呂一舟，劉珍秀，潘興學(xué)，王文麗，張為民，宋曉平，麻武仁，劉迎秋，范云鵬

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

規(guī)?；B(yǎng)殖中動(dòng)物免疫抑制性疾病已普遍存在[1-4]，免疫抑制性疾病可破壞淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等，使動(dòng)物免疫系統(tǒng)受損、抗病能力降低，從而導(dǎo)致條件性致病菌感染，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。朱砂七是蓼科蓼屬植物毛脈蓼根的塊莖，味苦，微澀，性涼。有清熱解毒、止血止瀉功效[5-6]，朱砂七多糖(Polygonumcillinervepolysaccharide,PCP)是其主要有效成分之一。中藥多糖具有抗氧化[7-8]、抗腫瘤[9]、抗病毒[10]、免疫調(diào)節(jié)[11-12]等多種生物活性。本課題組前期進(jìn)行了PCP的提取純化、結(jié)構(gòu)鑒定等，并初步證明朱砂七多糖具有抗氧化活性[6]。PCP對臨床分離的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和沙門氏菌具有一定的抑制效果，但對其免疫活性的相關(guān)研究較少。本研究采用MTT法、ELISA等方法，分別檢測PCP對雞外周血淋巴細(xì)胞和小鼠脾淋巴細(xì)胞的毒性、細(xì)胞增殖及小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ細(xì)胞因子的影響，為朱砂七多糖免疫增強(qiáng)活性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 朱砂七多糖(含量87.2%)，西北農(nóng)林科技大學(xué)中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室制備；肝素鈉、淋巴細(xì)胞分離液、1640培養(yǎng)液、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、刀豆蛋白(Con A)、脂多糖和青鏈霉素均為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司產(chǎn)品；二甲基亞砜(DMSO)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；ELISA(IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ)試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司產(chǎn)品；200目細(xì)胞篩，美國Biologix公司產(chǎn)品。

1.1.2 試驗(yàn)用動(dòng)物 成年公雞，西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。SPF級昆明小鼠，20 g～25 g，雌雄各半，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.3 主要儀器 MCO-18AC二氧化碳培養(yǎng)箱，普和系株式會(huì)社產(chǎn)品；CKX31SF倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司產(chǎn)品；YT-CJ-2N超凈臺(tái)，北京亞泰科隆儀器技術(shù)公司產(chǎn)品；TDL-80-2B離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器公司產(chǎn)品；FC酶標(biāo)儀，美國Thermo公司產(chǎn)品；LDZX-50KBS立式壓力滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海中器實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 液體配制 Hank's液，先配制A液和B液。A液：稱取KCl 8 g、NaCl 160 g、MgCl2·6H2O 2 g、MgSO4·7H2O 2 g，溶解于800 mL雙蒸水中，與100 mL 2.8% CaCl2溶液混合，加水至1 000 mL，115℃滅菌15 min，4℃保存；B液：稱取KH2PO41.2 g、Na2HPO4·12H2O 3.04 g、葡萄糖 20 g，溶解到800 mL雙蒸水中，與100 mL 0.4%酚紅溶液混合，加水至1 000 mL 108℃滅菌15 min，4℃保存。取A液及B液各1份與18份雙蒸水混合即得Hank′s液，配好后108℃高壓滅菌15 min。臨用前用56 g/L NaHCO3調(diào)pH為7.2～7.4，加青霉素、鏈霉素各100 IU/mL。細(xì)胞培養(yǎng)液：在所用的1640培養(yǎng)基中添加100 mL/L胎牛血清。

1.2.2 雞外周血淋巴細(xì)胞和小鼠脾淋巴細(xì)胞的制備 從雞心臟采血10 mL至含有肝素鈉(2 mg/mL)的注射器中，與Hank′s等比混勻，加入等體積淋巴細(xì)胞分離液至上層，2 500 r/min離心20 min。吸取中間的云霧層于另一離心管中，并與等體積的Hank′s液混勻，2 000 r/min離心15 min。棄去上清液，加入2 mL Hank′s液，2 000 r/min離心10 min。棄去上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，得雞外周血淋巴細(xì)胞懸液。取小鼠脾臟置200目細(xì)胞篩上研磨，用Hank′s液沖洗。在離心管中提前加入4 mL的淋巴細(xì)胞分離液，取4 mL研磨好的脾臟組織懸液，緩慢地沿管壁加入到分離液的上層，2 500 r/min離心20 min。吸取中間的云霧層，后續(xù)步驟與上述方法一致，得小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液。

1.2.3 PCP對雞外周血淋巴細(xì)胞的毒性 將PCP用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋為31.25、15.63、7.81、3.91、1.95 μg/mL，后面的試驗(yàn)均按此方法配藥。將雞外周血淋巴細(xì)胞(1×106個(gè)/mL)，接種到96孔板中，100 μL/孔。試驗(yàn)分2組，對照組每孔加細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL；試驗(yàn)組每孔各加不同濃度的PCP 100 μL，做4個(gè)重復(fù)。置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。提前4 h向每孔中加MTT 30 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去部分培養(yǎng)基，每孔加DMSO 100 μL，振蕩10 min，在570 nm處檢測OD值。

1.2.4 MTT法檢測雞外周血T淋巴細(xì)胞增殖 將雞外周血淋巴細(xì)胞懸液以80 μL/孔 接種到96孔板中。設(shè)空白對照組每孔加細(xì)胞培養(yǎng)液120 μL，陽性對照組每孔加Con A(10 μg/mL)20 μL+細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL，試驗(yàn)組每孔加Con A 20 μL+各濃度PCP 100 μL，4個(gè)重復(fù)。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。后續(xù)步驟與上述試驗(yàn)一致，570 nm處檢測OD值。

1.2.5 MTT法檢測PCP對小鼠脾淋巴細(xì)胞的毒性 將小鼠脾淋巴細(xì)胞接種到96孔板中，100 μL/孔。試驗(yàn)分2組，對照組每孔加細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL；試驗(yàn)組每孔加各濃度的PCP 100 μL，做6個(gè)重復(fù)。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。后續(xù)步驟與上述試驗(yàn)一致，在570 nm處檢測OD值。

1.2.6 PCP對小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖的影響 將小鼠脾淋巴細(xì)胞接種到96孔板中，80 μL/孔。試驗(yàn)分3組：空白對照組加細(xì)胞培養(yǎng)液120 μL；陽性對照組每孔加Con A 20 μL+細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL；試驗(yàn)組每孔加Con A 20 μL+各濃度PCP 100 μL，做4個(gè)重復(fù)。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。后續(xù)步驟與上述試驗(yàn)一致，在570 nm處檢測OD值。

1.2.7 PCP對小鼠脾B淋巴細(xì)胞增殖的影響 將小鼠脾淋巴細(xì)胞接種到96孔板中，80 μL/孔。試驗(yàn)分3組：空白對照組加細(xì)胞培養(yǎng)液120 μL；陽性對照組每孔加LPS(10 μg/mL)20 μL+細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL；試驗(yàn)組每孔加LPS 20 μL+各濃度PCP 100 μL，做4個(gè)重復(fù)。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。后續(xù)步驟與上述試驗(yàn)一致，在570 nm處檢測OD值。

1.2.8 ELISA檢測IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ水平 將小鼠脾淋巴細(xì)胞接種到24孔板中，800 μL/孔。設(shè)3個(gè)組：空白對照組每孔加細(xì)胞培養(yǎng)液1.2 mL；陽性對照組每孔加Con A 200 μL+細(xì)胞培養(yǎng)液1 mL；試驗(yàn)組每孔加Con A 200 μL+各濃度的PCP 1 mL。置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞上清，按IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ試劑盒說明進(jìn)行操作，450 nm處檢測各OD值，計(jì)算IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ含量。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 23.0分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示，組間比較用單因素方差分析，以Duncan′s法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。不同字母代表差異顯著(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 PCP對雞外周血淋巴細(xì)胞的毒性

PCP在15.63、7.81、1.95 μg/mL時(shí)，OD值均高于空白對照組，其中在7.81 μg/mL時(shí)差異顯著(P<0.05)，在15.63 μg/mL和1.95 μg/mL差異不顯著(P>0.05)。31.25 μg/mL和3.91 μg/mL的OD值低于空白對照組，差異不顯著(P>0.05)。表明PCP在1.95 μg/mL～31.25 μg/mL對雞外周血淋巴細(xì)胞沒有毒性，且在7.81 μg/mL時(shí)可顯著促進(jìn)雞外周血淋巴細(xì)胞的增殖(圖1)。

圖1 PCP對雞外周血淋巴細(xì)胞的毒性試驗(yàn)(n=4)

2.2 MTT法檢測雞外周血T淋巴細(xì)胞的增殖

PCP在31.25、7.81、3.91、1.95 μg/mL時(shí)OD值均顯著高于空白對照組(P<0.05)。 PCP在7.81 μg/mL時(shí)OD值顯著高于Con A單獨(dú)刺激組(P<0.05)，31.25、3.91和1.95 μg/mL的OD值高于Con A單獨(dú)刺激組，但差異不顯著(P>0.05)。表明PCP能夠協(xié)同Con A促進(jìn)雞外周血T淋巴細(xì)胞的增殖(圖2)。

圖2 PCP對雞外周血T淋巴細(xì)胞增殖的影響(n=4)

2.3 MTT法檢測PCP對小鼠脾淋巴細(xì)胞的毒性

PCP在1.95 μg/mL～7.81 μg/mL時(shí)OD值均高于空白對照組，其中1.95 μg/mL時(shí)差異顯著(P<0.05)。表明PCP濃度在1.95～31.25 μg/mL范圍內(nèi)對小鼠脾淋巴細(xì)胞無毒性(圖3)。

圖3 PCP對小鼠脾淋巴細(xì)胞毒性試驗(yàn)(n=6)

2.4 PCP對小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖的影響

不同濃度的PCP協(xié)同Con A時(shí)，PCP為1.95 μg/mL～31.25 μg/mL時(shí)的OD值與Con A單獨(dú)刺激相比，顯著升高(P<0.05)。表明在1.95 μg/mL～31.25 μg/mL范圍內(nèi)，PCP協(xié)同Con A可以顯著促進(jìn)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的增殖(圖4)。

圖4 PCP對小鼠脾T淋巴細(xì)胞增殖的影響(n=4)

2.5 PCP對小鼠脾B淋巴細(xì)胞增殖的影響

不同濃度的PCP與LPS共同刺激時(shí)，PCP在1.95 μg/mL～31.25 μg/mL范圍內(nèi)的OD值與LPS單獨(dú)刺激相比，顯著升高(P<0.05)。表明PCP在1.95 μg/mL～31.25 μg/mL范圍內(nèi)可以顯著促進(jìn)小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞的增殖(圖5)。

圖5 PCP對小鼠脾B淋巴細(xì)胞增殖的影響(n=4)

2.6 PCP對IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ分泌的影響

PCP為1.95 μg/mL～31.25 μg/mL時(shí)，IL-2分泌量均高于Con A組和空白對照組，PCP為3.91、7.81、15.63、31.25 μg/mL時(shí)，IL-2分泌量顯著高于Con A單獨(dú)刺激組和空白對照組(P<0.05)。表明PCP在3.91 μg/mL～31.25 μg/mL范圍內(nèi)可顯著促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌IL-2(圖6A)。

PCP濃度在7.81 μg/mL和31.25 μg/mL時(shí)，IL-4分泌量高于Con A組和空白對照組，但差異不顯著(P>0.05)。濃度在1.95、3.91、15.63 μg/mL時(shí)，IL-4分泌量低于Con A單獨(dú)刺激組和空白對照組，差異不顯著(P>0.05)。表明PCP在1.95 μg/mL～31.25 μg/mL時(shí)對IL-4的分泌無顯著促進(jìn)作用(圖6B)。PCP在1.95 μg/mL～31.25 μg/mL時(shí)，IL-10分泌量與Con A組和空白對照組相比，均顯著增加(P<0.05)。表明PCP在上面濃度范圍內(nèi)協(xié)同Con A可以促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-10(圖6C)。PCP在15.63 μg/mL時(shí)，IFN-γ高于空白對照，但差異不顯著(P>0.05)。與Con A組相比，PCP在1.95 μg/mL～31.25 μg/mL時(shí)，IFN-γ分泌量均顯著增加(P<0.05)。表明PCP在1.95 μg/mL～31.25 μg/mL范圍內(nèi)對小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ有明顯促進(jìn)作用(圖6D)。

A.PCP對IL-2分泌的影響(n=4)；B.PCP對IL-4分泌的影響(n=4)；C.PCP對IL-10分泌的影響(n=4)；D.PCP對IFN-γ分泌的影響(n=6)

3 討論

T淋巴細(xì)胞的增殖常被用于研究藥物活性[13]。本文PCP濃度為1.95 μg/mL～31.25 μg/mL時(shí)，對雞外周血淋巴細(xì)胞無毒性，且在7.81 μg/mL時(shí)，可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖。表明PCP對雞外周血淋巴細(xì)胞增殖有一定的促進(jìn)作用。脾臟中有T和B兩種淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞在體外受到刺激物刺激后，會(huì)向淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖。刀豆蛋白(Con A)和植物血凝素(PHA)在體外可以刺激T淋巴細(xì)胞增殖，脂多糖(LPS)能夠刺激B淋巴細(xì)胞增殖[15]。淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率和增殖水平反應(yīng)機(jī)體的免疫功能強(qiáng)弱，可作為測定機(jī)體免疫功能的一個(gè)指標(biāo)[14]。從雞骨草中提取的多糖在125 μg/mL～375 μg/mL可劑量依賴性的促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞增殖[15]；將10 μg/mL濃度的苜蓿多糖作用于淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，B淋巴細(xì)胞增殖效果最好[16]。本研究PCP濃度在1.95 μg/mL～31.25 μg/mL時(shí)，T淋巴細(xì)胞增殖顯著高于Con A組，B淋巴細(xì)胞的增殖顯著高于LPS組，表明PCP對脾淋巴細(xì)胞的增殖具有較好的促進(jìn)作用。

活化的T細(xì)胞可以產(chǎn)生IFN-γ多效性細(xì)胞因子，具有抗癌和抗感染的作用，在炎癥調(diào)節(jié)中具有促炎和抗炎的雙重作用[17]，常以IFN-γ評估T細(xì)胞的活化程度。IL-2由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，具有免疫增強(qiáng)作用，促進(jìn)IL-2的分泌可以有效控制受感染個(gè)體的病毒血癥[18]。從軟紫草根中提取的多糖在40 μg/mL和200 μg/mL能促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ[19]；蛹蟲草多糖和Con A協(xié)同可刺激小鼠脾臟中的淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-2。本研究PCP濃度為1.95 μg/mL～31.25 μg/mL時(shí)能顯著促進(jìn)IL-2的產(chǎn)生。

Th2細(xì)胞可以分泌抗炎因子IL-10，其能有效抑制IL-2和IFN-γ的合成和T細(xì)胞增殖。IL-10可防止過度的免疫應(yīng)答，能協(xié)同IL-4和TGF-β抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放NO。IL-10也能夠促進(jìn)B細(xì)胞增殖和自身抗體的產(chǎn)生。紫草、魚腥草、柴胡和杜仲多糖在體外可以外周血單核細(xì)胞(PBMC)分泌IL-10。本研究PCP濃度為1.95 μg/mL～31.25 μg/mL時(shí)，對IL-10和IFN-γ的生成有明顯的促進(jìn)作用，但對IL-4的生成無明顯促進(jìn)作用。

本研究表明，PCP為1.95 μg/mL～31.25 μg/mL時(shí)對雞外周血淋巴細(xì)胞和小鼠脾淋巴細(xì)胞沒有毒性，濃度為7.81 μg/mL時(shí)可顯著促進(jìn)雞外周血淋巴細(xì)胞增殖。濃度為1.95 μg/mL～31.25 μg/mL時(shí)，能協(xié)同Con A促進(jìn)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖，協(xié)同LPS促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖，濃度為3.91 μg/mL～31.25 μg/mL時(shí)，可以顯著促進(jìn)IL-2的分泌，在1.95 μg/mL～31.25 μg/mL可顯著促進(jìn)細(xì)IL-10和IFN-γ的分泌，表明朱砂七多糖在體外具有較好的免疫增強(qiáng)活性。