王燕梅，楊 磊，辛曉斐，尹莉芳*

（1中國藥科大學藥學院藥劑系，南京 210009；2江蘇省緩釋智能制劑及關(guān)鍵功能性輔料開發(fā)與評價工程研究中心，南京 210009）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是最常見的與代謝功能障礙相關(guān)的一系列慢性肝病。據(jù)流行病學統(tǒng)計，過去30 年間，NAFLD 在普通人群中的患病率為25%，而在肥胖人群中的患病率約為90%，且呈逐年上升的趨勢［1］。

目前，研究者針對NAFLD 發(fā)生和發(fā)展的復雜性和多因素性，提出了經(jīng)典的“雙重打擊學說”［2］：第一重打擊是由于久坐生活方式、高脂飲食、肥胖和胰島素抵抗等不同病因，通過增加氧化應激和脂肪酸氧化障礙形成脂肪肝；第二重打擊涉及炎癥反應、肝細胞損傷和肝纖維化的形成，以上因素是NAFLD 向非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）發(fā)展的關(guān)鍵［3］。然而，“雙重打擊學說”無法解釋在NAFLD 發(fā)生和發(fā)展過程中的分子與代謝水平調(diào)控機制，因此“多重打擊學說”應運而生。新學說提出，患者的飲食習慣、生活環(huán)境和遺傳因素可導致胰島素抵抗、肥胖、脂肪細胞的增殖和腸道菌群的變化，從而導致血液中游離脂肪酸和膽固醇的含量增加，脂肪酸代謝調(diào)節(jié)失衡和脂毒性增強，從而引起線粒體功能障礙并伴隨著活性氧水平的上升、氧化應激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的產(chǎn)生［4］；胰島素抵抗能增加肝臟脂肪的重新合成、誘導脂肪分解形成更多的游離脂肪酸，促進脂肪因子和包括腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）和白介素6（interleukin 6，IL-6）等促炎細胞因子的合成與分泌，最終誘導肝臟炎癥微環(huán)境的形成［5］；此外，肝臟炎癥會激活肝星狀細胞分化為肌成纖維細胞，使其獲得收縮、增殖和纖維化的特性，并促進細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的大量增生，主要表現(xiàn)為α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白1（type I collagen alpha 1，Col1α1）和Ⅲ型膠原蛋白α1（type III collagen alpha 1，Col3α1）過度表達［6］，從而導致更嚴重的肝臟相關(guān)疾病，如非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化、門靜脈高壓、肝硬化等，并最終誘發(fā)肝癌的形成；以上現(xiàn)象在基因敏感的受試者中表現(xiàn)更為顯著［7］。

針對NAFLD 復雜的發(fā)病機制，目前有多種治療藥物用于NAFLD/NASH 和肝纖維化的治療，包括膽汁酸代謝調(diào)節(jié)劑、葡萄糖代謝調(diào)節(jié)劑、炎癥抑制劑、纖維生成抑制劑和脂肪生成抑制劑等［8］。盡管印度藥品監(jiān)管總局（drug controller general，DCGI）已批準PPARα/γ 雙重激動劑Saroglitazar 用于治療非肝硬化性NASH 患者，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）和歐洲藥品管理局至今還未有批準用于治療NAFLD的藥物，許多小分子藥物和核酸藥物正在臨床試驗研究中。目前處于臨床研究階段的核酸藥物和臨床Ⅲ期的小分子藥物見表1，盡管有少部分藥物已經(jīng)完成了Ⅰ期/Ⅱ期的臨床研究并進入Ⅲ期，但目前針對NAFLD的大部分藥物在Ⅰ期/Ⅱ期臨床試驗中都未能達到預期的終點而被終止（NCT01703260；NCT03053063；NCT03551522等）；即使進入Ⅲ期，也未有達到臨床終點的臨床研究，大多都被終止（NCT02704403；NCT03053063；NCT03028740）。這是由NAFLD 復雜的發(fā)病機制與豐富的靶點和信號通路所致。針對單一靶點的單一療法使NAFLD患者獲益是有限的，因此，作用于相同或不同分子生物學機制的藥物聯(lián)合療法具有廣闊的開發(fā)前景。

表1 單一療法治療NAFLD/NASH的小分子藥物、核酸藥物的臨床研究情況

目前針對NAFLD聯(lián)合療法的臨床試驗正在如火如荼地開展，和單一療法相比，聯(lián)合療法具備以下優(yōu)勢［9］：①對單一療法無響應患者而言，聯(lián)合療法可提高藥物的反應率和顯效率；②聯(lián)合療法可通過聯(lián)合使用針對肝脂肪變性、炎癥和肝纖維化的藥物，達到同時改善NASH 和纖維化的臨床終點，最大程度提高藥物治療效果；③聯(lián)合療法可降低因劑量依賴性產(chǎn)生副作用的風險，提高用藥的安全性。

在肝臟纖維化的進程中，肝臟組織的結(jié)構(gòu)遭到破壞，ECM 大量沉積，肝臟血流灌注減少，導致肝臟細胞對治療藥物的攝取減少，極大地降低了療效；由于缺乏靶向性，治療藥物被非目的細胞攝取后，極易產(chǎn)生細胞毒性和副作用。納米載體可提高負載藥物的穩(wěn)定性，改善藥物的溶解性，可同時負載多種藥物；能主動或被動靶向至肝臟中不同的目的細胞，實現(xiàn)特異性藥物遞送并降低全身毒性［10］。目前用于治療NAFLD/NASH 和肝纖維化的遞送系統(tǒng)種類眾多，根據(jù)納米載體的天然特性，可分為無機納米顆粒和有機納米顆粒。無機納米顆粒包括介孔二氧化硅納米粒、金納米粒、超順磁性氧化鐵納米粒等，它們的尺寸和形狀賦予了其光學、電學和磁學等特性。如金納米粒的表面可修飾性和粒徑可控制性使其可被設(shè)計成棒狀結(jié)構(gòu)、籠狀結(jié)構(gòu)和衛(wèi)星結(jié)構(gòu)，用于抗NAFLD藥物的遞送；介孔二氧化硅具有較大的空隙體積和比表面積，以及良好的化學和熱穩(wěn)定性，載藥量高［11］。有機納米顆粒通常由生物大分子如蛋白質(zhì)、聚合物或脂質(zhì)組成，具有良好的生物相容性和生物可降解性；表面有較多活性基團，可進行表面修飾，用于肝臟細胞特異性靶向。因此，本文對NAFLD/NASH的聯(lián)合治療策略與遞送系統(tǒng)進行總結(jié)，為NAFLD/NASH 治療提供新的思路。

1 小分子藥物聯(lián)用及其遞送

基于NAFLD 發(fā)病的不同分子生物學機制，并發(fā)現(xiàn)有效靶點的小分子藥物的聯(lián)用，是NAFLD 治療過程中最常見的聯(lián)合用藥策略。首先，針對炎癥相關(guān)通路和膽汁酸代謝的調(diào)節(jié)，是聯(lián)合治療NAFLD的策略之一。NAFLD 發(fā)病機制涉及肝臟外炎癥細胞向肝損傷部位的募集，該過程主要由趨化因子與其受體之間的相互作用所介導，并涉及將骨髓來源的單核細胞和巨噬細胞募集到損傷部位，通過產(chǎn)生炎性細胞因子和趨化因子，進而進一步放大免疫反應并誘導肝星狀細胞的活化［12］。同時，膽汁酸是膽汁的主要成分，膽汁酸的異常積累會誘導肝星狀細胞活化、線粒體功能障礙和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，導致細胞凋亡、炎癥和肝損傷。法尼醇X 受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）是一種膽汁酸活化的核受體，在肝臟和腸道中高水平表達，能通過降低膽汁酸合成過程的限速酶膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7α1）的表達水平來降低膽汁酸的異常積累［13］。此外，F(xiàn)XR 激活后直接誘導小異二聚體伴侶（small heterodimer partner，SHP）的表達，SHP的上調(diào)抑制了肝星狀細胞的激活，并下調(diào)肝星狀細胞中膠原合成的相關(guān)蛋白如Col1a1 和金屬蛋白酶組織抑制劑1（tissue inhibitors of metalloproteinases 1，TIMP1）的表達，從而緩解肝纖維化［14］。臨床研究結(jié)果顯示，cc 趨化因子2 和5 受體的雙重拮抗劑cenicriviroc，在脂肪性肝炎緩解和治療等方面無顯著療效（NCT02217475）［15］。但是，cenicriviroc 和非膽汁酸FXR 激動劑tropifexor 聯(lián)用后，在臨床研究中顯現(xiàn)出比tropifexor 和cenicriviroc 單一療法更好的療效（NCT03517540）［16］。結(jié)果說明，炎癥抑制劑和膽汁酸代謝調(diào)節(jié)劑可聯(lián)合用于NAFLD的治療。

其次，聯(lián)合抑制纖維化和炎癥，也可用于治療NAFLD。上皮細胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）是指上皮細胞丟失上皮特性轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂羞\動性、遷移性和侵襲性的紡錘狀間質(zhì)細胞［17］，它是肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵事件。在此過程中，肝星狀細胞能通過EMT 途徑轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，加速其增殖，進而促進肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展，而Hedgehog（Hh）配體可通過激活Gli 家族轉(zhuǎn)錄因子而誘導EMT的產(chǎn)生［18］。肝星狀細胞的過氧化物酶體增殖物活化受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPAR-γ）能通過與肝臟X 受體形成二聚物抑制靜息狀態(tài)的肝星狀細胞的激活，并降低相關(guān)炎癥因子的表達。因此，Hh 抑制劑和PPAR-γ 激動劑聯(lián)用可同時抑制纖維化和炎癥，具有治療肝纖維化的潛力。Kumar 等［19］發(fā)現(xiàn)Hh 抑制劑vismodegib 和PPAR-γ 激動劑rosiglitazone 在大鼠膽管結(jié)扎的肝纖維化模型中，能顯著下調(diào)EMT的特征標志物α-SMA 與纖連蛋白-1（fibronectin-1，F(xiàn)N-1）的水平和減少細胞外基質(zhì)沉積；此外，炎癥相關(guān)蛋白如TNFα、NF-κB 和TGF-β 的水平也得到了顯著抑制［19］。但由于這兩種藥物水溶性較差，且rosiglitazone的半衰期僅有3~4 h，Kumar等［19］合成了兩親性共聚物methoxy-polyethylene-glycol-b-poly（carbonate-colactide）［mPEG-b-P（CB-co-LA）］，采用乳化/溶劑蒸發(fā)法制備具有生物可降解特性的聚合物納米顆粒實現(xiàn)對vismodegib 和rosiglitazone 在小鼠肝纖維化模型中的共遞送，該納米顆粒的平均粒徑為120~ 130 nm，顯著改善了vismodegib 和rosiglitazon的成藥性、在肝臟的蓄積率和藥動學行為。

此外，作用于同一信號通路不同靶點的抗纖維化藥物的聯(lián)用，可減輕藥物不良反應，提高治療NAFLD的安全性。絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）級聯(lián)反應的激活會促進肝星狀細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，并導致異常的血管生成，最終誘導肝纖維化的形成。因此，抑制MAPK 信號通路也是肝纖維化的治療策略之一。Sorafenib 是一種靶向MAPK 級聯(lián)反應中的細胞表面酪氨酸激酶受體和細胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶的多激酶抑制劑，對Raf 激酶、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血小板衍生生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）等均有效［20］，可通過調(diào)節(jié)血管重塑和血管成熟、抑制相關(guān)促纖維化因子的表達、改善線粒體功能和膠原分布障礙來發(fā)揮抗纖維化作用［21］。然而，若預防性或長期性使用sorafenib，sorafenib對Raf激酶活性的不完全抑制可能會誘導惡性或正?；|(zhì)細胞中MAPK 通路的異常激活，從而激活肝星狀細胞，減弱其抗纖維化作用［22］。絲裂原細胞外激酶（mitogenextracellular kinase，MEK）抑制劑selumetinib 與sorafenib的聯(lián)合使用，能顯著降低TNF-α、IL-1β 和IL-6 等炎癥因子的表達，降低纖維化標志物α-SMA 和Col1α1 等的表達并顯著促進肝星狀細胞的凋亡；在CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型中，selumetinib 能抑制sorafenib 誘導的ERK 和NF-κB 通路的激活，增強肝星狀細胞對sorafenib 治療的敏感性；除此以外，該聯(lián)合治療策略還能抑制纖維化相關(guān)的原發(fā)性肝癌發(fā)展和腫瘤的肝轉(zhuǎn)移［23］。此外，sorafenib的溶解度和生物利用度均很低［24］，其非特異性會引起脫靶效應，導致手足綜合征、腹瀉和高血壓［25］；并且激活的肝星狀細胞表面具有高表達的C-X-C 基序趨化因子受體4（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）［26］。因此，Sung 等［23］將可靶向于CXCR4 的CTCE9908多肽通過穩(wěn)定的硫醚鍵結(jié)合在PLGA 納米粒上，以共同遞送sorafenib 和MEK 抑制劑至激活的肝星狀細胞［27］。

2 基于RNAi的核酸藥物聯(lián)用及其遞送

由于NAFLD/NASH 發(fā)病機制的錯綜復雜性，對于沒有合適作用“口袋”的重要靶點，小分子藥物較難開發(fā)；大部分小分子藥物半衰期較短，需頻繁給藥，患者順應性差；小分子藥物由于結(jié)構(gòu)較小，易作用于多個靶點，引起患者不良反應。小核酸類藥物能通過RNA 干擾，誘發(fā)對mRNA 高效特異性降解的現(xiàn)象，達到對特定蛋白水平調(diào)控的目的，從而實現(xiàn)在對NAFLD 疾病的源頭治療。與小分子藥物相比，小核酸類藥物具有候選靶點豐富，作用范圍廣泛，并可連續(xù)數(shù)周沉默基因表達的優(yōu)勢。近幾年新發(fā)現(xiàn)，siRNA、miRNA、反義寡核苷酸（antisense oligonucleotides，ASO）和核酸適配體等在NAFLD的發(fā)病進程發(fā)揮著重要作用，這對于NAFLD的治療干預至關(guān)重要。但是，核酸類藥物在體內(nèi)穩(wěn)定性差、易被迅速降解、不易在靶組織中積累，且具有高分子量、陰離子電荷和親水性等理化性質(zhì)，導致這類藥物不易透過靶細胞膜，難以與細胞質(zhì)中的RNA 誘導沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）結(jié)合發(fā)揮沉默基因的作用。因此，設(shè)計出一種安全有效的核酸藥物遞送系統(tǒng)，是最大限度發(fā)揮核酸類藥物治療效果的關(guān)鍵。

目前，已有少數(shù)核酸類藥物進入臨床研究階段（見表1）。Arrowhead公司于2021年已經(jīng)完成了ARO-HSD的Ⅰ/Ⅱa 期臨床試驗（NCT04202354），并在美國肝病研究協(xié)會2021 年12 月進行的肝病會議中發(fā)布了臨床結(jié)果，在健康和NAFLD 受試者中分別給予25、100 和200 mg的ARO-HSD 后，能降低17β-羥基類固醇脫氫酶13（17-beta hydroxysteroid dehydrogenase 13，HSD17B13）基因的表達，從而降低炎癥和纖維化等，發(fā)揮治療NAFLD的作用；ARO-HSD 有較好的安全性、耐受性和有效性：200 mg 劑量給藥71 d 后，所有受試者HSD17B13 mRNA的表達水平均下降90%以上，ALT水平下降了42.2%，肝臟脂質(zhì)沉積相關(guān)指標MRI-PDFF 下降了7.3%，并且給藥期間未觀察到嚴重的不良反應事件［27］。與此同時，Alnylam 公司也針對HSD17B1 3 靶點開發(fā)出候選藥物ALN-HSD，目前關(guān)于ALNHSD的Ⅰ期臨床試驗的受試者正在招募進行中（NCT04565717），預期于2023年6月完成。肝實質(zhì)細胞表面大量表達去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor，ASGPR），用于結(jié)合并清除循環(huán)中的糖蛋白；N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）能與去唾液酸糖蛋白受體特異性結(jié)合，通過受體介導的內(nèi)吞作用將核酸藥物遞送至肝細胞（圖1）［28］。根據(jù)表1 顯示，大部分進入臨床試驗的NAFLD 相關(guān)核酸藥物均采用GalNAc 偶聯(lián)技術(shù)穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，并改善核酸藥物的肝臟特異性遞送和肝細胞的攝取，從而增強肝臟靶向效率。GalNAc偶聯(lián)技術(shù)在核酸藥物遞送領(lǐng)域具有很大的優(yōu)勢和前景，目前有3 種核酸藥物已成功上市，分別是用于治療成年急性肝卟啉癥的GIVLAARI?（givosiran）、用于治療原發(fā)性高草酸尿癥（Ⅰ型）的OXLUMO?（lumasiran）和治療雜合子家族性高膽固醇血癥的LEQVIO?（inclisiran）。

圖1 GalNAc-siRNA和ASO遞送至肝實質(zhì)細胞的作用機制

肝組織中膠原的大量積累與沉積是肝纖維化最為顯著的臨床特征，靶向不同信號通路但共同抑制肝星狀細胞中膠原生成的核酸藥物的聯(lián)用，是聯(lián)合治療NAFLD的策略之一。首先，miRNA-29b 是肝纖維化的關(guān)鍵治療靶點，miRNA-29b 能直接與Col1α1 mRNA的3′-UTR 序列結(jié)合抑制膠原生成，還能間接阻斷TGF-β1/Smad3（mothers against decapentaplegic homolog 3）或Hh 信 號 通路［29］、上調(diào)磷酸酯酶與張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）相關(guān)信號通路抑制纖維化［30］。此外，miRNA-122 是成人肝臟中最豐富的肝臟特異性miRNA，能通過調(diào)控TGF-β-miR-122-FN1/血 清 應 答 因 子（serum response factor，SRF）信號通路［31］和降低脯氨酰4-羥化酶亞基α1（prolyl 4-hydroxylase subunit alpha 1，P4HA1）的表達來抑制膠原蛋白的產(chǎn)生和成熟［32］。Wu 等［33］合成了維生素A（vitamin A，VA）偶聯(lián)和pH 敏感的共聚物VA- polyethylene glycol-polyethyleneimine-poly（N-（N′，N′-diisopropylaminoethyl）-co-benzylamino）aspartamide（T-PBP），組裝成超順磁性氧化鐵（superparamagnetic iron oxide，SPIO）修飾的陽離子膠束用于miRNA-29b 和miRNA-122 的共遞送。視黃醇結(jié)合蛋白受體（retinol binding protein receptor，RBPR）在肝星狀細胞表面大量表達，主要負責攝取和儲存VA，因此VA 修飾的納米遞送載體能通過吸附血液中的RBP，與RBP 受體的相互作用，提高肝星狀細胞對納米載體的攝?。?4］。體內(nèi)外結(jié)果表明，miRNA-29b 和miRNA-122 的聯(lián)合治療通過下調(diào)包括Col1α1、α-SMA 和TIMP 等在內(nèi)的相關(guān)纖維化基因的表達，產(chǎn)生協(xié)同治療肝纖維化作用；且小核酸藥物的協(xié)同治療作用顯著大于miRNA-29b或miRNA-122 單一藥物納米制劑的療效［33］。因此，miRNA-29b 和miRNA-122 的聯(lián)合能通過靶向肝纖維化的不同信號通路來抑制肝星狀細胞中膠原蛋白的生成，發(fā)揮協(xié)同治療作用。

通過反向調(diào)節(jié)膠原蛋白合成和降解來逆轉(zhuǎn)膠原蛋白積累，也是治療肝纖維化的聯(lián)合治療策略之一。肝組織中膠原的大量積累與沉積，與金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1 在肝臟組織中的過度表達，膠原蛋白的降解受到阻滯密切相關(guān)。Qiao 等［35］基于此現(xiàn)象選用分別靶向于抑制膠原蛋白合成和促進其分解的siRNA，并合成兩親性陽離子超支化脂質(zhì)（C15-PA），與輔助磷脂膽固醇-聚乙二醇-維生素A（Chol-PEG-VA）結(jié)合，形成脂質(zhì)納米顆粒，實現(xiàn)siCol1α1 和siTIMP-1 的共遞送。帶正電荷的C15-PA 與siRNA 通過靜電作用結(jié)合，提高siRNA的穩(wěn)定性；表面的PEG 親水層賦予脂質(zhì)納米顆粒在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性；VA 可提高納米載體對肝星狀細胞的靶向能力。在CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型中，siCol1α1 和siTIMP-1 的雙向協(xié)同作用能將肝纖維化小鼠中膠原蛋白的積累水平降低到正常小鼠的水平。

由此可見，基因藥物聯(lián)合療法在改善肝功能和緩解肝纖維化方面表現(xiàn)出顯著的療效。

3 小分子與核酸藥物聯(lián)用及其遞送

核酸藥物通過直接上調(diào)或下調(diào)特定基因的表達，對特定蛋白水平進行調(diào)控，但由于NAFLD發(fā)病機制的復雜性，僅使用核酸藥物未必能最大限度地發(fā)揮治療NAFLD的作用?；瘜W基因療法即結(jié)合化學和基因藥物的治療，已被提出作為實現(xiàn)協(xié)同效應的策略之一，這一概念已在癌癥治療中得到充分證實［36］。如Gong 等［37］發(fā)現(xiàn)，抑制自噬的核酸藥物siATG7能顯著增強多西紫杉醇抑制乳腺癌的療效；Zhang 等［38］發(fā)現(xiàn)siBcl-2 可通過下調(diào)Bcl-2 蛋白的表達，與氯尼達明協(xié)同誘導細胞凋亡，最終導致腫瘤細胞死亡。而在NAFLD 治療領(lǐng)域，小分子藥物和核酸藥物可通過同時作用于同一或不同靶點實現(xiàn)對NAFLD的協(xié)同治療，核酸藥物還可通過上調(diào)或下調(diào)特定轉(zhuǎn)運蛋白或改善肝臟微環(huán)境增強肝臟對小分子藥物的敏感性［39］。雖然目前化學基因療法治療NAFLD這一概念還處于臨床前研究階段，但其對肝纖維化的緩解具有明顯優(yōu)勢，是非常具有臨床研究前景的治療策略。

首先，核酸藥物和小分子藥物可作用于同一靶點協(xié)同抑制膠原生成，治療肝纖維化。水飛薊素（silymarin）是從菊科草本植物乳薊（Silybum marianumLinn.Gaertn）的種子中提取得到的一類黃酮木脂素類化合物，由水飛薊賓（silibinin）、水飛薊寧、水飛薊丁以及異水飛薊賓4種同分異構(gòu)體組成，其中以silibinin 含量最高，活性最強。臨床研究結(jié)果表明，silibinin 具有穩(wěn)定肝細胞膜、保護肝細胞不受損害；清除氧自由基、減輕毒性物質(zhì)引起的脂質(zhì)過氧化反應；抑制Col1α1 mRNA的表達，延緩早期和晚期肝纖維化中的膠原蛋白積聚，已被廣泛應用于各種急慢性肝病、肝纖維化和肝硬化［40］。然而silibinin 對肝臟膠原蛋白積累的下調(diào)能力僅為35%［41］，并且由于其低特異性、低水溶性（50 ~ 430 μg/mL）、低生物利用度（23% ~47%）等問題［42］，silibinin 對肝纖維化的治療效果極為有限。在這種情況下，靶向于Col1α1 的siRNA（si-Col1α1）可特異性阻斷Col1α1 mRNA的表達，從而阻斷肝纖維化進程并誘導纖維化消退。Qiao 等［43］采用維生素A 修飾的兩親性三嵌段聚合物PLGA-PSPE-PEG-VA 自組裝成核殼聚合物膠束（PVM），并在組裝過程中將silibinin 包裹入PLGA的疏水核中；此外，siCol1α1 通過靜電相互作用與PSPE 結(jié)合形成化學小分子/基因藥物共遞送系統(tǒng)（CGPVM）。聚合物膠束通過VA靶向肝星狀細胞，內(nèi)化后，PSPE能緩沖酸性內(nèi)體，通過增加內(nèi)部滲透壓破壞溶酶體膜，實現(xiàn)聚合物膠束的逃逸，silibinin和siCol1α1 隨后從聚合物膠束中釋放到細胞質(zhì)中并協(xié)同抑制Col1α1的表達［43］。

其次，具有抑制纖維化作用的核酸藥物和小分子藥物聯(lián)用，還可通過作用于不同靶點，實現(xiàn)對肝纖維化的協(xié)同治療。如前所述，miR-29b1 在肝纖維化的發(fā)病進程中起關(guān)鍵作用，并在大多數(shù)肝纖維化患者和相關(guān)動物模型中呈下調(diào)的趨勢；miR-29b1能直接抑制膠原生成，間接阻斷TGF-β1/Smad3 通路［29］；TGF-β1 能通過Smad 途徑激活轉(zhuǎn)錄因子Gli，Gli可進一步激活Hh的信號通路［44］，減弱miR-29b1 抑制膠原生成的作用。因此，同時遞送Hh 抑制劑GDC-0449 和miR-29b1 以抑制肝纖維化進展具有重要意義。Kumar等［45］基于以上理論，合成了共聚物mPEG-b-PCC-g-DC-g-TEPA，采用薄膜水化法將該共聚物制備成陽離子膠束，共同遞送GDC-0449 和miR-29b1；在小鼠膽管結(jié)扎肝纖維化模型中的治療效果顯示，聯(lián)合給藥后可顯著減少膠原沉積和血清損傷標志物的表達，改善肝臟形態(tài)，并顯著抑制包括TIMP-1、α-SMA 和FN-1 在內(nèi)的促纖維化基因的表達，發(fā)揮協(xié)同治療的目的。

最后具有抑制纖維化的核酸藥物和具有抑制炎癥的小分子藥物聯(lián)用，也是治療NAFLD/NASH和肝纖維化的聯(lián)合治療策略之一。肝炎病毒、酒精、非酒精性脂肪性肝炎和肝毒性藥物等誘導的慢性肝損傷能導致肝臟缺氧微環(huán)境的形成，從而提高VEGF的表達水平，通過促進肝臟血管生成加速肝纖維化進程［46］。如前所述，細胞因子和趨化因子是組織炎癥的主要調(diào)節(jié)因子，慢性肝損傷還會誘導趨化因子SDF1α 及其受體CXCR4 的表達，加重肝臟的炎癥反應［47］。因此，CXCR4 抑制劑AMD3100 和靶向VEGF的siRNA（siVEGF）的聯(lián)合療法有望發(fā)揮協(xié)同治療肝纖維化的作用。基于此假 設(shè)，Liu 等［48］制 備 了具 有CXCR4 靶 向 并 載 有AMD3100 和siVEG的脂質(zhì)體：將小牛胸腺DNA 作為載體，在魚精蛋白存在的條件下，將AMD3100和siVEGF濃縮成核復合物，并包裹入由膽固醇、二油?；字Ｄ憠A（DOPC）、帶負電荷的二油?；字幔―OPA）和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG-2000）組成的脂質(zhì)體中，再通過電荷相互作用，將帶正電荷的AMD3100 與帶負電的脂質(zhì)體共孵育，使納米載體表面具有CXCR4靶向性；脂質(zhì)雙層中的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）可改善納米載體的血液循環(huán)和生物分布。在CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型中，遞送AMD3100 和siVEGF的CXCR4 靶向的納米顆粒能通過減少血管直徑和彎曲度改善肝臟血管的結(jié)構(gòu)，減少細胞外基質(zhì)的沉積，改善肝臟缺氧的微環(huán)境和炎癥［48］。

4 總結(jié)與展望

NAFLD 是由多種細胞、多種細胞因子和多種信號通路等相互作用，導致代謝紊亂而衍生出的慢性疾病，其中肝星狀細胞的激活是形成肝纖維化進程中最為關(guān)鍵的因素；目前對NAFLD/NASH的治療已有豐富的潛在治療靶點，全球多家大型制藥企業(yè)都在競相開發(fā)NAFLD新藥且有多種藥物已進入臨床試驗階段，除了被印度DCGI 批準的PPARα/γ 雙 重 激 動 劑saroglitazar，至 今 還 未 有NAFLD的相關(guān)治療藥物被批準上市，這表明NAFLD的患者難以從單一療法獲益；因此，研究者逐漸將目光聚焦于NAFLD發(fā)病機制中的不同靶點和信號通路，并開發(fā)相關(guān)的聯(lián)合治療策略，以期實現(xiàn)藥物與藥物的協(xié)同效應，減緩NAFLD 疾病進展甚至逆轉(zhuǎn)NAFLD。小分子藥物聯(lián)用、RNAi 療法和化學基因療法是目前極富前景的聯(lián)合治療策略，各個策略的研發(fā)情況及遞送方式見表2，目前已有小分子的聯(lián)合用藥處于臨床評估階段。然而，對沒有合適作用口袋的靶點，較難開發(fā)對應的小分子藥物；同時，特異性低也是引發(fā)小分子副作用大的主要原因。與之相比，基于RNAi 療法的小核酸藥物為擴大治療靶標的范圍提供了獨特的機會，各種形式的小核酸藥物能選擇性地作用于小分子藥物無法靶向的基因和蛋白質(zhì)，直接調(diào)控特定蛋白的表達，作用時間持久且范圍更廣泛，有望實現(xiàn)對NAFLD相關(guān)疾病的源頭治療。將小分子藥物和核酸藥物聯(lián)合使用，可通過同時作用于同一或不同靶點實現(xiàn)對NAFLD 進行協(xié)同治療，還可增強肝臟對小分子藥物的敏感性，是目前極具前景的聯(lián)合治療策略。

表2 聯(lián)合療法治療NAFLD/NASH的研發(fā)情況及遞送方式

安全高效的肝臟靶向遞送策略有利于最大限度地減少小核酸藥物的脫靶作用，進而發(fā)揮藥物治療NAFLD的作用。NAFLD 患者的肝臟中膠原蛋白和纖維蛋白大量沉積、血流灌注量減少，形成肝臟藥物遞送的物理屏障，這會嚴重阻礙遞送系統(tǒng)的有效性和肝臟細胞對治療藥物的攝取率。目前已有大量研究者設(shè)計了不同的納米載體如脂質(zhì)體、固體脂質(zhì)納米粒和聚合物膠束等用于肝臟的遞送，并通過在載體表面修飾不同的特異性配體，將藥物選擇性地遞送至肝星狀細胞、肝實質(zhì)細胞和枯否細胞（圖2）?；罨母涡菭罴毎砻孢^度表達的受體包括視黃醇結(jié)合蛋白受體（RBPR）、6-磷酸甘露糖/胰島素樣生長因子Ⅱ（mannose-6-phosphate/insulin-like growth factor II，M6P/IGFII）受體、PPAR、整合素、PDGFR 等，可設(shè)計相應的靶向性載體將藥物遞送至肝星狀細胞；肝實質(zhì)細胞表面大量表達ASGPR，對半乳糖基化的大分子有高親和力；磷脂酰絲氨酸（phospholipid serine，PS）是凋亡細胞暴露的信號，因此PS修飾的納米載體，可被枯否細胞識別，實現(xiàn)對枯否細胞的靶向。雖然有多種靶向方式可實現(xiàn)對以上細胞的特異性遞送，但仍需要開發(fā)許多策略來改善小核酸藥物的成藥性、體內(nèi)代謝穩(wěn)定性和細胞內(nèi)遞送的有效性。

圖2 NAFLD治療的相關(guān)藥物遞送系統(tǒng)