楊永強(qiáng) 李 娟 鐘海川 符芳輝

炎癥性腸病（IBD）是一種以慢性炎性反應(yīng)為特征的腸道疾病，包括克羅恩?。–D）和潰瘍性結(jié)腸炎（UC），其癥狀主要包括直腸出血、腹痛、腹瀉和疲勞，病情具有反復(fù)性，難以治愈[1]。IBD的病因目前尚未完全明確，可能與遺傳因素、免疫系統(tǒng)受損、環(huán)境誘導(dǎo)、腸道共生菌群變化等有關(guān)[2]。研究顯示，西方國(guó)家的IBD發(fā)病率已趨于穩(wěn)定，但發(fā)展中國(guó)家的IBD發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，目前IBD已成為消化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3]。因此，探究與IBD發(fā)病相關(guān)的分子機(jī)制具有重要意義。

多種miRNA在IBD的病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4-6]。楊文宏等[6]的研究顯示，miR-125b和miR-335在IBD患者的腸黏膜組織及血清中表達(dá)下調(diào)，其在血清中的表達(dá)水平與患者的疾病嚴(yán)重程度及活動(dòng)度密切相關(guān)。研究表明，miR-129不僅在多種腫瘤（骨肉瘤、鼻咽癌、結(jié)腸癌和肺癌等）的發(fā)病中發(fā)揮了作用，而且在癲癇、糖尿病、椎間盤退行性變、心力衰竭和肥胖癥等非惡性腫瘤疾病中也起著作用，并有潛力作為糖尿病、癲癇等疾病的生物標(biāo)志物[7]。程序性細(xì)胞死亡因子4（PDCD4）是一種抑癌基因，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)翻譯、炎性反應(yīng)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而IL-12、IL-2和IL-15等可調(diào)控PDCD4的表達(dá)水平[8]。Kim等[9]的研究表明，PDCD4在結(jié)直腸癌中低表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤分化程度及患者5年生存率有關(guān)，可以作為結(jié)直腸癌的預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)。目前關(guān)于IBD患者中miR-129和PDCD4表達(dá)水平的報(bào)道較少。本研究檢測(cè)了IBD患者腸黏膜組織中miR-129和PDCD4的表達(dá)水平，并分析了兩者的相關(guān)性，以及其與患者疾病活動(dòng)度的關(guān)系，以期為臨床診斷IBD提供幫助。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2017年7月至2020年1月于海南省萬(wàn)寧市人民醫(yī)院消化內(nèi)科就診的176例活動(dòng)期IBD患者設(shè)為IBD組，其中94例為UC患者（設(shè)為UC組），82例為CD患者（設(shè)為CD組）。IBD組患者中，男性97例，女性79例，年齡28～59歲，平均年齡為（40.30±7.87）歲。另選擇同期在該院就診的100例結(jié)腸息肉患者設(shè)為對(duì)照組，其中男性58例，女性42例，年齡30～58歲，平均年齡為（40.68±7.82）歲。IBD組與對(duì)照組的性別、年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），具有可比性。CD組患者中，男性45例，女性37例，平均年齡為（39.46±7.54）歲，根據(jù)CD活動(dòng)指數(shù)（CDAI）將CD組患者分為輕度CD組（28例）、中度CD組（31例）和重度CD組（23例）。UC組患者中，男性52例，女性42例，平均年齡為（41.04±8.16）歲，根據(jù)改良Mayo評(píng)分將UC組患者分為輕度UC組（30例）、中度UC組（32例）和重度UC組（32例）[10]。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)170519），所有入組者均簽署了知情同意書。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）活動(dòng)期IBD患者均符合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]，并結(jié)合活體組織病理檢查、結(jié)腸鏡檢查結(jié)果確診；（2）處于疾病活動(dòng)期；（3）無(wú)精神疾病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并凝血功能障礙；（2）腸道穿孔者；（3）3個(gè)月內(nèi)使用過免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等；（4）合并腸結(jié)核等感染性疾??；（5）患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫病；（6）合并惡性腫瘤。

1.3 腸黏膜組織中miR-129和PDCD4表達(dá)水平檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各組患者腸黏膜組織的miR-129和PDCD4表達(dá)水平。在IBD組患者入院行腸鏡檢查時(shí)取腸黏膜病變組織，在對(duì)照組患者行腸鏡下息肉切除術(shù)時(shí)取距息肉＞5 cm的回腸或結(jié)腸活體組織，活體組織均置于-80 ℃環(huán)境保存待測(cè)。取-80 ℃保存的腸黏膜組織，在低溫環(huán)境中研磨成粉末，然后使用RNA提取試劑盒[購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，貨號(hào)DP419]從中抽提得到總RNA。使用微量蛋白分析儀檢測(cè)RNA質(zhì)量，吸取1 μg RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，貨號(hào)R212-01）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后使用SYBR Green染料[購(gòu)自東洋紡（上海）生物科技有限公司，貨號(hào)QPS-201]配制成10 μL反應(yīng)體系，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀[購(gòu)自樂普（北京）醫(yī)療器械股份有限公司，型號(hào)Lepgen-96]上采集信號(hào)，擴(kuò)增條件為：95 ℃ 60 s預(yù)變性；之后95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)。miR-129以U6作為內(nèi)參，PDCD4以GAPDH作為內(nèi)參，采用 2-??Ct法計(jì)算 miR-129和 PDCD4的相對(duì)表達(dá)量。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，3組間比較采用單因素方差分析。采用Pearson相關(guān)系數(shù)法分析IBD患者腸黏膜組織中miR-129與PDCD4表達(dá)水平的相關(guān)性，以及miR-129和PDCD4的表達(dá)水平分別與改良Mayo評(píng)分、CDAI評(píng)分的相關(guān)性。采用ROC曲線評(píng)估腸黏膜組織中miR-129和PDCD4表達(dá)水平診斷IBD的效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IBD組與對(duì)照組的miR-129和PDCD4表達(dá)水平比較

IBD組患者腸黏膜組織中miR-129、PDCD4的相對(duì)表達(dá)量分別為0.82±0.23、0.67±0.19，均低于對(duì)照組（1.36±0.35、1.02±0.27），2組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。

2.2 UC組與CD組的miR-129和PDCD4表達(dá)水平比較

如表2所示，UC組與CD組的miR-129和PDCD4表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

表2 UC組與CD組的miR-129和PDCD4表達(dá)水平比較

2.3 不同疾病活動(dòng)度患者的miR-129和PDCD4表達(dá)水平比較

94例UC患者中，輕度UC組、中度UC組、重度UC組的miR-129和PDCD4表達(dá)水平依次降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。82例CD患者中，輕度CD組的miR-129和PDCD4表達(dá)水平均高于中度CD組和重度CD組，而中度CD組的miR-129和PDCD4表達(dá)水平均高于重度CD組，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表3。

表3 不同疾病活動(dòng)度患者的miR-129和PDCD4表達(dá)水平比較

2.4 IBD患者腸黏膜組織中miR-129與PDCD4表達(dá)水平的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，IBD患者腸黏膜組織中miR-129與PDCD4的表達(dá)水平呈正相關(guān)（r＝0.735，P＝0.000）。見圖1。

圖1 IBD患者腸黏膜組織中miR-129與PDCD4表達(dá)水平的相關(guān)性分析

2.5 miR-129和PDCD4表達(dá)水平與疾病活動(dòng)度的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，UC組的miR-129和PDCD4表達(dá)水平均與改良Mayo評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.580、r＝-0.595，P均＝0.000），見圖2。CD組的miR-129和PDCD4表達(dá)水平均與CDAI評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.508、r＝-0.498，P均＝0.000）。見圖3。

圖2 UC組的miR-129和PDCD4表達(dá)水平與改良Mayo評(píng)分的相關(guān)性分析 A miR-129與改良Mayo評(píng)分 B PDCD4與改良Mayo評(píng)分

圖3 CD組的miR-129和PDCD4表達(dá)水平與CDAI評(píng)分的相關(guān)性分析 A miR-129與CDAI評(píng)分 B PDCD4與CDAI評(píng)分

2.6 miR-129和PDCD4表達(dá)水平診斷IBD的ROC曲線分析

ROC曲線分析結(jié)果顯示，IBD組患者腸黏膜組織中miR-129表達(dá)水平診斷IBD的ROC曲線下 面 積（AUC）為 0.759（95%CI：0.703～0.816），最佳截?cái)嘀禐?.26，敏感度為71.60%，特異度為72.00%；PDCD4表達(dá)水平診斷IBD的AUC為0.867（95%CI：0.821～0.913），最佳截?cái)嘀禐?0.87，敏感度為85.80%，特異度為76.00%；miR-129聯(lián)合PDCD4診斷IBD的AUC、敏感度、特異度分別為0.911（95%CI：0.874～0.947）、83.50% 和 85.00%。見圖4。

圖4 miR-129和PDCD4診斷IBD的ROC曲線

3 討論

IBD是一種消化系統(tǒng)常見疾病，包括UC和CD，UC病變主要累及結(jié)直腸，患者常出現(xiàn)腹瀉、便血；而CD常見病變部位是回腸末端，可導(dǎo)致腹痛、體質(zhì)量減輕和排便習(xí)慣改變[11]。目前，IBD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，既往研究報(bào)道IBD的發(fā)生受到環(huán)境因素、免疫系統(tǒng)缺陷、遺傳易感性及個(gè)體腸道微生物群改變的共同影響[12]。研究表明，IBD的持續(xù)時(shí)間、病變范圍和病情嚴(yán)重程度，炎性假性息肉的存在，原發(fā)性硬化性膽管炎及結(jié)直腸癌家族史是IBD相關(guān)結(jié)直腸癌的主要危險(xiǎn)因素[13]。近年來，亞洲的IBD發(fā)病率不斷升高，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[14]。因此，深入探究IBD的發(fā)病機(jī)制對(duì)于尋找臨床治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。

miRNA參與調(diào)節(jié)人體免疫、炎性反應(yīng)等生理功能，其在IBD患者中的異常表達(dá)參與了NF-κB介導(dǎo)的炎性反應(yīng)和腸黏膜屏障功能的損傷及修復(fù)[4]。部分miRNA可作為IBD的血清學(xué)診斷標(biāo)志物，并可用于鑒別CD與UC[5]。既往研究表明，miR-129-5p在多種炎性疾病中作為炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的新型調(diào)節(jié)劑。Wan等[15]的研究結(jié)果顯示，miR-129-5p在脊髓損傷小鼠模型中表達(dá)下調(diào)，通過抑制高遷移率族蛋白B1（HMGB1）/Toll樣受體4（TLR4）/NF-κB信號(hào)通路來抑制炎性反應(yīng)，從而促進(jìn)機(jī)體損傷修復(fù)。Meng等[16]的研究表明，與健康人相比，CD或UC患者的miR-129表達(dá)水平顯著降低，通過負(fù)向調(diào)節(jié)泛素連接酶FBW7的表達(dá)水平抑制NF-κB信號(hào)通路，從而改善IBD癥狀。本研究中IBD組miR-129的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，與上述研究結(jié)果相符，這提示miR-129可能參與了IBD的發(fā)生、發(fā)展過程。本研究結(jié)果還顯示，UC組與CD組患者的miR-129表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示miR-129不能用于鑒別診斷UC與CD。miR-129的表達(dá)水平分別在輕度、中度、重度UC和CD患者組中依次降低，這提示miR-129的表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，且miR-129表達(dá)水平降低可能促進(jìn)了IBD的進(jìn)展。

PDCD4作為腫瘤抑制因子，可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[8]。研究表明，PDCD4缺失可導(dǎo)致急性結(jié)腸炎小鼠血清中IL-6表達(dá)上調(diào)，以及腸組織中IL-6、TNF-α表達(dá)水平升高，從而加重病情，促進(jìn)急性結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)腸癌的進(jìn)展[17]。本研究結(jié)果顯示，IBD組腸黏膜組織中PDCD4表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，UC組與CD組的PDCD4表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示PDCD4可能參與調(diào)控IBD的病理過程，但不能用于臨床鑒別UC與CD。王剛等[18]的研究顯示，隨著由呼吸道合胞病毒引發(fā)的毛細(xì)支氣管炎病情的加重，血清PDCD4表達(dá)水平下降。本研究結(jié)果顯示，在CD和UC患者中，輕度組的PDCD4表達(dá)水平均高于中度組，而中度組的PDCD4表達(dá)水平均高于重度組，這提示PDCD4的表達(dá)水平隨著疾病活動(dòng)度增高而降低，PDCD4可能參與了IBD的發(fā)生和發(fā)展。

研究顯示，PDCD4在腦血管疾病機(jī)體中的異常表達(dá)受到miRNA的調(diào)控[19]。本研究結(jié)果顯示，IBD組腸黏膜組織中miR-129與PDCD4的表達(dá)水平呈正相關(guān)，這提示miR-129、PDCD4可能共同參與了IBD的病理過程。此外，本研究結(jié)果還顯示，UC組的miR-129、PDCD4表達(dá)水平與改良Mayo評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，CD組的miR-129、PDCD4表達(dá)水平與CDAI評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，這提示miR-129、PDCD4的表達(dá)水平與UC及CD患者的疾病活動(dòng)度密切相關(guān)。ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-129、PDCD4單項(xiàng)及兩項(xiàng)聯(lián)合診斷IBD的AUC分別為0.759、0.867和0.911，這提示兩項(xiàng)聯(lián)合診斷的效能更高，可用于IBD的輔助診斷。

綜上所述，IBD患者腸黏膜組織中miR-129和PDCD4的表達(dá)水平下調(diào)，且miR-129和PDCD4的表達(dá)水平與UC及CD患者的疾病活動(dòng)度有關(guān)，其有望成為早期診斷IBD的生物標(biāo)志物。本研究的不足之處在于納入的病例數(shù)有限，且未對(duì)miR-129及PDCD4調(diào)控IBD的具體機(jī)制進(jìn)行深入分析。今后課題組將擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步探討相關(guān)作用途徑。