王 偉 朱婷婷 劉家豪

急性胰腺炎（AP）是以胰腺局部炎性反應(yīng)為主要特征的疾病，其發(fā)病率和病死率均較高。研究表明，胰腺腺泡細胞凋亡是AP發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素[1-2]，因此，探尋AP的新型生物治療靶標以有效抑制胰腺腺泡細胞凋亡已成為臨床研究熱點。磷酸酶與張力蛋白同源物（PTEN）基因是一種抑癌基因，能夠通過拮抗磷酸化酶的活性影響腫瘤細胞的增殖和代謝。研究表明，PTEN在AP模型大鼠的胰腺組織中呈高表達，且通過激活Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號通路抑制AP細胞的生長[3]。趙明一等[4]的研究表明，抑制PTEN表達可顯著促進AP患者胰腺腺泡細胞增殖并抑制細胞凋亡。miRNA是一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA，能夠參與細胞增殖、凋亡等生理學(xué)過程[5]。既往動物實驗研究結(jié)果顯示，miR-132在胰腺炎模型大鼠的膽汁中表達上調(diào)[6]。Zhao等[7]的研究結(jié)果顯示，miR-132可靶向下調(diào)PTEN表達，從而阻斷阿爾茨海默病模型中β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用。目前關(guān)于miR-132和PTEN在AP患者胰腺腺泡細胞中的生物學(xué)行為的報道較少。本研究探討了miR-132和PTEN對雨蛙素誘導(dǎo)的AP模型胰腺腺泡細胞增殖及凋亡的影響，并分析兩者的關(guān)系，以期為提高AP的臨床治療效果提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及AP模型構(gòu)建

大鼠胰腺腺泡細胞系MZ-M0321細胞株購自寧波明舟生物科技有限公司。MZ-M0321細胞經(jīng)解凍、復(fù)蘇后，置于含10%滅活胎牛血清＋青霉素-鏈霉素混合液的RPMI-1640培養(yǎng)液（購自上海吉至生化科技有限公司）中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱（購自日本Sanyo公司）中培養(yǎng)，每2日換液1次（無菌操作），進行傳代培養(yǎng)。

AP細胞模型的構(gòu)建：造模前1 d取MZ-M0321細胞接種于6孔板（1.2×106個/孔），培養(yǎng)24 h后加入100 nmol/L雨蛙素[純度≥98%，規(guī)格1 mg，購自翌圣生物科技（上海）有限公司]刺激6 h，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集上清液，采用ELISA法檢測IL-6、TNF-α的表達水平，試劑盒均購自無錫云萃生物科技有限公司，每組設(shè)置6個復(fù)孔[8]。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染及分組

取1.1小節(jié)中未經(jīng)雨蛙素處理的MZ-M0321細胞設(shè)為空白對照組，經(jīng)雨蛙素處理的MZ-M0321細胞設(shè)為雨蛙素組。采用慢病毒轉(zhuǎn)染法進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1日取經(jīng)雨蛙素處理的細胞接種于6孔板（1.2×106個/孔），培養(yǎng)24 h后，更換為不含胎牛血清的培養(yǎng)液，隨機分為3組：（1）無義序列組采用轉(zhuǎn)染試劑（LipofectamineTM3000，購自上海吉至生化科技有限公司）將miR-132-mimics-NC序列（由百奧邁科生物技術(shù)有限公司設(shè)計、合成）轉(zhuǎn)染至MZ-M0321細胞；（2）miR-132過表達組 采用轉(zhuǎn)染試劑將miR-132-mimics序列（由百奧邁科生物技術(shù)有限公司設(shè)計、合成）轉(zhuǎn)染至MZ-M0321細胞；（3）共轉(zhuǎn)染組 參照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作，先將脂質(zhì)體與質(zhì)粒載體pcDNA-PTEN（由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計、合成）以8 μL∶4 μg的比例在250 μL Opti-MEMTM培養(yǎng)基中稀釋混勻，加入含有miR-132-mimics序列的培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)染至MZM0321細胞。3組細胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每組設(shè)置6個復(fù)孔，重復(fù)測量3次。

1.3 miR-132和PTEN mRNA表達水平檢測

采用實時熒光定量PCR法檢測各組細胞中miR-132、PTENmRNA的表達水平。提取1.2小節(jié)中各組MZ-M0321細胞中的總RNA并檢測濃度，以RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄，所得cDNA進行PCR反應(yīng)。配置20 μL反應(yīng)體系，包含2×UltraSYBR Mixture 10.0 μL、cDNA 模板（25 ng/μL）2.0 μL、上下游引物各2.0 μL和ddH2O 4.0 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性 95 ℃ 30 s；之后 95 ℃ 5 s變性，60 ℃ 30 s退火，72 ℃ 20 s延伸，共40個循環(huán)。miR-132以U6作為內(nèi)參，PTEN以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-132和PTENmRNA的相對表達量。引物均由寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計并合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 細胞增殖情況檢測

采用MTT法檢測各組細胞的增殖情況。取1.2小節(jié)中各組MZ-M0321細胞，經(jīng)胰酶消化后接種至24孔板（2.5×104個/孔），加入MTT試劑（購自上海吉至生化科技有限公司，20 μL/孔，5 mg/mL），培養(yǎng)2 h后棄上清，加入150 μL DMSO并振蕩，使用酶標儀（購自美國Thermo公司）檢測490 nm處各孔細胞的光密度（OD）值。細胞增殖抑制率＝（對照組OD值－實驗組OD值）/對照組OD值×100%。每組重復(fù)測量3次。

1.5 細胞凋亡情況檢測

采用流式細胞術(shù)檢測各組細胞的凋亡情況。取1.2小節(jié)中各組MZ-M0321細胞，按照AnnexinVFITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒（購自上海復(fù)申生物科技有限公司）說明書操作，取100 μL細胞懸液（1×106個 /mL），加 入 5 μL AnnexinV-FITC＋10 μL PI（20 μg/mL），混勻，避光孵育30 min，使用流式細胞儀（購自常州必達科生物科技有限公司）檢測細胞凋亡率。每組重復(fù)測量3次。

1.6 細胞PTEN、增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達水平檢測

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測各組細胞中PTEN、增殖和凋亡相關(guān)蛋白（Bcl-2、Ki-67和Bax）的表達水平。取1.2小節(jié)中各組MZ-M0321細胞，使用RIPA裂解液裂解3 min，離心取上清液，行電泳、轉(zhuǎn)模、5%脫脂牛奶封閉3 h，加入兔抗鼠一抗（PTEN、Ki-67、Bcl-2和Bax）及內(nèi)參GAPDH（均購自北京索萊寶科技有限公司），按照1∶1 000的比例稀釋，過夜；次日加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗（購自北京索萊寶科技有限公司，1∶5 000），室溫孵育2 h，顯色、顯影、定影，測定PTEN、Bcl-2、Ki-67和Bax蛋白的相對表達量。

1.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

TargetScan數(shù)據(jù)庫顯示PTEN與miR-132核苷酸存在結(jié)合位點，采用PCR技術(shù)擴增PTEN-3'UTR序列中包含與miR-132存在結(jié)合位點的片段，插入至熒光素酶pGL3載體中，構(gòu)建PTEN野生型質(zhì)粒（PTEN-WT），并利用基因突變技術(shù)將個別結(jié)合位點序列突變，構(gòu)建突變型質(zhì)粒（PTEN-MT）。使用轉(zhuǎn)染試劑將PTEN-WT、PTEN-MT分別與mimics-NC、miR-132-mimics轉(zhuǎn)染至MZ-M0321細胞，設(shè)為mimics-NC-PTEN-WT組、miR-132-mimics-PTENWT組、mimics-NC-PTEN-MT組和miR-132-mimics-PTEN-MT組，轉(zhuǎn)染48 h后，用PBS洗滌細胞，加入250 μL RIPA裂解液于室溫搖床中搖晃15 min，之后加入50 mL熒光素酶檢測試劑Ⅱ，使用自動熒光素酶檢測儀測定熒光強度A，再加入Stop＆Glo試劑，測定熒光強度B，以A/B表示熒光素酶的相對活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AP模型的造模情況

雨蛙素組細胞的TNF-α、IL-6表達水平分別為（323.58±48.50）ng/L、（356.79±53.52）ng/L，均高于空白對照組[（118.96±17.83）ng/L、（98.77±14.80）ng/L]，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝9.700，P＝0.000；t＝11.382，P＝0.000）。這提示 AP模型構(gòu)建成功。

2.2 各轉(zhuǎn)染組細胞的miR-132、PTEN mRNA表達水平比較

如表2所示，與無義序列組比較，miR-132過表達組的miR-132表達水平較高，PTENmRNA表達水平較低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；與miR-132過表達組比較，共轉(zhuǎn)染組的PTENmRNA表達水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但2組的miR-132表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。這提示細胞轉(zhuǎn)染成功。

表2 各轉(zhuǎn)染組細胞的miR-132、PTEN mRNA水平比較

2.3 各轉(zhuǎn)染組細胞增殖情況比較

miR-132過表達組的細胞增殖抑制率為（-28.87±4.33）%，低于無義序列組（0），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；共轉(zhuǎn)染組的細胞增殖抑制率為（-16.73±2.51）%，高于miR-132過表達組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 各轉(zhuǎn)染組細胞凋亡情況比較

無義序列組、miR-132過表達組和共轉(zhuǎn)染組的細胞凋亡率分別為（38.03±5.71）%、（12.01±1.81）%和（22.77±3.42）%。與無義序列組比較，miR-132過表達組的細胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝10.640，P＝0.000）；與miR-132過表達組比較，共轉(zhuǎn)染組的細胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝6.811，P＝0.000）。見圖1。

圖1 流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率 A 無義序列組 B miR-132過表達組 C 共轉(zhuǎn)染組

2.5 各轉(zhuǎn)染組中PTEN、增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達水平比較

與無義序列組比較，miR-132過表達組的Ki-67、Bcl-2蛋白表達水平升高，PTEN、Bax蛋白表達水平降低，2組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）；與miR-132過表達組比較，共轉(zhuǎn)染組的Ki-67、Bcl-2蛋白表達水平降低，PTEN、Bax蛋白表達水平升高，2組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。見表3、圖2。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測各轉(zhuǎn)染組中PTEN、Bax、Ki-67和Bcl-2蛋白的表達水平

表3 各轉(zhuǎn)染組中PTEN、增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達水平比較

2.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-132對PTEN的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

TargetScan數(shù)據(jù)庫顯示miR-132與PTEN基因序列存在結(jié)合位點，見圖3。mimics-NC-PTENWT組、miR-132-mimics-PTEN-WT組、mimics-NCPTEN-MT組和miR-132-mimics-PTEN-MT組的熒光素酶相對活性分別為1.37±0.20、1.00±0.18、0.98±0.19和1.02±0.16，其中miR-132-mimics-PTEN-WT組的熒光素酶活性顯著低于mimics-NC-PTEN-WT組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 miR-132與PTEN的靶向關(guān)系

3 討論

AP是一種可累及其他臟器的常見急性炎性疾病，具有發(fā)病迅速、進展快、并發(fā)癥多、病死率高的特點[9]。研究表明，TNF-α可促進促炎因子IL-6的合成及釋放，從而引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征及多器官功能障礙綜合征，其在AP發(fā)病時表達水平升高[10-11]。本研究結(jié)果顯示，雨蛙素組細胞的TNF-α、IL-6表達水平均顯著高于空白對照組，這提示AP細胞模型構(gòu)建成功。

miRNA能夠調(diào)控靶基因的表達，參與細胞增殖、凋亡等生理學(xué)過程[12]。劉芬等[13]的研究表明，miR-132過表達可顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的肺泡巨噬細胞炎性反應(yīng)。Kumstel等[6]的研究結(jié)果顯示，在胰腺炎模型大鼠血清中miR-132的表達下調(diào)，并參與了炎性反應(yīng)。另有研究表明，胰腺腺泡細胞增殖及凋亡失衡是導(dǎo)致AP發(fā)生、發(fā)展的機制之一[14]。Ki-67是一項評價細胞增殖狀態(tài)的指標，Bcl-2是人體重要的抑制凋亡基因，而Bax是促進凋亡基因[15]。本研究結(jié)果顯示，在成功轉(zhuǎn)染MZ-M0321細胞后，與無義序列組比較，miR-132過表達組的細胞增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表達水平均顯著降低，而Ki-67、Bcl-2蛋白表達水平均升高。這提示miR-132表達上調(diào)可能促進了雨蛙素誘導(dǎo)的AP MZM0321細胞增殖并抑制該細胞凋亡。

PTEN是同源10號染色體丟失的磷酸酶基因，參與了多種病理、生理狀態(tài)下的炎性反應(yīng)[16]。Kong等[17]的研究結(jié)果顯示，沉默PTEN基因表達可抑制AP模型胰腺腺泡細胞凋亡，并促進細胞增殖。本研究結(jié)果顯示，與無義序列組比較，miR-132過表達組的PTENmRNA及蛋白水平均降低；而在細胞轉(zhuǎn)染miR-132-mimics序列并上調(diào)PTEN表達后，miR-132過表達所致的促進細胞增殖及抑制細胞凋亡的能力均在一定程度上減弱，這提示miR-132過表達可能通過靶向下調(diào)PTEN表達而促進雨蛙素誘導(dǎo)的AP MZ-M0321細胞增殖并抑制該細胞凋亡。既往研究表明，miR-132表達上調(diào)可通過下調(diào)PTEN表達而抑制慢性阻塞性肺疾病的進展[18]，與本文結(jié)論相符。本研究從生物信息學(xué)預(yù)測網(wǎng)站得知miR-132與PTEN基因存在結(jié)合位點，且雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，miR-132-mimics-PTEN-WT組的熒光素酶活性顯著弱于mimics-NC-PTEN-WT組。以上結(jié)果提示miR-132表達上調(diào)可促進雨蛙素誘導(dǎo)的AP MZ-M0321細胞增殖并抑制該細胞凋亡，這可能是通過靶向下調(diào)PTEN表達實現(xiàn)的。

綜上所述，上調(diào)miR-132表達可能通過靶向下調(diào)PTEN表達，從而促進雨蛙素誘導(dǎo)的AP MZM0321細胞增殖并抑制該細胞凋亡。本研究為探尋AP的新型生物治療靶標以改進AP的治療方案提供了參考依據(jù)。