嚴杜建，安利彥，謝丹陽，李高蕓，林彭楚彬，吳晨晨*

(1.阿克蘇職業(yè)技術學院，新疆阿克蘇 843000；2.西北農林科技大學動物醫(yī)學院，陜西楊凌 712100；3.新疆農業(yè)大學動物科學學院，新疆烏魯木齊 830000)

內毒素(endotoxin)是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的一種成分，也叫脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，也是其他微生物(如立克次氏體、衣原體、螺旋體等)細胞璧中的結構成分。脂多糖分為3部分，“O”特異性側鏈(也稱“O”抗原)、核心多糖及類脂體A，類脂體A作為脂多糖的毒性成分在內毒素免疫中起了重要的作用。內毒素一方面會直接影響動物繁殖性能，使動物胚胎早期死亡、發(fā)育緩慢，產出的胎兒體質差、死亡率高等；另一方面會通過發(fā)生一系列的免疫反應，間接影響畜禽繁殖性能。有關內毒素的研究主要集中于免疫性能的影響。本次試驗以小鼠為模型，旨在研究內毒素對雌性小鼠繁殖性能的影響，為減少生產中畜禽體內內毒素對其繁殖性能的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8周齡體重30 g左右的昆明小鼠，雌性30只，雄性15只，購于西安交通大學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑和儀器 脂多糖，西格瑪奧德里奇貿易有限公司產品；小鼠分泌性免疫球蛋白A(sIgA)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、小鼠脂多糖(LPS)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、小鼠促卵泡素(FSH)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、小鼠促黃體生成素(LH)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、小鼠雌二醇(E2)和孕酮(P4)酶聯(lián)免疫分析試劑盒均為晶美公司產品；全波段酶標儀為Tecan公司產品。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物的分組和樣品收集 所有小鼠在購入后適應環(huán)境7 d，然后將雌性小鼠分為對照組15(0.01 mol/L PBS)，染毒組15只(LPS 1 mg/kg)進行灌胃處理。灌胃內毒素第8天將雌性小鼠與正常雄性小鼠合籠并確定妊娠情況。小鼠分籠后開始記錄雌性小鼠的采食量和體重。雌性小鼠分娩后5 d和15 d，記錄仔鼠存活率、體長、窩重、畸形和死胎等；并收集母鼠血液、子宮、回腸、結腸和仔鼠的腸道，快速冷凍于液氮中，置-80℃保存用于ELISA檢測LPS和sIgA,收集血清用ELISA的方法檢測生殖激素E2、P4、FH和FSH。

1.2.2 ELISA檢測 在收集到的子宮、回腸、結腸和仔鼠腸道中分別加入1 mL的PBS(pH=7.4)，用勻漿器將標本勻漿充分，置于2 mL的離心管中離心25 min (3 000 r/min)，收集上清液于另一干凈離心管中備用。將收集的血清從4℃冰箱中取出，備用，后續(xù)操作方法見試劑盒說明書。

1.2.3 統(tǒng)計分析 用GraphPad Prism 8計算并檢驗(t檢驗)組間數據的顯著性，數據以Mean±SD表示。結果中P值小于0.05差異顯著(*P<0.05)，P值小于0.01差異極顯著(**P<0.01)。

2 結果

2.1 內毒素對雌性小鼠繁殖性能指標的影響

雌性小鼠妊娠期間每日平均采食量與平均體重呈現(xiàn)逐步增長的狀態(tài)。對照組與染毒組的平均體重差異不顯著(P>0.05)；對照組的平均采食量顯著高于染毒組(P<0.05)(圖1)。分娩后5 d，染毒組新生仔鼠的死亡率顯著低于對照組(P<0.05)， 染毒組雌性小鼠新生仔鼠數量、新生仔鼠體重與對照組之間無顯著性差異(P>0.05)，對照組仔鼠平均出生體長顯著性的高于染毒組(P<0.05)(圖2)。

A.母鼠平均體重對比；B.平均體重變化趨勢；C.母鼠每日平均采食量對比；D.母鼠平均每日采食量變化趨勢

圖2 新生仔鼠死亡率(A)，雌性小鼠的產仔數(B)，仔鼠平均出生體重(C)，仔鼠平均初生體長(D)

2.2 內毒素對母鼠和仔鼠體內組織LPS與sIgA的影響

分娩后5 d，結腸中的LPS含量，對照組結腸、回腸和子宮組織LPS的含量與染毒組無顯著性差異(P>0.05)；仔鼠腸道的LPS含量，染毒組極顯著高于對照組(P<0.01)。分娩后15 d，結腸中的LPS含量，對照組結腸、回腸和子宮組織LPS的含量顯著高于染毒組(P<0.05)；仔鼠腸道的LPS含量，染毒組極顯著高于對照組(P<0.05)。分娩后5 d，結腸中的sIgA含量，對照組結腸和子宮組織sIgA含量與染毒組無顯著性差異(P>0.05)；回腸中的sIgA含量，染毒組極顯著高于對照組(P<0.01)。分娩后15 d，對照組結腸和回腸的sIgA含量與染毒組無顯著性差異(P>0.05)；子宮中的sIgA含量，對照組極顯著高于染毒組(P<0.01)；仔鼠腸道中的sIgA含量，染毒組極顯著高于對照組(P<0.01)(圖3)。

圖3 分娩后5 d和15 d對照組與染毒組小鼠各組織的LPS和sIgA含量

2.3 內毒素對母鼠生殖激素水平的影響

分娩后5 d，血清中E2和P4的含量，對照組與染毒組差異不顯著(P>0.05)；血清中的LH含量，對照組顯著高于染毒組(P<0.05)；血清中的FSH含量，對照組顯著高于染毒組(P<0.05)。分娩后15 d，血清中E2和P4的含量，對照組與染毒組差異不顯著(P>0.05)；血清中的LH含量，對照組顯著高于染毒組(P<0.05)；血清中的FSH含量，對照組顯著高于染毒組(P<0.05)(圖4)。

A.分娩5 d和15 d后E2含量；B.分娩5 d和15 d后P4含量；C.分娩5 d和15 d后LH含量；D.分娩5 d和15 d后FSH含量

3 討論

內毒素干預雌性小鼠會使卵母細胞和胚胎發(fā)育產生不良影響[1]。本試驗發(fā)現(xiàn)對照組仔鼠出生后5 d和15 d對照組存活率顯著高于染毒組。分娩后5 d，染毒組仔鼠存活率差和仔鼠呈弱胎。內毒素進入小鼠體內后，蓄積在腸道中，當一定量時突破腸道屏障，進入循環(huán)系統(tǒng)。隨著血液的循環(huán)卵泡發(fā)育受到影響，卵子排出困難，受孕率下降。內毒素的免疫刺激下，所產生的免疫應答在某些方面也會改變機體的代謝，飼料利用率下降[2]。內毒素作用下小鼠的采食量下降、飼料利用率下降，間接導致小鼠繁殖性能下降[3]。本試驗通過ELISA檢測雌性小鼠在分娩后5 d和15 d的生殖激素水平，染毒組的E2含量和P4含量相較于對照組無顯著差異，而FSH與LH的含量顯著高于對照組。生殖激素促進生殖器官的發(fā)育成熟，包括卵子的產生、排出、精子的產生、受精、著床、妊娠及泌乳等一系列生殖過程。LPS對卵巢顆粒細胞具有增促作用，而E2和P4與卵巢顆粒細胞關系非常密切，顆粒細胞會分泌雌激素，然后促進雌性動物發(fā)情和卵泡生長，形成黃體后能夠分泌孕激素，維持妊娠[4]。LPS會通過下丘腦-垂體-性腺軸，使正常的激素調控發(fā)生紊亂，影響性腺功能，同時抑制E2、FSH、LH的分泌，促進P4分泌。50 μg/mL的LPS濃度下能促進雌激素的合成和分泌[5]。本研究注射0.3 mL的1 mg/kg LPS溶液產生的影響，結果與相關研究有部分差異，其中是否是劑量的原因有待進一步探究。

仔鼠的回腸中，染毒組LPS的含量極顯著高于對照組，說明胚胎在子宮中發(fā)育時受到了內毒素的影響。分娩后5 d，雌性小鼠的結腸和回腸中LPS含量都高于對照組，表明內毒素進入機體后，會在腸道內蓄積，當腸道內毒素蓄積過多就會突破腸道屏障，進入循環(huán)系統(tǒng)。分娩后15 d，母鼠子宮中的LPS含量升高，這是由于內毒素已經穿過腸道屏障侵入到其他的組織器官中蓄積到了子宮中[6]。內毒素入侵機體直接影響到免疫系統(tǒng)，所以sIgA的變化與LPS的含量有關。胎兒在子宮內發(fā)育成熟離開母體后，便暴露于存在著許多抗原的環(huán)境中。胎兒出生后，必須從母體那里獲得被動免疫(即免疫球蛋白)，在本試驗中，分娩后5 d，染毒組結腸、回腸、仔鼠腸道sIgA的含量高于對照組，在回腸和仔鼠腸道差異極顯著；分娩后15 d，sIgA的含量呈下降趨勢；雌性小鼠的子宮中，sIgA從分娩后5 d到15 d呈現(xiàn)上升的趨勢。結合LPS含量的變化，可能是因為腸道內的LPS含量減少，使機體免疫應答正在逐漸減弱，腸黏膜中主要的免疫球蛋白-腸黏膜第一道防線的sIgA含量也隨之降低[7-9]。進而也可以推斷，仔鼠腸道內的sIgA大多是從胎盤傳遞而來，后期的哺乳會傳遞一部分免疫球蛋白，子宮中內毒素含量越來越高，也就導致了子宮的sIgA含量逐步升高。

綜上所述，給小鼠注射0.3 mL的1 mg/kg的LPS溶液時，會使小鼠采食量和體重下降，出現(xiàn)難產，產出弱胎、死胎、畸形胎等，嚴重影響了小鼠的繁殖性能。此外，sIgA的濃度隨著LPS含量的變化而改變，當LPS含量高時，sIgA的含量也有一定的升高(激活了免疫應答)，間接的影響了小鼠的繁殖性能。其中染毒組FSH與LH的含量分泌紊亂進一步加劇繁殖性能的降低。但LPS如何致小鼠繁殖性能降低的發(fā)病機理還有待進一步深入研究。