50為0.04 μmol/L）和 化 合 物18（對(duì)NDM-1 的IC50為0.11 μmol/L）。此類化合物可在體外恢復(fù)美羅培南對(duì)臨床表達(dá)NDM、IMP 菌株的活性，對(duì)NDM-1的IC50均小于1 μmol/L。為研究此類化合物抑制MBL機(jī)制，作者進(jìn)行了Zn2+敏感性實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)組耐藥菌培養(yǎng)中同時(shí)添加美羅培南與化合物18，觀察到細(xì)菌生長率大幅下降（由100% 下降至2.69%）。對(duì)實(shí)驗(yàn)組額外加入與化合物18 等摩爾量的ZnCl2，耐藥菌生長率回復(fù)到正常生長的對(duì)照組相似水平。結(jié)果顯示此類化合物對(duì)NDM-1的抑制活性受到Zn2+存在而發(fā)生逆轉(zhuǎn)，以此判斷此類化合物通過螯合Zn2+發(fā)揮抑制作用。分子對(duì)接結(jié)果顯示此類化合物可結(jié)合于NDM-1活性中心。

Chen 等［46］報(bào)道6-｛［（6-羧基吡啶-2-基）甲基氨基］甲基｝吡啶-2-羧酸（H2dpa，19）衍生物為強(qiáng)效MBL 抑制劑，并通過Zn2+螯合機(jī)制對(duì)MBL 產(chǎn)生抑制作用。其中化合物20 對(duì)B1 亞類的NDM-1 的Ki為1.59 μmol/L，對(duì)IMP-1 的Ki為1.57 μmol/L，對(duì)VIM-2 的Ki為6.16 μmol/L。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均顯示20可恢復(fù)美羅培南對(duì)攜帶NDM-1肺炎克雷伯菌的活性，且在有效濃度內(nèi)未顯示出溶血活性與對(duì)胃上皮細(xì)胞（GES）的細(xì)胞毒性。

吡啶甲基胺類化合物2-吡啶甲胺（MPA，21，圖3）、二-（2-吡啶甲基）胺（22，圖3）、三-（2-吡啶甲基）胺（TPA，23，圖3）和N，N，N′，N′-四-（2-吡啶甲基）乙二胺（TPEN，24，圖3）被鑒定為MBL 抑制劑，可在體外恢復(fù)攜帶NDM、VIM的耐碳青霉烯類抗生素腸桿菌對(duì)美羅培南敏感性［47］。此類化合物抑制機(jī)制為Zn2+螯合，并發(fā)現(xiàn)此類化合物結(jié)構(gòu)中吡啶基團(tuán)數(shù)目越多，其螯合Zn2+能力越強(qiáng)，對(duì)MBL 抑制活性越強(qiáng)［48］。

TPA 在后續(xù)研究中，用作螯合劑組件參與合成一系列全新的選擇性Zn2+螯合劑。該螯合劑設(shè)計(jì)基于“Chelator+Linker+Modulator”思路，將TPA與一短肽片段偶聯(lián)，調(diào)節(jié)親脂性以降低毒性［49］。研究人員測(cè)定各化合物與美羅培南的協(xié)同抗菌活性，并考察各化合物對(duì)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性。在50 μmol/L濃度下，衍生物25 與TPA 均使美羅培南對(duì)攜帶NDM-1 肺炎克雷伯菌MIC 降至0.125 μg/mL。衍生物25 的細(xì)胞毒性更低，其對(duì)HepG2 細(xì)胞的IC50＞100 μmol/L（TPA的IC50為9.8 μmol/L），同時(shí)在128 mg/kg 劑量下對(duì)小鼠單周給藥兩次未見不良反應(yīng)。該設(shè)計(jì)策略保留TPA 對(duì)MBL 抑制活性，并降低了毒性。

5 其 他

除上述幾類化合物，還有一些難以歸類的螯合劑類金屬M(fèi)BL 抑制劑，如二硫代氨基甲酸酯類化合物［50］、吡唑類化合物［51］、支化聚乙烯亞胺（BPEI）及其衍生物［52］、喹啉類化合物［53］、螺二氫吲哚-噻二唑類似物［54］等。

Ishii 等［55］報(bào)道ME1071（馬來酸衍生物，26，圖5）可以體外增強(qiáng)碳青霉烯類抗生素對(duì)產(chǎn)MBL銅綠假單胞菌的活性。體外實(shí)驗(yàn)測(cè)得ME1071對(duì)IMP-1的Ki0.4 μmol/L，對(duì)VIM-2 的Ki120 μmol/L。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在注射攜帶MBL的銅綠假單胞菌引起的肺炎模型小鼠中，ME1071 可協(xié)同比阿培南有效治療肺炎，且未產(chǎn)生不良反應(yīng)［56］。

Gavara 等［57-59］報(bào)道通過修飾1，2，4-三唑-3-硫酮的4 位及5 位位點(diǎn)，合成了一系列衍生物。此類化合物在體外明顯增強(qiáng)美羅培南對(duì)產(chǎn)VIM的臨床分離肺炎克雷伯菌的活性?；衔?7（圖5）是VIM-2的競爭性抑制劑，Ki為0.83 μmol/L?；衔?7 與VIM-2 的共晶結(jié)構(gòu)（圖5-B）顯示，該化合物可同時(shí)螯合VIM-2 活性中心兩個(gè)Zn2+。其中化合物27 的2 位N 原子螯合VIM-2 的Zn1位點(diǎn)Zn2+，硫酮螯合Zn2位點(diǎn)Zn2+，4 位和5 位的修飾與活性中心其他氨基酸發(fā)生相互作用穩(wěn)定該三元復(fù)合體結(jié)構(gòu)。

基于芳基磺酰腙化合物與頭孢菌素的相似性，Shaaban 等［60］將其與吡唑類化合物偶聯(lián)，理性設(shè)計(jì)NDM-1 的抑制劑，以期獲得能穩(wěn)定結(jié)合于NDM-1的活性口袋、螯合Zn2+以實(shí)現(xiàn)抑制作用的化合物。獲得的衍生物在體外實(shí)驗(yàn)中均顯示出優(yōu)秀的對(duì)NDM-1、IMP-1、AIM-1 的抑制活性。衍生物28（圖5）活性最強(qiáng)，可使頭孢氨芐和美羅培南的活性提高約99.8%。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)感染肺炎克雷伯菌的模型小鼠進(jìn)行給藥實(shí)驗(yàn)，相比于只給藥美羅培蘭的小鼠在5 d 內(nèi)全部死亡，治療組（美羅培蘭+ 衍生物28）小鼠全部存活，并且6 d 內(nèi)檢測(cè)到體內(nèi)所有細(xì)菌清除。衍生物28 在350 mg/kg 給藥劑量下對(duì)小鼠無不良反應(yīng)。分子對(duì)接結(jié)果與預(yù)期一致，衍生物28 結(jié)合于NDM-1 和IMP-1 活性中心，通過磺基螯合Zn2+發(fā)揮抑制活性。

圖5 其他螯合劑類MBL抑制劑（A）；化合物27與VIM-2共晶結(jié)構(gòu)（PDB號(hào)：7OVF）（B）[57]

6 總結(jié)與展望

本文綜述了螯合劑類MBL 抑制劑的研究進(jìn)展，介紹了幾類重要化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、抑制活性、與抗生素的協(xié)同作用、選擇性和作用機(jī)制。

螯合劑類MBL 抑制劑主要對(duì)B1 亞類的MBL（NDM、VIM、IMP）表現(xiàn)出有效的體外抑制活性（IC50或Ki達(dá)微摩爾級(jí)）。其中吡啶羧酸類化合物的IC50或Ki更低，部分化合物達(dá)到納摩爾級(jí)別。抑制劑可在體外協(xié)同碳青霉烯類抗生素，恢復(fù)攜帶MBL的耐藥菌對(duì)碳青霉烯類抗生素的敏感性。部分化合物在體內(nèi)活性實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出與碳青霉烯類抗生素的協(xié)同作用，但大部分化合物缺乏對(duì)體內(nèi)活性的考察。

氨基多羧酸類抑制劑的作用機(jī)制主要為Zn2+剝離。相比于廣譜螯合劑EDTA，近期得到關(guān)注的AMA表現(xiàn)出更高的動(dòng)物耐受性（小鼠靜脈注射給藥的LD50為159.8 mg/kg）。原因可能為AMA 是一種選擇性金屬螯合劑，對(duì)Zn2+螯合能力強(qiáng)于其他生理金屬離子如Mg2+、Ca2+、Mn2+等。由于NDM-1和VIM-2 等MBL 對(duì)Zn2+親和力比許多生理Zn2+依賴酶弱，AMA 對(duì)Zn2+的納摩爾級(jí)親和力（Kd為0.2 nmol/L）能夠移除這些MBL的Zn2+，減少對(duì)高親和力Zn2+依賴酶的脫靶效應(yīng)。AMA的作用機(jī)制為同類抑制劑的開發(fā)及結(jié)構(gòu)改造提供了一定參考。吡啶羧酸類及吡啶甲基胺類抑制劑的作用機(jī)制包括Zn2+剝離與形成穩(wěn)定MBL∶Zn（II）∶抑制劑三元復(fù)合體。對(duì)DPA 衍生物的研究顯示結(jié)構(gòu)修飾可以改變作用機(jī)制，并且同一抑制劑可能對(duì)不同MBL 具備不同的抑制機(jī)制（如化合物13）。代表性衍生物12經(jīng)改造由Zn2+剝離機(jī)制變?yōu)樾纬扇獜?fù)合體機(jī)制，抑制活性提高，同時(shí)在有效濃度下對(duì)幾種生理金屬酶無抑制活性，顯示了靶向活性中心的設(shè)計(jì)改造可能是一種有效策略。目前許多報(bào)道集中于發(fā)現(xiàn)高活性抑制劑，缺乏抑制劑對(duì)生理金屬酶選擇性、作用機(jī)制、構(gòu)效關(guān)系、體內(nèi)活性與毒性等研究。后續(xù)對(duì)這些方面的系統(tǒng)考察，將為螯合劑類MBL 抑制劑的開發(fā)提供重要參考。

對(duì)現(xiàn)有螯合劑進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，提高螯合劑對(duì)Zn2+的選擇性，降低毒性可能是此類藥物未來的發(fā)展方向。已有研究人員進(jìn)行相關(guān)嘗試，通過對(duì)化合物22 偶聯(lián)靶向MBL的細(xì)菌二肽D-Ala-D-Ala，降低細(xì)胞毒性，提高對(duì)MBL的抑制活性［61］。未來研究中也可能通過制劑手段提高螯合劑類MBL 抑制劑的靶向性與成藥性，前文報(bào)道的NOTA的復(fù)合納米材料不僅具有良好生物相容性，還提高了NOTA的抑菌活性。隨著更多螯合劑類MBL 抑制劑的鑒定與開發(fā)、各類化合物MBL 抑制機(jī)制的不斷解析、理性設(shè)計(jì)與制劑方法的不斷嘗試，相信不久后高選擇性、高活性和低毒性的螯合劑類MBL 抑制劑將與β-內(nèi)酰胺抗生素聯(lián)用，解決臨床表達(dá)MBL的耐藥菌感染問題。

（續(xù)表）