張 煜，嚴 方，肖易倍

（中國藥科大學藥學院，南京 211198）

腫瘤可以利用免疫逃逸機制來繞過免疫監(jiān)視，包括誘導免疫抑制微環(huán)境和抑制腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中效應T 細胞的功能［1］。免疫檢查點是預防自身免疫、保護宿主免受組織損傷和調(diào)節(jié)自身耐受的關鍵受體。在TME中，腫瘤細胞通過抑制性免疫檢查點（ICIs），下調(diào)免疫細胞的活性，從而避免被殺傷的命運，實現(xiàn)免疫逃逸。對應的抗體可以逆轉這一過程，恢復免疫細胞的殺傷力，從而殺傷甚至清除腫瘤細胞。

隨著細胞毒性T 淋巴細胞相關抗原-4（CTLA-4）的阻斷抗體Ipilimumab 和程序性死亡蛋白-1（PD-1）的兩種阻斷抗體Pembrolizumab和Nivolumab在臨床治療中展示出顯著的療效［2］，免疫治療成為腫瘤治療的重要方式。然而，實體腫瘤患者對現(xiàn)有檢查點抑制劑的總體應答率一般低于30%［3］，亟待尋找新的治療靶點。VISTA 是新型的檢查點分子，通過抑制T細胞活性，阻止有效的抗腫瘤反應。近年來有研究認為，VISTA是機體對免疫治療產(chǎn)生耐藥性的原因之一。Kakavand等［4］發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)黑色素瘤患者在單獨使用抗PD-1 抗體或聯(lián)合使用Ipilimumab 治療后，VISTA 陽性淋巴細胞的比例顯著增加。前列腺癌患者用Ipilimumab 后也出現(xiàn)該現(xiàn)象，將VISTA 與經(jīng)Ipilimumab 治療的前列腺癌患者的外周血單個核細胞（PBMCs）共培養(yǎng)會導致干擾素γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子（TNF-α）產(chǎn)生減少，加入其抗體后IFN-γ 分泌恢復［5］。因此VISTA 可能成為克服當前免疫檢查點療法耐藥性的新靶點。本文綜述了VISTA的結構、配體、生物學功能，總結了在研VISTA 抑制劑并介紹了抑制劑篩選方法。

1 VISTA結構與配體

1.1 VISTA發(fā)現(xiàn)

VISTA，又 稱PD-1H、B7-H5、Dies1、Gi24、DD1α 和C10orf54，是由人的VSIR 基因編碼（小鼠由Vsir基因編碼）的Ⅰ型跨膜蛋白。2011年Noelle等［6］首次報道鼠的VISTA 蛋白能抑制其T 細胞的激活。2014 年該團隊證明人的VISTA 同樣對T 細胞具有負性調(diào)節(jié)作用，是新型的ICIs［7］。在正常生理條件下，VISTA 對維持T 細胞耐受至關重要。無外來抗原刺激時，表達在初始CD4+T細胞和γδT細胞上的VISTA 能抑制自身反應性，阻止T 細胞的激活［8］。

體外實驗發(fā)現(xiàn)，在給予抗CD3 抗體刺激情況下，人源和鼠源的VISTA-免疫球蛋白融合蛋白（VISTA-Ig）抑制T 細胞的激活、增殖和細胞因子的產(chǎn)生［7］。因此，VISTA 激動劑可用于治療自身免疫疾病，F(xiàn)lies 等［9］發(fā)現(xiàn)VISTA 激動性抗體能抑制T 細胞的激活，避免移植物免疫細胞對宿主細胞攻擊，有效預防小鼠的急性移植物抗宿主?。╝cute graftversus-host disease，GVHD）。

1.2 VISTA結構

對人源VISTA 進行結構分析，蛋白全長含有279 個氨基酸，由單個N 末端免疫球蛋白V 樣結構域（IgV）、莖狀區(qū)域、跨膜區(qū)域和胞內(nèi)端組成，與鼠源VISTA 氨基酸序列有77%相似性。人源VISTA蛋白全長具有CD28 超家族的成員PD-1、CD28 和CTLA-4 的特征，其中與PD-1 的相似性最高。其C末端含有3個酪氨酸激酶同源3結構域（Src homology domain 3，SH3）結合基序（PxxP）和一個酪氨酸激酶同源2結構域（Src homology domain 2，SH2）結合基序（YxxQ），可以作為受體，以類似于PD-1 的方式向表達VISTA的細胞發(fā)出信號［10］。在VISTA/PD-1雙敲除小鼠模型中，T細胞對外源抗原的反應水平遠大于任一單敲除小鼠，說明VISTA 通過異于PD-1的作用途徑調(diào)節(jié)T細胞［11］。

與蛋白全長不同，Mehta 等［10］解析的VISTA 胞外結構域（VISTA extracellular Dodoma，VISTAECD）結構與B7家族具有很高的同源性，均含有保守的IgV 樣折疊。其中與PD-L1 序列相似性較高。該結構特征表明VISTA 也可能起配體的作用。同時VISTA的特有結構特征，包括保守的C51/C113二硫鍵，富含組氨酸的分子表面互補決定區(qū)域，從結構域向外擴展的C-C′環(huán)等是其獨特功能的基礎（圖1）。

圖1 VISTA-ECD晶體結構(PDB:6U6V)VISTA-ECD 含有10 條β 鏈（A-H，A′和C′）和3 條α 螺旋，其中紅色部分為長而迂回的C-C′環(huán)

1.3 VISTA配體

目前，研究人員報道了人源VISTA與兩個潛在配體相互作用后均產(chǎn)生免疫抑制功能，分別為VSIG-3（V-set and Ig domain-containing 3）即免疫球蛋白超家族11（Ig superfamily member 11，IGSF-11）［12］和P-選擇素糖蛋白配體-1（P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）［13］。VSIG3 是免疫球蛋白超家族的成員［14］，在多種非造血細胞上表達，介導非鈣離子依賴性同源性黏附。PSGL-1是介導白細胞運輸?shù)酿じ椒肿?，在T細胞上表達時作為ICIs傳導抑制信號［15］。在慢病毒感染的小鼠體內(nèi)，其通過上調(diào)T細胞PD-1 的表達，抑制耗竭的CD8+T 細胞中T 細胞 受 體（T cell receptor，TCR）和 白 介 素-2（interleukin-2，IL-2）的信號傳導發(fā)揮作用。

2017 年，通過對人源單跨膜蛋白庫進行高通量篩選，Yang 等［16］發(fā)現(xiàn)VSIG3 與VISTA 在蛋白和細胞水平上具有相互作用。體外實驗發(fā)現(xiàn)VSIG3通過VISTA抑制T細胞多種細胞因子的分泌，包括IL-2、IL-17、IFN-γ 等。2019 年Johnston 等［13］發(fā)現(xiàn)PSGL-1是VISTA 酸性條件下選擇性配體。在小鼠腫瘤模型中，阻斷VISTA-PSGL1 結合的抗體能夠解除VISTA 依賴性免疫抑制。在TME 常見的pH 6.0條件下，VISTA對PSGL-1的表觀結合親和力為4 nmol/L，但在生理pH 條件下未檢測到其與PSGL-1 的結合。而VSIG3 在生理pH 和偏酸性條件下均能檢測到與VISTA的結合，但相對于中性pH，親和力下降至80 nmol/L。直至目前，VSIG3 和PSGL-1與VISTA 在腫瘤免疫中的作用相關數(shù)據(jù)仍然匱乏，相關途徑的體內(nèi)作用方式亟待進一步研究。

2 VISTA 在TME 中的表達及其作為受體或配體的功能

腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)展、免疫逃逸和耐藥中發(fā)揮重要作用。其構成復雜，由腫瘤細胞及其周圍的基質細胞、血管內(nèi)皮細胞、免疫細胞、相關分泌因子和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）等組成［17］。在TME 中浸潤的免疫細胞，除了發(fā)揮抑制腫瘤功能的CD4+輔助性T 細胞（helper T cell，Th）、CD8+細胞毒性T 淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）、M1 型巨噬細胞外，還有促進TME的產(chǎn)生免疫抑制的組分，如調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory T，Treg）、M2 型腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associated macrophage，TAM）、髓系來源的抑制細胞（myeloidderived suppressor cells，MDSCs）等。VISTA在TME的多種細胞上均有表達（圖2），這增加了研究其作用機制的難度。

圖2 腫瘤微環(huán)境(TME)中VISTA的表達和相互作用[37]

2.1 淋巴細胞上的VISTA介導免疫抑制

在大多數(shù)人類癌癥和小鼠模型中，VISTA主要在TME的免疫細胞上表達，且在髓系細胞中的表達高于淋巴細胞［18］。

在小鼠胸腺中，VISTA 在CD4+單陽性細胞上低表達，在CD8+單陽性細胞上表達水平較高，而在CD4+CD8+雙陽性細胞上無表達。在脾臟和淋巴結等外周淋巴器官中，VISTA 在初始CD4+T 細胞和Treg 細胞上表達，而在CD4+記憶樣T 細胞上表達較少［6］。作為ICI，VISTA 在初始T 細胞上表達，使得T細胞維持靜息狀態(tài)，影響腫瘤抗原反應的初級階段。而CTLA-4 和PD-1 在活化的T 細胞上表達。CTLA-4 在啟動階段通過限制共刺激抑制T 細胞活化，進入無能狀態(tài)。PD-1在啟動后期表達，引發(fā)T 細胞耗竭［8］。在B 細胞表面則幾乎檢測不到VISTA的表達。

相關研究表明，VISTA蛋白在免疫抑制性腫瘤浸潤性白細胞上的表達明顯上調(diào)，如抑制性FoxP3+Tregs 和MDSCs［19］。在 多 種 人 類 腫 瘤 類 型中，VISTA的表達隨著疾病進展而增加，表現(xiàn)更差的預后結果。例如在腎癌、CT26 結腸癌、B16 黑色素瘤和MB49 膀胱癌中，VISTA 在MDSCs 上的表達顯著上調(diào)，促進其免疫抑制功能。作為MDSCs 上的受體，VISTA 通過促進TRAF6 蛋白降解，抑制Toll 樣受體（TLR）介導的MAPK/AP-1 和IKK/NFkB 信號通路的激活［20］。在細胞水平上，VISTA 調(diào)節(jié)骨髓源性抑制細胞和耐受性樹突狀細胞（DC）亞群的效應功能。阻斷VISTA 增強了它們產(chǎn)生促炎介質的能力，減少了對T 細胞的抑制功能，同時改善腫瘤微環(huán)境，促進T細胞浸潤和激活［20］。小鼠模型中，敲除VISTA 后巨噬細胞表面CCR2 和CCR5調(diào)節(jié)異常，導致其配體CCL2 和CCL3 積累。趨化因子受體的循環(huán)的改變使得其向腫瘤微環(huán)境遷移的能力降低［21］。以上研究表明，使用抗VISTA 治療藥物來調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞或免疫抑制MDSCs是可行的治療策略。

2.2 腫瘤細胞上VISTA的雙向作用

雖然VISTA 通常在免疫細胞中更普遍，但一些研究也顯示其在人的非小細胞肺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌的腫瘤細胞或細胞系上均有表達。在小鼠腫瘤細胞系上的表達則十分罕見［22］。VISTA 在腫瘤細胞上表達的作用復雜且存在爭議。直至目前，多數(shù)研究認為VISTA 抑制免疫系統(tǒng)。但有些試驗現(xiàn)象表明，腫瘤上VISTA的表達伴隨著生存率的提高?？赡苁且驗閂ISTA 在有效免疫反應的炎性腫瘤微環(huán)境中上調(diào)，“熱腫瘤”中富集有發(fā)揮抑瘤活性的活化T 細胞和髓系細胞，生存率相對較高［23］。

作為抑制性配體，Rosenbaum 等［24］觀察到在在黑色素瘤中，VISTA 受到factor forkhead box D3（FOXD3）的調(diào)控，在腫瘤細胞中特異性表達，促進腫瘤發(fā)展。同時，F(xiàn)OXD3 增強腫瘤浸潤巨噬細胞上PD-L1 表達，促進腫瘤內(nèi)T 調(diào)節(jié)細胞的增加。Hong等［25］發(fā)現(xiàn)VISTA 在腎透明細胞癌中的表達較癌旁正常細胞明顯上調(diào)，mRNA和蛋白水平均有較高的表達，且其表達水平可高于PD-L1 的表達水平，在此情況下T細胞的抑制可能由VISTA主導。

在卵巢癌等幾種特定癌癥類型中，VISTA在腫瘤細胞上的高表達與良好預后密切相關，表明VISTA也可能作為共刺激分子發(fā)揮作用，但機制尚不明確。在癌癥基因組圖譜（TCGA）的腫瘤類型中，人VISTA 在上皮樣間皮瘤中表達最高。在該種腫瘤患者中，VISTA高表達與較好的臨床預后相關，而PD-L1 與較差的預后相關［26］。在99%的非小 細 胞 肺 癌（human non-small cell lung cancer，NSCLC）中能檢測到VISTA 蛋白的表達，其中腫瘤細胞表達率為21%［27］。VISTA 在人類非小細胞肺癌中的高表達水平，與腫瘤浸潤淋巴細胞增多，PD-1/PD-L1 信號軸標志物，特異性基因組改變和預后有關。在肺腺癌中，VISTA 表達水平的升高與EGFR 缺失和較低的突變負荷相關［28］。非小細胞肺癌腫瘤間室中出現(xiàn)VISTA 預示5 年生存時間延長。此外，高VISTA/PSGL-1 共定位與非小細胞肺癌患者總生存率的提高有關［29］。在卵巢癌中，VISTA可在內(nèi)皮細胞、腫瘤浸潤細胞和腫瘤細胞中表達［30］。癌癥細胞系百科全書基于深度RNA測序展 現(xiàn)（CCLE；http：//www.broadinstitute.org/ccle）VISTA 在52 種人類卵巢腫瘤細胞系和27 種子宮內(nèi)膜癌中均有表達。VISTA 抑制抗體給藥后，卵巢癌荷瘤小鼠的存活時間延長［31］。Liao 等［32］發(fā)現(xiàn)VISTA 能影響卵巢癌的進展，其表達隨著晚期病程和淋巴結轉移而增加。與免疫細胞相反，卵巢腫瘤細胞中的VISTA 表達與高度惡性漿液性卵巢癌患者的良好預后正相關［33］。

除在免疫細胞和腫瘤細胞外，卵巢癌［33］和胃癌［34］的內(nèi)皮細胞上也可以檢測到VISTA的表達。以上討論表明VISTA 在不同腫瘤類型發(fā)揮不同的功效，可看出其對癌癥免疫的影響十分復雜。由于VISTA的功能是組織特異性的，作為癌癥免疫治療中的靶點，仍需深入研究，辨明其在不同腫瘤TME中的表達情況和功能。

2.3 TME對VISTA表達和功能的影響

腫瘤微環(huán)境非常復雜，多種因素都可以影響VISTA的表達，目前對缺氧和酸性環(huán)境的研究較為透徹。TME 中增生的腫瘤細胞引起的耗氧量和擴散量的增加，氧輸送減少，造成缺氧。在氧氣含量處于低水平時缺氧誘導因子（HIF）脯氨酸羥化反應速率降低，進而影響其泛素化進程，HIF1的蛋白酶體降解被抑制，導致HIF1 蛋白水平升高。HIF介導多種途徑影響代謝，其活化通常與預后差相關。另一方面氧氣供給不足使得腫瘤細胞主要通過糖酵解供能。這使得代謝產(chǎn)物乳酸積累，影響TME 酸堿平衡。除此之外，腫瘤細胞為了避免自身酸中毒，通過胞膜上的質子轉運蛋白排出H+也在造成了TME的pH 降低。多種因素結合造成TME整體呈現(xiàn)酸性。Deng等［35］發(fā)現(xiàn)在一組結直腸癌患者中VISTA 和缺氧誘導因子（HIF）-1α 活性相關。在后續(xù)的研究中，他們在CT26 結直腸癌小鼠模型中也觀察到該現(xiàn)象。染色質免疫沉淀和基因沉默試驗結果表明在低氧條件下，（HIF）-1α 與VISTA啟動子中的一個保守的缺氧反應元件結合，上調(diào)髓系細胞上VISTA的表達。由于VISTA ECD富含組氨酸，在酸性pH 條件下，組氨酸側鏈基團帶正電，具有極性和親水性。組氨酸富集區(qū)域形成pH 依賴性結合位點。Johnston 等［36］發(fā)現(xiàn)VISTA多聚體在pH 低于6.5 時結合白細胞，但在生理pH 7.4 時不能結合白細胞。TME的pH 可低至5.85，利于結合。轉染VISTA的細胞在低pH 下更有效地抑制T 細胞，主要通過與PSGL-1 結合后激活新途徑，放大免疫抑制作用［37］。

3 VISTA阻斷抑制劑研究現(xiàn)狀

作為免疫治療的新靶點，VISTA抑制劑研發(fā)正受到越來越多的關注。部分小分子抑制劑和抗體已進入臨床研究階段（表1、圖3）。

圖3 化合物結構及其與抗體結合表位

表1 處于臨床試驗階段的VSITA抑制劑

3.1 VISTA小分子抑制劑研究現(xiàn)狀

2015 年10 月，Curis 與Aurigene 合作推出可選擇性靶向PD-L1 和VISTA的口服小分子拮抗劑CA-170［38］。臨床前體外數(shù)據(jù)表明，CA-170 可以誘導T 細胞增殖和促進IFN-γ 釋放。此外在多種動物腫瘤模型中，CA-170 具有與抗PD-1 或抗VISTA抗體類似的抗腫瘤作用，并于2020 年完成了針對人體晚期實體瘤或淋巴瘤的Ⅰ期臨床試驗［39］，Ⅲ期臨床試驗也在進行中。但Musielak 等［40］和Gabr等［41］用常規(guī)的體外生化實驗測得CA-170 與PD-L1以及VISTA之間沒有直接結合，其功效有待證實。

Gabr 等［41］基于TR-FRET（time-resolved fluorescence resonance energy transfer）原理從化合物庫中篩選出了與VISTA 有親和力的先導化合物NSC622608。優(yōu)化后的化合物Ⅲ能在體外阻斷VISTA信號傳導，解除高表達VISTA的卵巢癌和子宮內(nèi)膜腫瘤細胞系對Jurkat T 細胞增殖的抑制，同時促進其與T 細胞共培養(yǎng)時IFN-γ 和TNF-α 的分泌。

3.2 VISTA抗體研究現(xiàn)狀

JNJ-61610588（CI-8993/VSTB112）［42］、W0180［43］和HMBD-002［44］是目前進入臨床試驗的3種VISTA抑制性單克隆抗體。BMS-767（P1-068767）［45］和SG7［46］尚處于臨床前研究階段。

Janssen 公司于2016年啟動了IgG1 kappa型抗體JNJ-61610588（NCT02671955）的臨床研究，Ⅰa期試驗招募了12 例患者，用于評估該抗體治療晚期實體瘤的安全性、藥代動力學和藥效學。據(jù)報道，其中1位患者在治療過程中出現(xiàn)細胞因子釋放綜合征，之后該研究被Janssen 公司終止。2020 年Curis 公司將其重新命名為CI-8993 并于9 月啟動Ⅰ期研究（NCT04475523），評估CI8993 用于復發(fā)/難治性實體瘤患者的安全性、耐受性和抗腫瘤活性。癌癥免疫治療協(xié)會第36 屆年會上公布了CI-8993 的最新臨床前數(shù)據(jù)［47］：PET（正電子發(fā)射斷層掃描）成像和定量驗證了Zirconium-89（89Zr）記的CI-8993在體內(nèi)與人源VISTA的特異性結合。該試驗結果能協(xié)助CI-8993 藥代動力學研究，確定其在患者中的生物分布。

Pierre Fabre 研發(fā) 的W0180 同 為IgG1 kappa 型抗體。臨床試驗中，除測試其單獨抗腫瘤作用外，同時評估其與PD-1 抑制性單克隆抗體pembrolizumab聯(lián)用是否能增強療效。

Hummingbird Bioscience 正在開發(fā)的HMBD-002 靶向基于計算預測VISTA的功能表位。通過阻斷VISTA的功能性C-C′環(huán)區(qū)域［48］，逆轉VISTA誘導的免疫抑制效應。作為IgG4 亞型抗體，對大多數(shù)FcγR 受體具有較弱的親和力，并且缺乏激活補體的能力，能在阻斷VISTA 抑制功能的同時不消耗VISTA 陽性細胞。HMBD-002 對不同物種VISTA（人類、食蟹猴和嚙齒動物）均有親和力，且對VISTA 與VSIG3 相互作用顯示強劑量依賴性抑制［44］。與CI-8993 相 比，HMBD-002 能有 效解 除MDSC 對T 細胞IFN-γ 分泌的抑制。在混合淋巴細胞反應分析中，炎性細胞因子、IFN-γ 和TNF-α 的水平顯著增加，CD14+單核細胞增殖受到抑制。在小鼠植瘤模型中，HMBD-002 顯著抑制腫瘤生長，提高小鼠存活率［49］。2022 年1 月啟動的HMBD-002 的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗（NCT05082610）將評估其用于晚期實體瘤患者的療效，其中包括三陰性乳腺癌（TNBC）、非小細胞癌肺癌（NSCLC）等其他癌癥。同時測試其與pembrolizumab 聯(lián)用的療效。由于VISTA在TNBC和NSCLC中高表達，這兩種癌癥被確定為臨床研究的優(yōu)先適應證。

BMS-767 是其中唯一的pH 選擇性封閉抗體［45］，特異性靶向低pH 腫瘤部位，且僅在pH 6.0時阻斷VISTA 與PSGL-1或VSIG3的相互作用。該特異性將降低非腫瘤反應性和副作用。

斯坦福大學團隊利用酵母表面展示技術設計出與小鼠、人和食蟹猴VISTA 蛋白均具有高親和力的具有物種交叉反應性抗體SG7［46］。一方面，與HMBD-002 相比，其與鼠源和人源VISTA 蛋白親和力水平相當，使得藥物能夠在野生型小鼠中進行更有效的臨床前表征，簡化進入臨床試驗流程。另一方面，SG7與其他單克隆抗體與Fc受體（FcR）的結合不同，BMS-767 和CI-8993 含有一個活性的Fc 片段，而SG7 則有一個“死亡”的Fc 區(qū)。在B16F10、MC38 和4T1 腫瘤模型中，含有活性FC的SG7表現(xiàn)出更多的髓系細胞耗竭，但在減緩腫瘤生長方面并不比含有“死亡”FC的形式更有效。據(jù)此，SG7 的毒性可能低于其他單抗。綜上所述，SG7是一個具有前景的臨床候選藥物。

4 靶向VISTA的免疫檢查點抑制劑篩選方法

前期針對PD-1/PD-L1 的抑制劑的研究為后續(xù)新型免疫檢查點藥物的開發(fā)提供了可靠的理論和實踐基礎。目前免疫檢查點藥物篩選普遍的流程包括3 個部分：（1）在體外通過生物物理和生物化學分析檢測親和力；（2）通過細胞水平試驗評估阻斷和生物活性作用；（3）構建異種移植動物模型證實其抗腫瘤作用［50］。由于每種ICIs 特性以及研究深度不同，實際研發(fā)過程中試驗方法需要做出相應的調(diào)整。

4.1 結合親和力檢測

結合親和力是衡量潛在抑制劑與免疫檢查點蛋白結合能力的最關鍵參數(shù)之一，ELISA是最為廣泛使用的檢測方法［51］，但并不適合于高通量篩選，AlphaELISA［52］可用于替代ELISA，其基于發(fā)光氧通道化學原理，抗干擾能力強，動態(tài)范圍寬且易于實現(xiàn)自動化。SPR（surface plasmon resonance）［53］和BLI（biolayer interferometry）［54］是兩種常用的實時監(jiān)測生物分子相互作用的無標記技術，通過光學信號的變化反映化合物的結合情況，可用于高通量篩選。ITC（isothermal titration calorimetry）［55］通過分析物和蛋白質結合時產(chǎn)生的熱量變化判斷相互作用強弱。MST（microscale thermophoresis）技術需要標記目的蛋白但無需偶聯(lián)［56］。NMR技術檢測范圍廣［57］，可以檢測微弱的分子間相互作用。NMR 競爭性分析（weak-antagonist induced dissociation assay-NMR w-AIDA-NMR）和TR-FRET 則能進一步提供待檢測分子能否對蛋白質-蛋白質相互作用產(chǎn)生阻斷作用的相關信息［58］。

在VISTA 小分子抑制劑篩選中，研究者們采用了多種方法相互驗證。例如，化合物Ⅲ優(yōu)化過程中，Gabr 等［41］通過SPR 測試表觀親和力，同時也通過競爭性ELISA 檢測化合物能否抑制VISTA 與VSIG-3 的相互作用。由于目前報道的VISTA的兩個配體有待研究，Gabr 等［41］用VISTA 抑制性抗體代替配體構建TR-FRET 模型，測試抑制劑的阻斷作用。但該方法存在明顯缺陷，無法確保篩選出的拮抗劑能抑制VISTA 與其真實配體的結合。通過交叉驗證能有效地避免假陽性結果。

4.2 基于細胞的功能分析

細胞水平分析主要包括基于生物發(fā)光報告細胞的分析［59］和以T 細胞為基礎的生物功能評價［60］。雖然VISTA 具有作為受體、配體的雙重特性，目前構建細胞水平的分析方法時普遍將其視為配體。

生物發(fā)光報告細胞試驗需要構建兩種細胞，表達ICIs的APC/CHO-K1 細胞系和效應細胞系。效應細胞系通常為含帶有NFAT 反應元件的熒光素酶報告質粒的Jurkat T細胞［41］。

在共培養(yǎng)體系中，VISTA 與其T 細胞上受體結合，進而抑制NFAT反應元件介導的TCR信號和發(fā)光。VISTA 抑制劑的存在阻斷了相互作用，導致TCR 信號和發(fā)光的重新激活，因此可以通過熒光信號強弱來篩選藥物。

基于T細胞的檢測包括效應細胞、呈現(xiàn)ICIs的細胞和效應細胞的激活信號（CD3 激活物）。為了提高準確性和重復性，實驗中一般使用永生化細胞系而非原代細胞。例如效應細胞通常使用Jurkat 人T 細胞系，以檢測CD3 依賴的T 細胞的激活。評價VISTA 小分子抑制劑的功能時，通常采用基于細胞共培養(yǎng)的方法或與VISTA 蛋白孵育的單細胞培養(yǎng)方法。其理論基礎是加入靶向VISTA的小分子后，T 細胞功能障礙將得到改善。T 細胞功能檢測包括T 細胞增殖、T 細胞相關細胞因子釋放（IL-2 和IFN-γ）以及下游相關通路（包括蛋白活性及其磷酸化）的變化［61］。在體外活性試驗中常用以上3種指標評價藥物活性。

4.3 基于小鼠腫瘤模型的活性分析

常見的腫瘤模型包括腫瘤細胞系異種移植（cell-derived xenograft，CDX）小鼠模型［62］、人源腫瘤組織來源移植瘤（patientl derived xenograft，PDX）模型和免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型［63］。其中CDX 最為常用。但由于腫瘤組織異質性的喪失，生物學特性與臨床相似度降低，同時藥效評價結果差異較大。在PDX 模型中，腫瘤以組織的形式直接移植使得腫瘤異質性得以保留，可用于耐藥標記物和化療藥物敏感相關研究。但該模型因其荷瘤小鼠免疫缺陷而無法用于免疫相關藥物的篩選，人源化小鼠模型能較好地模擬人體免疫特征。

在實際藥物篩選時可通過多種模型測試其活性［48］，包括易于構建的CT26 結直腸癌CDX 小鼠模型、高表達VISTA的4T1 乳腺癌CDX 小鼠模型和人源化的Hu-HSC（humanized-hematopoietic stemcells）小鼠模型。后兩種模型有效彌補單一CDX模型試驗的缺陷，能測試藥物對靶點的選擇性以及療效的種屬特異性。

模型構建成功后，通過給藥前后的腫瘤抑制率（tumor growth inhibition，TGI）、動物體重變化、TME 中具有活性的CD4+/CD8+免疫細胞、抑制性細胞數(shù)量變化以及細胞因子水平IFN-γ 評價抑瘤活性［48］。在進行藥效篩選的同時，需對藥物進行藥代動力學和毒理學的相關研究，確保安全性的同時為后續(xù)研發(fā)收集數(shù)據(jù)以及提供思路。

5 總結與展望

ICIs 療法是近年來腫瘤免疫治療領域的研究熱點，在臨床上，多種類型的腫瘤患者對PD-1/PDL1 和CTLA-4 抗體治療具有高應答率。但個體差異導致的無應答和耐藥性限制其更廣泛的應用。因此，研究人員致力于發(fā)現(xiàn)新型的ICIs 以期惠及更多患者。VISTA 作為近年新發(fā)現(xiàn)的ICIs 具有更大的發(fā)展?jié)摿?，其抑制性抗體在小鼠模型能有效抑制腫瘤生長，與PD-1/PD-L1 抗體聯(lián)用效果更為顯著。相關治療性抗體和小分子藥物臨床試驗相繼開展。但由于VISTA ECD 表面平坦，小分子藥物結合位點的設計具有挑戰(zhàn)性，需要得到更多先導化合物與靶點結合的相關位點參數(shù)。對此，本課題組通過SPR 高通量篩選，獲得了與VISTA 具有高親和力的二唑類化合物。在基于T 細胞的功能分析中能達到與抗體接近的療效，同時在CT26 結直腸癌CDX 小鼠模型中能有效抑制腫瘤的生長。后續(xù)試驗將聚焦于通過解析該化合物與VISTA的晶體結構，分析關鍵結合位點，從而進行優(yōu)化和改造。

然而，由于VISTA 富含組氨酸，具有配體受體雙重角色以及在TME 中表達與相互作用關系復雜等特性，其抑制劑的篩選方法仍需優(yōu)化。對兩種配體VSIG3 和PSGL-1 在體內(nèi)是否存在競爭作用，在不同細胞類型和環(huán)境中誰占主導，下游通路信號通路等機制的研究將有助于建立更具特異性和系統(tǒng)的篩選方法，提高藥物研發(fā)的成功率。

綜上所述，雖然VISTA 靶點研究有待深入，但其抑制活性的組織特異性以及與PSGL-1 結合的pH 依賴性使得VISTA 在現(xiàn)有的ICIs 中獨具一格。其特性使得開發(fā)腫瘤部位富集的pH 選擇性抑制劑成為可能，為未來的腫瘤免疫治療開辟新的領域。