張肖玲 朱 偉 崔立娟

胃癌是一種在中國發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤，居男性惡性腫瘤發(fā)病率的第2位，女性惡性腫瘤發(fā)病率的第3位[1-2]。由于早期胃癌的病理特征不明顯，臨床癥狀的特異度不高，多數(shù)患者在確診時已經(jīng)處于中晚期。目前隨著放射治療、化學治療技術(shù)的不斷發(fā)展，患者的生存率逐年升高，但腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、耐藥等問題仍影響著胃癌治療方案的效果[3-4]。胃癌的發(fā)病機制復(fù)雜且受多種因素的影響，因此探究與胃癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因并尋找新的治療靶點，對于胃癌的治療至關(guān)重要。瞬時受體電位（TRP）通道家族是非選擇性陽離子通道，幾乎存在于所有組織和細胞內(nèi)[5]。研究表明，TRP通道可通過調(diào)控鈣離子信號通路干擾腫瘤細胞信號轉(zhuǎn)導，進而調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡、基因轉(zhuǎn)錄等病理過程[6-7]。消化系統(tǒng)腫瘤相關(guān)的TRP通道主要包括TRPC1、TRPC5、TRPM6、TRPM7和TRPM8等[8]，其中TRPM7已被報道可通過調(diào)控磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路促進卵巢癌的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[9]；亦有研究表明，TRPM7具有成為腫瘤標志物和治療靶點的潛力[10]。本文檢測了TRPM7在胃癌組織及胃癌細胞株中的表達水平，并探究了其對胃癌細胞凋亡和自噬的影響，以期為臨床診斷和治療胃癌提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2018年1月至2021年6月在張家港市中醫(yī)醫(yī)院進行手術(shù)治療的46例胃癌患者的腫瘤組織和癌旁組織（距離腫瘤組織邊緣＞5 cm，經(jīng)病理證實無腫瘤細胞）標本，其中男性33 例，女性13例，年齡40～75 歲，平均年齡為（60.23±5.04）歲。納入標準：（1）符合《中國臨床腫瘤學會（CSCO）原發(fā)性胃癌診療指南（2017.V1）》的診斷標準[11]；（2）臨床資料完整；（3）為首次治療，均行組織切除手術(shù)。排除標準：（1）接受過除切除手術(shù)之外的其他抗腫瘤治療；（2）合并其他惡性腫瘤；（3）腫瘤發(fā)生遠處器官轉(zhuǎn)移；（4）合并嚴重的心、腎、肝等臟器功能障礙。標本的采集均取得患者及家屬的知情同意并簽字。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準實施（批件號20180108）。胃黏膜上皮細胞株GES-1和胃癌細胞株MGC-803、SGC-7901、HGC-27、MKN-45均購自中國科學院（上海）細胞庫。

1.2 TRPM7表達水平檢測

采用實時熒光定量PCR法檢測TRPM7在胃癌組織、癌旁組織、GES-1細胞及各胃癌細胞株中的表達水平。使用TRIzol試劑提取各組織和細胞中的總RNA，經(jīng)核酸定量后，將核酸的質(zhì)量濃度稀釋至1 g/L后進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后使用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（購自北京索萊寶科技有限公司）進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；之后95 ℃變性10 s，60 ℃退火1 min，共40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用 2?ΔΔCt法計算TRPM7 mRNA 的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 細胞培養(yǎng)

GES-1、MGC-803、SGC-7901、HGC-27 和MKN-45細胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中。細胞從液氮中取出后迅速融化，重懸于培養(yǎng)基中，然后將其置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)至細胞融合度達80%時進行傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行轉(zhuǎn)染。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染和分組

將TRPM7小干擾RNA（TRPM7-siRNA，設(shè)為si-TRPM7組）和陰性對照（siRNA-NC，設(shè)為si-NC組）轉(zhuǎn)染至MGC-803細胞，將空白質(zhì)粒（設(shè)為Vector組）和TRPM7過表達質(zhì)粒（設(shè)為TRPM7組）轉(zhuǎn)染至MKN-45細胞。將對數(shù)生長期的MGC-803細胞和MKN-45細胞接種至6孔板中，每孔1×105個細胞，細胞貼壁后使用LipofectaminTM2000試劑盒（購自美國Invitrogen公司），按照上述分組進行轉(zhuǎn)染。

1.5 各組細胞凋亡率檢測

采用流式細胞術(shù)檢測各組細胞的凋亡率。取各組細胞（1×105個）于流式管中，用預(yù)冷的無菌PBS清洗2次后，按照細胞凋亡檢測試劑盒（購自美國BD公司）說明書操作，每組細胞中加入5 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI染料，避光孵育1 h后，用PBS清洗2次，使用FACSCalibur流式細胞儀（購自美國BD公司）檢測各組細胞的凋亡率。

1.6 LC3-Ⅱ和p62表達水平及 PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平檢測

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測各組細胞的LC3-Ⅱ和p62表達水平，以及PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平。收集各組細胞（1×106個）于離心管中，每管加入500 μL RIPA蛋白裂解液，經(jīng)蛋白定量，將上樣緩沖液與蛋白樣品混合后煮沸5 min，取各組蛋白10 μg進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后，將PVDF膜與抗LC3-Ⅱ抗體、抗p62抗體、抗p-PI3K/PI3K抗體、抗p-Akt/Akt抗體、抗p-mTOR/ mTOR抗體、抗GAPDH抗體（均購自美國Cell Signaling Technology公司）置于4 ℃孵育過夜，清洗后，與山羊抗兔IgG抗體共孵育1.5 h后曝光并顯影，應(yīng)用ImageJ軟件進行定量分析。

1.7 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用GraphPad Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TRPM7在各種組織和細胞中的表達水平比較

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，TRPM7 mRNA在胃癌組織中的表達水平較高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；與GES-1細胞比較，TRPM7 mRNA 在 MGC-803、SGC-7901、HGC-27和MKN-45細胞中的表達水平較高，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.001）。該結(jié)果提示TRPM7在胃癌組織和胃癌細胞中呈高表達。見圖1和圖2。

圖1 胃癌組織與癌旁組織中TRPM7 mRNA的表達水平比較

圖2 GES-1細胞與各胃癌細胞株中TRPM7 mRNA的表達水平比較

2.2 胃癌組織中TRPM7 mRNA的表達水平與患者臨床病理特征的關(guān)系

如表2所示，與T1～T2期患者比較，T3～T4期患者胃癌組織的TRPM7 mRNA表達水平較高；與Ⅰ～Ⅱ期患者比較，Ⅲ～Ⅳ期患者胃癌組織的TRPM7 mRNA表達水平較高；與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者比較，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者胃癌組織的TRPM7mRNA表達水平較高，以上差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。此外，TRPM7 mRNA在不同年齡、性別的患者中的表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。結(jié)果提示胃癌組織的TRPM7 mRNA表達水平與病理分期、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

2.3 構(gòu)建差異表達TRPM7的胃癌細胞株

結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-TRPM7組MGC-803細胞中TRPM7 mRNA的表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；與Vector組比較，TRPM7組MKN-45細胞中TRPM7 mRNA的表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。見圖3和圖4。

圖3 si-NC組與si-TRPM7組的TRPM7 mRNA表達水平比較

圖4 Vector組與TRPM7組的TRPM7 mRNA表達水平比較

2.4 各組胃癌細胞凋亡率比較

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-TRPM7組的MGC-803細胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；與Vector組比較，TRPM7組的MKN-45細胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。結(jié)果提示TRPM7可調(diào)控胃癌細胞的凋亡水平。見圖5。

圖5 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率 A si-NC組和si-TRPM7組MGC-803細胞 B Vector組和TRPM7組MKN-45細胞 C 各組細胞凋亡率柱形圖

2.5 各組的自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和p62表達水平比較

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-TRPM7組MGC-803細胞中LC3-Ⅱ的表達水平降低，p62的表達水平升高，組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.001）；與Vector組比較，TRPM7組MKN-45細胞中LC3-Ⅱ的表達水平升高，p62的表達水平降低，組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.001）。結(jié)果提示TRPM7可抑制胃癌細胞的自噬。見圖6。

圖6 蛋白質(zhì)印跡法檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和p62的表達水平 A si-NC組和si-TRPM7組MGC-803細胞中LC3-Ⅱ和p62表達的蛋白電泳圖 B Vector組和TRPM7組MKN-45細胞中LC3-Ⅱ和p62表達的蛋白電泳圖 C si-NC組和si-TRPM7組MGC-803細胞中LC3-Ⅱ和p62表達的柱形圖 D Vector組和TRPM7組MKN-45細胞中LC3-Ⅱ和p62表達的柱形圖

2.6 各組PI3K、Akt和mTOR磷酸化水平比較

如圖7所示，蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-TRPM7組MGC-803細胞中PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平降低，組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.001），這提示沉默TRPM7可抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路激活。如圖8所示，與Vector組比較，TRPM7組MKN-45細胞中PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平升高，組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.001），這提示TRPM7過表達可激活PI3K/Akt/mTOR信號通路。

圖7 蛋白質(zhì)印跡法檢測si-NC組和si-TRPM7組MGC-803細胞中PI3K、Akt和mTOR磷酸化水平 A 蛋白電泳圖 B PI3K C Akt D mTOR

圖8 蛋白質(zhì)印跡法檢測Vector組和TRPM7組MKN-45細胞中PI3K、Akt和mTOR磷酸化水平 A 蛋白電泳圖 B PI3K C Akt D mTOR

3 討論

TRPM7同時具有離子通道和蛋白激酶，其離子通道可調(diào)控Mg2＋與Ca2＋的平衡，還可調(diào)控細胞的增殖、凋亡和分化等，是細胞發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子[12]。近年來，TRPM7被報道在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著調(diào)控作用。Qin等[13]和Chen等[14]的研究表明，TRPM7在鼻咽鱗癌細胞中呈高表達，其可促進鼻咽鱗癌細胞的增殖并抑制細胞凋亡，并與患者的預(yù)后密切相關(guān)。韓晟等[15]的研究表明，TRPM7在口腔鱗癌細胞中高表達，并可通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路和MAPK/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號通路增強口腔鱗癌細胞的增殖和遷移能力。吳鵬飛等[16]的研究表明，沉默TRPM7可通過調(diào)控PI3K/Akt/ERK信號通路而影響膠質(zhì)瘤細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果顯示，TRPM7在胃癌組織和胃癌細胞株中均呈高表達，且其在T3～T4期、Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者胃癌組織中的表達水平分別高于T1～T2期、Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，這提示TRPM7可能與胃癌患者的病理進程相關(guān)。

TRPM7可以調(diào)控多種腫瘤細胞的凋亡。Song等[17]的研究表明，抑制TRPM7的表達可促進三陰性乳腺癌細胞凋亡。另有研究結(jié)果顯示，干擾TRPM7表達可通過抑制PI3K/Akt信號通路的激活而發(fā)揮抑制人腦血管外膜成纖維細胞增殖并誘導其凋亡的作用[18]。本研究結(jié)果顯示，在MGC-803細胞中抑制TRPM7表達后細胞凋亡率顯著升高，在MKN-45細胞中過表達TRPM7后細胞凋亡率顯著降低，這提示TRPM7可調(diào)控胃癌細胞的凋亡。

細胞自噬為腫瘤細胞提供了豐富的營養(yǎng)，從而促進腫瘤生長[19]。Oh等[20]的研究表明，TRPM7信號通路的激活可促進細胞自噬。Zhou等[21]的研究表明，TRPM7可影響PI3K/Akt/自噬通路的激活而促進內(nèi)皮祖細胞血管生成。本研究結(jié)果顯示，在MGC-803細胞中抑制TRPM7表達后細胞自噬相關(guān)蛋白水平顯著降低，在MKN-45細胞中過表達TRPM7后細胞自噬相關(guān)蛋白水平顯著升高，這提示TRPM7可調(diào)控胃癌細胞的自噬。

Nadolni等[22]的研究表明，TRPM7可調(diào)節(jié)Akt/mTOR信號通路。另有研究結(jié)果顯示，PI3K/Akt/mTOR信號通路可影響胃癌細胞的生長、轉(zhuǎn)移、自噬及表觀遺傳等多種病理過程[23]。本研究結(jié)果顯示，在MGC-803細胞中抑制TRPM7表達后細胞中PI3K/Akt/mTOR信號通路被顯著抑制，在MKN-45細胞中過表達TRPM7后細胞中PI3K/Akt/mTOR信號通路被激活。以上結(jié)果提示TRPM7可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號通路而影響胃癌細胞的凋亡和自噬。

綜上所述，TRPM7在胃癌組織和胃癌細胞中呈高表達，可能通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制胃癌細胞的凋亡和自噬。本研究存在一定不足，如未使用透射電鏡觀察自噬小體，今后需進一步探究并驗證TRPM7是否能成為胃癌治療的新靶點。