韓喬木,宮麗鴻,吳啟華,史富羽,趙 帥,肖福龍

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032)

心房顫動(dòng)(Atrial fibrilltion，AF)歸屬于中醫(yī)學(xué)“心悸”“怔忡”范疇，常見心悸不寧、時(shí)發(fā)時(shí)止、善驚易恐、胸悶煩躁等癥狀，多由痰濁、血瘀、水飲等實(shí)邪阻滯所致，國(guó)內(nèi)研究顯示，房顫患者證型以氣虛血瘀、氣陰兩虛、痰濁血瘀證最為多見[1]。流行病學(xué)顯示，房顫早期多呈現(xiàn)陣發(fā)性，隨發(fā)作頻率增加，逐漸轉(zhuǎn)為持續(xù)性房顫。研究顯示,房顫引發(fā)卒中的風(fēng)險(xiǎn)隨年齡增長(zhǎng)而升高，50歲以上患者患病風(fēng)險(xiǎn)升高1.5%，80歲以上患者風(fēng)險(xiǎn)可達(dá)25%[2]。房顫的發(fā)生發(fā)展機(jī)制包括電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)、炎癥等方面。近年研究顯示，抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生可降低房顫發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，提高患者生活質(zhì)量[3-4]。同時(shí)，因損傷等因素使血管內(nèi)皮細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)，血漿中血管性血友病因子(Vascular hemophilia factor,vWF)濃度升高，增加卒中事件發(fā)生率[5]。本研究通過觀察化痰祛瘀方對(duì)房顫模型大鼠房顫持續(xù)時(shí)間，透射電鏡下心房肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化，探討化痰祛瘀方對(duì)房顫大鼠的治療作用及對(duì)血清中血管細(xì)胞黏附分子-1(Vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、vWF的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠60只，雄性，體重300～400 g，動(dòng)物合格證號(hào)SYXK(遼)2013-0009,購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物倫理審查編號(hào)21000042021021。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：化痰祛瘀方由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院熬制，規(guī)格100 ml/袋，放置于冰箱-4 ℃冷藏保存。藥物組成：陳皮、苦參、丹參各15 g，清半夏、竹茹、麩炒枳殼、炙甘草、甘松各10 g，桂枝6 g，龍骨、牡蠣各25 g(后下)，僵蠶5 g，熟三七粉2 g。鹽酸維拉帕米片(國(guó)藥準(zhǔn)字H12020051，天津市中央藥業(yè)有限公司)；氯化乙酰膽堿(批號(hào)S30170-5，源葉生物科技有限公司)；無(wú)水氯化鈣(批號(hào)S24110-500g，源葉生物科技有限公司)；10%水合氯醛溶液(規(guī)飛凈生物科技有限公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：vWF、VCAM-1 ELISA試劑盒均購(gòu)自于北京誠(chéng)林生物科技有限公司。PowerLab 15T多導(dǎo)電生理記錄儀(型號(hào)ML4818，上海埃德儀器國(guó)際貿(mào)易有限公司)；精密電子天平(丹佛儀器北京有限公司)；SIS透射電鏡數(shù)字?jǐn)z像頭(型號(hào)ORADA，德國(guó)EMSIS公司)；哺乳動(dòng)物類手術(shù)器械一套。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 房顫大鼠模型建立：本實(shí)驗(yàn)造模依照《SD大鼠房顫模型的建立》[6]，準(zhǔn)備雄性SD大鼠60只，喂食高脂飲食3周后，隨機(jī)分為空白組、模型組、中藥低濃度組、中藥中濃度組、中藥高濃度組、維拉帕米組，每組10只。除空白組外其他五組SD大鼠以0.1 ml/100 g劑量進(jìn)行尾靜脈注射乙酰膽堿氯化鈣混合液制備痰濁血瘀型房顫大鼠模型，連續(xù)注射7 d；造模第7天，對(duì)模型大鼠稱重，予以10%水合氯醛溶液，以0.3 ml/100 g劑量進(jìn)行麻醉。將大鼠呈仰臥位置于木板上，用橡皮筋固定四肢，將金屬針頭插入已消毒的四肢皮下，導(dǎo)聯(lián)末端蘸鹽水夾于針頭暴露端，連接Power Lab 15T多導(dǎo)電生理記錄儀，測(cè)量Ⅱ?qū)?lián)心電圖，動(dòng)態(tài)觀察5 min。將造模成功的房顫大鼠依照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[7]進(jìn)行給藥，人與動(dòng)物按體表面積折算的等效劑量比值(1∶6.25)系數(shù)折算。造模成功后第2天灌胃，灌胃體積為3 ml，中藥各劑量組按高、中、低濃度分別給予41.25、20.63、10.31 g/(kg·d)化痰祛瘀方溶液灌胃；維拉帕米組給予維拉帕米溶液25 mg/(kg·d)灌胃，連續(xù)灌胃2周。各組大鼠灌胃期間在灌胃1 h后進(jìn)行尾靜脈注射乙酰膽堿氯化鈣混合液，1次/d。

1.2.2 造模前后大鼠心電圖房顫持續(xù)時(shí)間比較：對(duì)造模前、后大鼠測(cè)量Ⅱ?qū)?lián)心電圖，見圖1。造模成功后，對(duì)大鼠給藥，并記錄房顫持續(xù)時(shí)間，以心電圖中f波出現(xiàn)、P波消失、P-R間期絕對(duì)不等為房顫發(fā)生的標(biāo)記，以P波出現(xiàn)、f波消失為房顫終止標(biāo)志。

圖1 大鼠造模前后心電圖比較

1.2.3 透射電鏡觀察各組大鼠心房肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化：開胸暴露心臟后，用移液槍抽取少許戊二醛固定液，滴于活體組織上，剪取心臟，置于含有4 ℃戊二醛固定液的載玻片上，再用硬質(zhì)刀片在左心房部位剪取小塊組織，修剪成1 mm×1 mm×1 mm小塊，放入盛有1 ml的4%戊二醛固定液的EP管中，確保樣品完全進(jìn)入固定液中，置于4 ℃冰箱暫放。

1.2.4 酶聯(lián)免疫法測(cè)定大鼠血清中VCAM-1及vWF水平：ELISA法測(cè)定各組大鼠血清中VCAM-1、vWF水平，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值，計(jì)算指標(biāo)濃度，操作嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠房顫持續(xù)時(shí)間比較 見表1。造模7 d后，模型組、中藥低濃度組、中藥中濃度組、中藥高濃度組、維拉帕米組大鼠的房顫持續(xù)時(shí)間均長(zhǎng)于與空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，提示房顫大鼠造模成功。對(duì)房顫大鼠給藥后，中藥高濃度組、中藥中濃度組、中藥低濃度組、維拉帕米組大鼠房顫持續(xù)時(shí)間均短于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。各給藥組間大鼠房顫持續(xù)時(shí)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表1 各組大鼠房顫持續(xù)時(shí)間比較(s)

2.2 透射電鏡下各組大鼠心房肌超微結(jié)構(gòu)比較 見圖2。空白組大鼠心房肌細(xì)胞的肌小節(jié)完整清晰，“Z”帶排列整齊連貫，清晰有序，“I”帶清晰可見，肌絲排列整齊緊密，線粒體結(jié)構(gòu)正常，線粒體嵴排列緊密，結(jié)構(gòu)完整，未見閏盤分離現(xiàn)象。模型組大鼠心房肌細(xì)胞的肌小節(jié)斷裂，“Z”帶不連續(xù)，排列混亂，“I”帶模糊不清，心肌細(xì)胞肌絲溶解斷裂，出現(xiàn)空隙，線粒體腫脹、增多，甚至破裂，嵴斷裂溶解，聚集在一起，呈空泡樣改變。中藥高濃度組大鼠心房肌細(xì)胞的肌小節(jié)輕微斷裂，排列相對(duì)整齊，肌絲稍有溶解，線粒體輕度腫脹、輕度增多，嵴溶解明顯減少，結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，閏盤分離現(xiàn)象改善。中藥中濃度組大鼠心房肌細(xì)胞的肌小節(jié)相對(duì)完整，“Z”帶有錯(cuò)位現(xiàn)象，排列整齊，肌絲稍模糊，線粒體腫脹，偶見線粒體溶解，結(jié)構(gòu)相對(duì)完整。中藥低濃度組大鼠心房肌細(xì)胞的肌小節(jié)斷裂，“Z”帶不連續(xù)，排列不整齊，“I”帶模糊不清，線粒體腫脹、增多，嵴斷裂溶解，個(gè)別結(jié)構(gòu)不完整。維拉帕米組大鼠心房肌細(xì)胞的肌小節(jié)輕微斷裂，“Z”帶增寬、中斷、不連續(xù)，排列相對(duì)整齊，“I”帶稍模糊，線粒體增多、聚集在一起，部分嵴斷裂溶解。

圖2 各組大鼠心房肌細(xì)胞超微電鏡下結(jié)構(gòu)(×10000)

2.3 各組大鼠血清VCAM-1及vWF濃度比較 見表2。造模成功后，對(duì)各組大鼠按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求給藥，連續(xù)給藥2周，給藥結(jié)束后應(yīng)用ELISA法測(cè)定房顫痰濁血瘀證大鼠血清中VCAM-1、vWF濃度。模型組大鼠血清VCAM-1、vWF濃度均高于空白組大鼠血清VCAM-1、vWF濃度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。中藥高濃度組、中藥中濃度組大鼠血清VCAM-1濃度均低于模型組大鼠血清VCAM-1濃度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；中藥高濃度組、中藥中濃度組、中藥低濃度組、維拉帕米組大鼠血清vWF濃度均低于模型組大鼠血清vWF濃度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表2 各組大鼠血清VCAM-1 及vWF比較

3 討 論

近年來(lái)，中醫(yī)藥治療房顫的優(yōu)勢(shì)越來(lái)越大，其具有不良反應(yīng)較小、藥效持久、患者依從性高、可多離子通道、多靶點(diǎn)共同作用等特點(diǎn)，能顯著改善患者臨床癥狀、預(yù)后?，F(xiàn)代中醫(yī)治療多以化痰息風(fēng)，活血化瘀，溫陽(yáng)安神，滋陰定悸，補(bǔ)脾益肺為治法[8]。本實(shí)驗(yàn)化痰祛瘀方由陳皮、清半夏、竹茹、麩炒枳殼、桂枝、炙甘草、龍骨、牡蠣、苦參、甘松、僵蠶、丹參、熟三七粉等藥物組成，在溫膽湯、桂枝甘草龍骨牡蠣湯基礎(chǔ)上進(jìn)一步創(chuàng)新，以祛痰化瘀、息風(fēng)定悸為治療大法，治療心房顫動(dòng)。溫膽湯源于孫思邈所著《備急千金要方》，主治膽虛痰熱內(nèi)擾之證，以清熱化痰，理氣通絡(luò)之法起到祛除痰瘀諸邪的作用。桂枝甘草龍骨牡蠣湯出自《傷寒論》第118條，原方中增加龍骨、牡蠣于桂枝甘草湯中，以求振奮心陽(yáng)，活血通絡(luò)，治療傷寒誤下所致心陽(yáng)虛，心神不能潛斂的煩躁。在心陽(yáng)的推動(dòng)和溫煦作用下心臟有節(jié)律搏動(dòng)，并維持心率、心律，是心搏跳動(dòng)之源，是心臟射血的基礎(chǔ)。竇房結(jié)是正常心臟電活動(dòng)的起源，兩方合用，加減化裁意在振奮心陽(yáng)，恢復(fù)正常竇房結(jié)功能，保證心臟正常電活動(dòng)。

近年來(lái)，研究者們發(fā)現(xiàn)房顫的電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)是維持房顫主要因素。房顫發(fā)作時(shí)伴隨的心房肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)重構(gòu)，將加劇心房?jī)?nèi)的傳導(dǎo)阻滯，成為維持房顫發(fā)生的重要基礎(chǔ)[9]。本實(shí)驗(yàn)中在透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，給予化痰祛瘀方治療后，中藥中、高濃度組大鼠心房肌細(xì)胞的肌絲較少溶解，嵴溶解明顯減少，閏盤分離現(xiàn)象改善、結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，并且房顫發(fā)作的持續(xù)時(shí)間也縮短，說明中、高濃度化痰祛瘀方治療痰濁血瘀型房顫大鼠，可改善心房肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，延緩心房肌纖維化進(jìn)程，縮短大鼠房顫發(fā)作時(shí)間。

VCAM-1是黏附因子免疫球蛋白家族成員，往往與淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞VLA-4相結(jié)合形成 VLA-4-VCAM-1復(fù)合物，繼而引發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞黏附，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷[10-11]。既往研究顯示，房顫患者的內(nèi)皮細(xì)胞損傷與血清VCAM-1水平呈正相關(guān)性[12-13]。VCAM-1也在維持血栓斑塊穩(wěn)定、防止斑塊破裂中起重要作用[14-15]。本實(shí)驗(yàn)中模型組房顫大鼠血清VCAM-1水平明顯升高，而大鼠在中、高濃度化痰祛瘀方干預(yù)后，則血清VCAM-1有所下降，說明化痰祛瘀方能保護(hù)血管內(nèi)皮。

vWF主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，密切參與動(dòng)脈血栓形成過程。其具體作用為：在血管內(nèi)皮損傷條件下，與血小板聚合，形成血小板-GPⅡb/Ⅲa-vWF復(fù)合物，促使游離端血小板聚集，導(dǎo)致血栓形成[16]；作為凝血因子Ⅷ載體蛋白，維持凝血因子Ⅷ的穩(wěn)定性[17]。既往研究顯示，房顫患者較竇律患者血管內(nèi)皮細(xì)胞損害更為嚴(yán)重，血清vWF水平更高，能夠更加敏感地反映血管內(nèi)皮損害情況[18-19]。本實(shí)驗(yàn)中，不同濃度化痰祛瘀方治療，可使vWF濃度下降，說明其能有效預(yù)防血栓形成，降低卒中風(fēng)險(xiǎn)。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，溫膽湯中陳皮、竹茹、枳殼能降低血脂，減少免疫細(xì)胞對(duì)血管壁的黏附，從而延緩血管斑塊的進(jìn)展，實(shí)現(xiàn)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用[20]。桂枝甘草龍骨牡蠣湯中富含桂皮醇、桂皮醛等物質(zhì)能有效抗血小板聚集[21-22]。甘草酸、甘草次酸、甘草黃酮在抗血栓形成的同時(shí)還能有效抗心律失常[23-25]。僵蠶的有效成分可直接影響血管內(nèi)皮細(xì)胞上凝血酶水解，延長(zhǎng)凝血時(shí)間，維持纖溶系統(tǒng)平衡，減少血栓形成[26-28]?？鄥ⅰ⒏仕蓛晌吨兴幍挠行С煞挚鄥A、甘松揮發(fā)油，能阻滯鉀、鈉離子通道，聯(lián)合使用可抗心律失常[29-31]。熟三七粉中富含的三七總皂苷，能抑制炎癥反應(yīng)，減少房顫發(fā)生頻率及發(fā)生時(shí)間[32-34]，具有抗心律失常、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[35-37]。丹參水溶性部分中有效成分丹參素可有效抑制VCAM-1表達(dá)，具有抗凝血，抗體外血栓形成作用[38-40]。

綜上所述，化痰祛瘀方對(duì)房顫大鼠治療作用較好，可縮短房顫持續(xù)時(shí)間，延緩心肌細(xì)胞纖維化，降低房顫大鼠血清中VCAM-1、vWF水平，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，降低心腦血管事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。