谷仿麗，黃仁術，何曉梅，陳乃東，韓邦興，陳乃富

(1.皖西學院 生物與制藥工程學院；2.安徽省中藥資源保護與持續(xù)利用工程實驗室，安徽 六安 237012)

炎癥是機體免疫系統(tǒng)對感染、傷害或刺激作出的自我防御過程，[1]不同病因可損傷機體不同部位，引起諸如過敏性疾病、胃炎、關節(jié)炎、動脈粥樣硬化、癌癥等疾病。[2]抗炎藥物可有效緩解炎癥癥狀，主要包括非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、腫瘤壞死因子抑制劑及中草藥提取物等，[3]非甾體抗炎藥可損害胃粘膜、睪丸粘膜、升高血壓，引發(fā)潰瘍、中風和心力衰竭等疾?。籟4-7]糖皮質(zhì)激素由于產(chǎn)生如骨質(zhì)疏松癥、高血糖、胰島素抵抗、高血壓等副作用，使用受到了限制；[8]中藥有效成分如多糖、生物堿、黃酮等已被證明具有較好的抗炎作用，且毒副作用小，[9-10]具有較好的應用前景。

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng)屬于傳統(tǒng)名貴中藥材，主產(chǎn)于安徽省霍山縣及周邊地區(qū)，生長條件極為苛刻，含有多糖、石斛堿、多酚及多種微量元素等，[11]研究表明霍山石斛具有抗腫瘤、抗氧化、保肝、調(diào)節(jié)免疫等作用。[12-13]戴瑋等研究發(fā)現(xiàn)霍山石斛多糖具有體外抗炎作用，[14-15]但其體內(nèi)抗炎作用未見報道。本課題組前期將新鮮霍山石斛粉碎成汁、離心取上清液灌胃小鼠，發(fā)現(xiàn)可以降低小鼠足腫脹度，表明霍山石斛具有抗炎作用，但哪種成分起到抗炎作用？為此，本課題擬用小鼠足腫脹模型，篩選霍山石斛抗炎的有效部位，為霍山石斛的進一步開發(fā)應用打下基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

昆明種小鼠，清潔級，雌雄各半，體重20±2g，購自南京醫(yī)科大學動物實驗中心，許可證號：SCXK(蘇)2002—0031。整個實驗過程小鼠均正常飲食飲水。經(jīng)院實驗動物倫理委員會審批，每批小鼠實驗結(jié)束后施行安樂死。

1.2 藥物和試劑

霍山石斛采自皖西學院霍山石斛種植基地(經(jīng)皖西學院陳乃富教授鑒定為正品)，清洗，殺青，103℃烘干，粉碎過40目篩，繼續(xù)烘干至恒重，得干霍山石斛粉末，備用。COX-2、PGE2、IL--1β、TNF-α試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；角叉菜膠由美國Sigma公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：59C-2281；阿司匹林腸溶片由拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)，批準文號：國藥準字J20130078。阿司匹林片研成粉末，臨用前用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配制成一定濃度溶液備用。

1.3 實驗儀器

UV1902光束紫外可見分光光度計(上海奧析科學儀器有限公司)，Synergy H1多功能酶標儀(美國佰騰儀器有限公司)，MY-20手持式電動組織研磨器粉碎器(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)，等。

2 方法

2.1 霍山石斛抗炎有效成分篩選

2.1.1 霍山石斛水提物與乙醇提取物抗炎作用比較

取霍山石斛干粉100 g，平均分為2份，以1∶8料液比分別加入蒸餾水、75%乙醇800 mL，分別于65 ℃水浴中提取3 h，提取2次，合并濾液，減壓濃縮至相對密度1.15，冷凍干燥，粉碎干燥物，過100 目篩，得霍山石斛水提物11.234 g、醇提物8.267 g干粉。

取48只小鼠，隨機分為4 組，分別為空白對照組、阿司匹林陽性對照組、霍山石斛水提物及乙醇提取物組，小鼠按20 mL/kg等容量灌胃，分別給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃、阿司匹林300 mg/kg、霍山石斛組水提物100 mg/kg、霍山石斛醇提物100 mg/kg，1次/d，連續(xù)3d，于第4 d給藥30 min后每只小鼠右后足足跖皮下注射1%角叉菜膠0.1mL。用千分尺分別于造模前、后1、2、4、8 h分別測定右后足跖厚度(單位：mm)，以足腫脹度判斷藥物抗炎作用強弱。[16]足腫脹度=造模后足跖厚度—造模前足跖厚度。

2.1.2 霍山石斛水提物醇沉及醇溶部位抗炎作用比較

取霍山石斛干粉100 g，平均分為2份，以1∶8料液比分別加入蒸餾水800 mL，于65 ℃水浴中提取3 h，提取2次，合并濾液，減壓濃縮至提取物相對密度1.13，取出提取物，緩慢加入95%乙醇達溶液量的85%，邊加邊攪拌至均勻，保鮮膜封口，4 ℃冰箱保存24 h，4000轉(zhuǎn)離心10min，取沉淀物冷凍干燥；醇溶部位減壓濃縮至相對密度1.09，冷凍干燥；將干燥物粉碎，過100目篩，得霍山石斛水提物醇沉部位10.112 g、醇溶部位7.357 g干粉。

取48只小鼠，隨機分為4組，分別為空白對照組、阿司匹林陽性對照組、霍山石斛醇沉及醇溶物組，空白組及阿司匹林組給藥同2.1.1，霍山石斛組分別給予霍山石斛醇沉物100 mg/kg、醇溶物100 mg/kg灌胃，按2.1.1方法給藥、造模，計算足腫脹度。

2.1.3 霍山石斛水提物醇沉物及多糖抗炎作用比較

取霍山石斛干粉300 g，按2.1.2方法提取水提醇沉物61.332 g，取50 g醇沉物，以Sevag法去蛋白，纖維柱法分離、得精制多糖25.912 g，用蒽酮-硫酸法[17]測多糖含量，霍山石斛多糖(Dendrobiumhuoshanensepolysaccharide，DHP)類物質(zhì)為精制多糖提取物的67.33%。

取48 只小鼠，隨機分為4 組，分別為空白組、阿司匹林陽性對照組、霍山石斛醇沉組及多糖組，空白組及陽性藥物組同2.1.1，霍山石斛組分別給予霍山石斛醇沉物100 mg/kg、多糖100 mg/kg灌胃，按2.1.1方法給藥、造模，計算足腫脹度。

2.2 霍山石斛多糖抗急性炎癥作用研究

取小鼠60 只，隨機分為5 組，分別為空白對照組、阿司匹林陽性對照組，霍山石斛多糖(高、中、低)劑量組，空白組及陽性藥物組同2.1.1，霍山石斛多糖組分別給予霍山石斛多糖(200、100、 50mg/kg)灌胃，給藥時間及造模方法同2.1.1。于末次給藥后1 h 測量足腫脹值后摘眼球取血，ELISA法檢測環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase，COX-2)；自足踝上0.5 cm處剪下腫脹足跖，加入9 倍生理鹽水，用組織粉碎機粉碎為組織勻漿液，4000 轉(zhuǎn)離心10 min，取上清液，ELISA法檢測前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)、白介素-1β(Interleukin-1beta，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alph，TNF-α)水平。

2.3 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果與分析

3.1 霍山石斛水提物與乙醇提取物抗炎作用比較

結(jié)果如圖1。造模后，空白對照組小鼠足腫脹值在4 h達峰值，隨后緩慢降低。與空白對照組比較，霍山石斛水提物組、阿司匹林組在造模后1、2、4、8 h足腫脹度均顯著降低(P<0.05)，二者之間無顯著差異，霍山石斛醇提物組小鼠足腫脹度在各個時間點均低于空白組，但無顯著性差異(P>0.05)；霍山石斛水提物組足腫脹度顯著低于醇提物組(P<0.05)，表明霍山石斛水提物具有抗炎作用，醇提物無顯著抗炎作用。因此，課題組分離了霍山石斛水提物，尋找其抗炎有效部位。

圖1 霍山石斛水提物與醇提物抗炎作用

3.2 霍山石斛水提物醇沉及醇溶部位抗炎作用比較

水提物中的成分如色素、多糖、蛋白、淀粉等成分不溶于乙醇，因此，霍山石斛水提物溶液中加入乙醇，可將其分離為醇沉物和醇溶物。

結(jié)果如圖2。造模后空白組小鼠足腫脹表現(xiàn)出與3.1相同的規(guī)律性，表明角叉菜膠誘導的足腫脹模型比較穩(wěn)定。與空白組比較，霍山石斛水提醇沉物組、阿司匹林組在造模后的1、2、4、8 h足腫脹值均顯著降低(P<0.01或P<0.05)，二者之間無顯著差異，霍山石斛水提醇溶物組小鼠足腫脹值在各個時間點均低于空白組，但無顯著性差異(P>0.05)；霍山石斛醇沉物組足腫脹度顯著低于醇溶物組(P<0.05)，表明霍山石斛水提物中醇沉物具有抗炎作用，醇溶物未顯現(xiàn)出抗炎作用。因此，課題組進一步分離了霍山石斛水提物中的醇沉物，繼續(xù)尋找其抗炎有效部位。

圖2 霍山石斛水提醇沉物與醇溶物抗炎作用

3.3 霍山石斛水提物醇沉物及多糖抗炎作用比較

多糖類物質(zhì)不溶于乙醇，且霍山石斛中多糖含量較高，因此，課題組分離了醇沉物中的多糖類物質(zhì)與醇沉物比較抗炎作用優(yōu)劣。結(jié)果如圖3。造模后空白組小鼠足腫脹度顯著升高，表明造模成功。與空白組比較，霍山石斛水提物醇沉物組、多糖組、阿司匹林組在造模后1、2、4、8 h足腫脹值均顯著降低(P<0.01或P<0.05)，且霍山石斛多糖組足腫脹度顯著低于霍山石斛水提醇沉物組(P<0.05)；表明霍山石斛水提物中醇沉物、多糖均具有抗炎作用，多糖抗炎作用更佳。因此，霍山石斛多糖是霍山石斛抗炎的主要有效部位。

圖3 霍山石斛水提醇沉物與多糖抗炎作用

3.4 霍山石斛多糖抗急性炎癥作用研究

結(jié)果如表1?？瞻捉M小鼠足腫脹度、COX-2活性、組織PGE2、IL-1β、TNF-α水平顯著升高，表明小鼠急性炎癥模型成功。與空白組比較，霍山石斛多糖高、中劑量組、阿司匹林組足腫脹度顯著降低，COX-2活性顯著下降，組織PGE2、IL-1β、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)；表明霍山石斛多糖具有抗急性炎癥作用。

表1 霍山石斛多糖對急性炎癥小鼠的影響

4 討論

炎癥是機體受到損傷因子攻擊時產(chǎn)生的一種防御反應，其病理過程包括變質(zhì)、滲出、增生，由此引發(fā)局部的紅、腫、熱、痛及功能障礙。針對炎癥的病理過程，研究人員用二甲苯致動物耳腫脹、冰醋酸致動物腹腔毛細血管通透性、角叉菜膠(蛋清)誘導動物足跖腫脹模擬人體炎癥不同的病理階段，用以評價藥物的抗炎作用，已成為研究人員常用的經(jīng)典抗炎藥物篩選模型；其中角叉菜膠誘導的足腫脹模型常用于抗急性炎癥的藥物篩選。[18-19]因此，本課題采用足腫脹模型篩選霍山石斛抗急性炎癥的有效部位。

中藥傳統(tǒng)用藥方式是水煎煮，因此，本課題首先選用水提物與乙醇提取物進行抗炎作用比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水提物顯著降低小鼠足腫脹度，乙醇提取物組小鼠足腫脹度降低不明顯。為此，繼續(xù)探索了水提醇沉物與醇溶物對足腫脹小鼠的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水提醇沉物降低小鼠足腫脹度的效果優(yōu)于醇溶物；霍山石斛水提醇沉物含多糖類物質(zhì)較多，[19]因此，本課題將醇沉物去蛋白、柱層析分離精制霍山石斛多糖提取物(多糖類物質(zhì)含量大于60%)，并與醇沉物比較抗炎作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)霍山石斛多糖降低足腫脹度效果優(yōu)于醇沉物，表明霍山石斛多糖是霍山石斛抗炎作用的主要有效部位。

COX是炎癥介質(zhì)前列腺素生成的主要限速酶，藥物可通過抑制COX-1、COX-2活性而達到抗炎作用；因COX-1是生理型，能促進胃腸、腎等器官發(fā)育，因此，COX無選擇性抑制劑及COX-1抑制劑不良反應較多；[20-21]而COX-2是誘導型，在組織損傷、炎癥等情況下表達增強，因此，COX-2迅速成為抗炎藥物靶點，[22]但臨床研究發(fā)現(xiàn)化藥COX-2抑制劑可產(chǎn)生嚴重的心血管副作用，限制了其臨床應用。[23]植物病原氧化酶與人體COX-2有極高的同源性，植物在受到病原體攻擊時，其防御機制與哺乳動物相似。[24-25]因此，尋找天然衍生的COX-2抑制劑潛力無限。[26]為此，本課題基于抑制COX-2活性探討霍山石斛多糖抗急性炎癥療效。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，霍山石斛多糖可顯著抑制COX-2活性，降低模型小鼠的足腫脹度。炎癥狀態(tài)下，TNF-α分泌量增加，可引起PGE2、IL-1β等炎癥因子的瀑布式釋放，[27-28]可促進機體炎癥反應、組織損傷；[29]因此，降低IL-1β、TNF-α、PGE2等炎性介質(zhì)釋放，常作為評價藥物抗炎活性的重要指標。[30]本課題研究發(fā)現(xiàn)霍山石斛多糖能降低小鼠足腫脹度，降低炎癥因子IL-1β、TNF-α、PGE2的水平，抑制足腫脹小鼠COX-2活性，表明霍山石斛多糖具有較好的抗急性炎癥效果。

霍山石斛多糖主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖等組成，[31]具體是哪種單糖或不同比例單糖發(fā)揮主要抗炎作用？有待于進一步深入研究。