鄒盛勤，梅應(yīng)軒，陳 琴，翁紹圳，杜裕華

(1.宜春學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 336000；2.江西省天然藥物活性成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 宜春 336000；3.宜春職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部，江西 宜春 336000)

中藥是中華民族的瑰寶，在控制和治療非典型性肺炎(SARS)、新型冠狀肺炎疫情中均發(fā)揮了很好的作用，而由中藥連翹為組方的連花清瘟和金花清感就是其中具有代表性的良方。連翹(Forsythiasuspensa)是木犀科連翹屬植物，其藥用部位為干燥的果實(shí)，[1]有疏風(fēng)熱、消散結(jié)、清熱解毒等諸多功效，臨床上經(jīng)常用于治療癰腫瘡毒、風(fēng)熱感冒等病癥。[2-3]連花清瘟處方由連翹、金銀花、廣藿香和魚腥草等13味中藥組成。[4]金花清感由銀翹散和麻杏石甘湯化裁制成。[5-6]連翹中主要含有有苯乙醇苷類、木脂素類、三萜類、黃酮類、有機(jī)酸類、酚類、醌類等化學(xué)成分。[7-8]已知連翹的藥理學(xué)活性主要體現(xiàn)在抗細(xì)菌、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等方面。[1]胡金婉等[9]采用HPLC法測定了13批連翹中蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷、齊墩果酸和熊果酸5種主要活性成分的含量，并對測定結(jié)果進(jìn)行了聚類分析，證實(shí)不同產(chǎn)地或同一產(chǎn)地青翹老翹中主要活性成分的含量存在差異。郭婷等[10]采用乙醇冷浸，乙酸乙酯萃取，柱色譜分離了乙酸乙酯部位化學(xué)成分，鑒定出白樺脂酸、熊果酸、齊墩果酸和methyl-3α-hydroxyolean-18-ene-28-oate等4個三萜類化合物。李曉[11]等采用乙醇提取，活性炭脫色，大孔樹脂富集，從連翹葉中分離純化得到了純度可達(dá)96%的熊果酸，方法得率較高。連花清瘟等處方中多味中藥均含有三萜類成分，而同時定量分析連翹中三萜類4組分樺木腦(Betulin，Bet)、樺木酸(Betulinic acid，BA)、齊墩果酸(Oleanolic acid，OA)和熊果酸(Ursolic acid，UA)鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用RP-HPLC法對連翹中Bet、BA、OA和UA進(jìn)行了含量測定，為連翹中三萜類藥效成分的定量分析和含量比較提供了有效的方法。

1 材料

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀(515泵，2996檢測器，Empower工作站)；HP-DR05高純水機(jī)(上海廣創(chuàng)通用設(shè)備有限公司)；CP225D準(zhǔn)微量天平(德國賽多利斯公司)；超聲波清洗器(江西華特精密儀器有限公司)。

1.2 試藥

甲醇為色譜純(J&K SCIENTIFIC LTD.)，水為超純水。白樺脂醇對照品(批號B129169，阿拉丁)，白樺脂酸對照品(批號10039-200812，南昌貝塔生物科技有限公司)，齊墩果酸對照品(批號110709-201106，中國食品藥品檢定研究院)，熊果酸對照品(批號110742-201304，中國食品藥品檢定研究院)。連翹藥材經(jīng)鑒定為木犀科連翹屬植物連翹(Forsythiasuspensa)的干果。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及對照品出峰時間

采用C18RP色譜柱；流動相為甲醇∶水=87∶13，流動相的流速為0.6mL·min-1，檢測波長210nm，手動進(jìn)樣，色譜柱的柱溫30℃，記錄的HPLC圖譜如圖1、圖2所示。4種三萜類成分分離良好，分離度均大于1.5，且色譜峰峰形對稱。

圖1 混合對照品色譜圖

圖2 連翹樣品色譜圖

2.2 檢測波長選擇

分別吸取適量制備好的混合對照品溶液和樣品溶液，按照上述的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析檢測，在180～500nm波長范圍內(nèi)掃描的紫外吸收，得到設(shè)定波長范圍內(nèi)的紫外吸收曲線(圖3)。因考慮到需同時檢測4個三萜類成分，根據(jù)吸收曲線顯示，在210nm處4種成分的吸收峰能信噪比較好，所以選擇210.0nm作為本實(shí)驗(yàn)的檢測波長。

圖3 對照品的紫外吸收光譜

2.3 溶液制備

2.3.1 混合對照品溶液的制備

用電子天平精密稱量對照品Bet4.71mg、BA4.36mg、OA3.34mg和UA4.91mg，放入5mL的容量瓶中，加入95%乙醇定容至刻度線，搖晃混勻。得到Bet的質(zhì)量濃度為0.942mg/mL，BA的質(zhì)量濃度為0.872mg/mL，OA的質(zhì)量濃度為0.668mg/mL，UA的質(zhì)量濃度為0.982mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。

2.3.2 待測樣品溶液的制備

將4種連翹樣品放入烘箱中60℃中烘干5h，取出冷卻后用粉碎機(jī)磨成粉末，用電子天平分別稱取四川青翹2.5029g，四川老翹2.4935g，秦嶺青翹2.5601g，秦嶺老翹2.4971g，將樣品放入錐形瓶，準(zhǔn)確量取50mL的95%的乙醇加入再混合均勻，超聲波提取30min，超聲后冷卻后用0.45μm濾膜過濾，裝入進(jìn)樣瓶中得到樣品溶液。

2.4 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.4.1 線性關(guān)系考察

向高效液相色譜儀中手動進(jìn)樣1μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl上述配制的對照品溶液，用上述色譜條件進(jìn)樣測定樣品的吸收峰面積，以混合對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，分別繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)(r)和線性范圍。[12]見表1。

表1 回歸方程與線性關(guān)系

2.4.2 系統(tǒng)適用性考察

將上述的混合對照品溶液、樣品溶液及加樣回收溶液按照上述的色譜條件進(jìn)樣，每次5μl，然后計(jì)算進(jìn)樣試液中Bet、BA、OA、UA所對應(yīng)的吸收峰面積，計(jì)算出峰面積或含量RSD。由數(shù)據(jù)分析可以得知，檢測儀器的精密度、重復(fù)性和加樣回收率均符合定量分析要求(表2)。

表2 方法適應(yīng)性考察(%)

2.4.3 樣品含量測定

精密進(jìn)樣5μl上述制備的連翹樣品溶液，使用相同的色譜條件測定連翹樣品溶液中Bet、BA、OA和UA的吸收峰面積，然后計(jì)算出各個成分的含量。見表3。

表3 連翹樣品測定結(jié)果(%)

3 討論

連翹中三萜類4組分因產(chǎn)地和采摘時間不同而含量有些不同。[13]秦嶺的青翹三萜類4組分含量高于四川青翹；秦嶺老翹與四川老翹相比Bet、BA含量高，UA、OA的含量低，特別是UA含量相差很大。秦嶺青翹與老翹相比Bet、OA含量高，BA、UA含量低。四川產(chǎn)青翹和老翹相比BA、OA、UA含量低，而青翹中Bet含量未檢出。建立的RP-HPLC法能有效分離極性相近的三帖類成分，分離度適合定量分析要求，且通過紫外光譜識別可增強(qiáng)方法的定性分析能力，適用于中藥連翹中三萜類成分的分析。

曹冉冉[14]等學(xué)者研究了不同連翹的有效成分含量，結(jié)果表現(xiàn)是青翹的有效成分含量普遍高于老翹，而傳統(tǒng)觀念上認(rèn)為老翹的藥效即藥品質(zhì)量要高于青翹，可能產(chǎn)地不同各有差異。但老翹在臨床的應(yīng)用更加廣泛，影響這兩者區(qū)別的具體原因還未知，化學(xué)成分的穩(wěn)定性等方面是否影響了連翹的藥效，這些問題還有待進(jìn)一步考證。