吳 蕾

(安徽省獸藥飼料監(jiān)察所，合肥 230091)

淫羊藿是小檗科淫羊藿屬EpimediumLinn.植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，在我國有悠久的藥用歷史[1]，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效，在養(yǎng)殖方面主要以提取物的形式應(yīng)用以提高動物的生產(chǎn)、繁殖性能，其在混合型飼料添加劑市場有著廣泛的應(yīng)用。但目前淫羊藿提取物還缺乏統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，亟需建立一個統(tǒng)一、全面、客觀的淫羊藿提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[2]。淫羊藿含多種藥理活性成分如朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷等，這些成份進(jìn)入體內(nèi)后協(xié)同發(fā)揮作用，故其質(zhì)量控制應(yīng)綜合考慮多種藥理活性成分含量的測定，才能更加全面地反映提取物的內(nèi)在質(zhì)量?！耙粶y多評法”(Quantitative Analysis of Multi-components with a Single-marker, QAMS)是近年來得到良好應(yīng)用的中藥類復(fù)雜成分評價方法，已在《中國藥典》中成功應(yīng)用于多個品種[3]。QAMS法通過測定一個易得有效成分而實(shí)現(xiàn)中藥多成分定性定量，是適合中藥特點(diǎn)的多指標(biāo)質(zhì)量控制和評價模式[4-6]。本研究以淫羊藿苷為內(nèi)標(biāo)物，建立朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C與淫羊藿苷的相對校正因子(relative correlation factor, RCF)，并對QAMS法與外標(biāo)法所得結(jié)果進(jìn)行比較，以驗(yàn)證QAMS法的可行性和準(zhǔn)確性，旨在為淫羊藿提取物多指標(biāo)成分質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；D3000高效液相色譜儀(美國Thermofisher公司)；Milli-Q超純水機(jī)(美國Millipore公司)；SQP十萬分之一電子天平(德國Sartorius公司)；KS500超聲波清洗器(寧波科生儀器廠)；VD23減壓干燥箱(德國BINDER)；恒溫水浴鍋(江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

三批淫羊藿藥材購自安徽省亳州康美中藥大市場，產(chǎn)地分別為甘肅、吉林、陜西，樣品經(jīng)合肥市食品藥品檢驗(yàn)中心王瑋主任藥師鑒定，購自吉林的藥材為朝鮮淫羊藿EpimediumkoreanumNakai，購自陜西、甘肅的藥材為柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim，藥材打粉經(jīng)乙醇回流濃縮減壓干燥后分別制備成提取物備用。另三批淫羊藿提取物由四川恒瑞通達(dá)生物科技有限公司提供，批號分別為200303、200302、200401。朝藿定A(批號110623-72-8)、朝藿定B(批號110623-73-9)、朝藿定C(批號110642-44-9)對照品均購自上海安譜有限公司，HPLC(峰面積歸一化法)純度98%；淫羊藿苷(批號110737-201516)，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，純度94.2%。乙腈、甲醇(色譜純，賽默飛世爾科技有限公司)，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法原理 QAMS法是指在多指標(biāo)質(zhì)量評價時，以藥材中某一典型組分(有對照品供應(yīng)者)為內(nèi)標(biāo)，建立該組分與其他組分之間的RCF，通過RCF計(jì)算其他組分的含量[7]。計(jì)算公式為：fkm=fk/fm=Wk×Am/Wm×Ak，Ak為內(nèi)標(biāo)物(k)峰面積，Wk為內(nèi)標(biāo)物(k)濃度，Am為其他組分(m)峰面積，Wm為其他組分(m)濃度。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 色譜條件 eclipse Plus C18柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動相乙腈-水(25∶75)，柱溫25 ℃；流速1.0 mL/min，檢測波長為270 nm，理論板數(shù)按淫羊藿苷計(jì)應(yīng)≥5000，色譜圖見圖1、圖2。

圖1 朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷對照品色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of Epimedin A, Epimedin B, Epimedin C and Icariin

圖2 淫羊藿提取物樣品色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of Epimedium extract

2.2.2 對照品溶液的制備 取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷對照品適量，精密稱定，加甲醇分別配置成濃度為1 mg/mL的儲備液。精密吸取以上儲備液各25 μL、50 μL、100 μL、200 μL、400 μL至10 mL量瓶中，甲醇定容，分別配置成2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL的混和線性標(biāo)準(zhǔn)溶液，保存于4 ℃冰箱中，備用，有效期1個月。

2.2.3 供試品溶液的制備 取淫羊藿提取物(過80目篩)0.1 g，精密稱定，至具塞錐形瓶中，加入50 mL 50%乙醇溶液，稱定重量，超聲30 min(140 W，頻率40 kHz)，放冷后再稱重，以50%乙醇補(bǔ)足重量，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述混合線性標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定,記錄峰面積。以進(jìn)樣量對峰面積積分值進(jìn)行回歸處理，分別得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表1，各標(biāo)準(zhǔn)曲線在線性范圍內(nèi)線性良好。

表1 淫羊藿提取物中4種黃酮類成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab 1 The regression equations and linear ranges of 4 chemical reference substances in Epimedium extract

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(四川恒通，批號200302)10 μL連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的峰面積，得出日內(nèi)精密度分別為2.3%、2.0%、2.4%和1.5%，連續(xù)進(jìn)樣3 d，每天6次，記錄峰面積，以上4種指標(biāo)成分日間精密度分別為2.3%、2.2%、2.0%、1.6%。

2.2.6 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(四川恒通，批號200302)，分別于配置后0、2、4、8、12、24 h注入高效液相色譜儀，依法測定,記錄峰面積，得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷穩(wěn)定性的RSD分別為2.0%、1.9%、2.5%、1.5%，表明處理后的樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按上述供試品溶液制備方法，分別稱取同一批淫羊藿提取物(四川恒通，批號200302)約0.1 g，共6份,分別進(jìn)行測定, 測得朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的平均含量分別為3.88、8.05、6.18、14.01 mg/g，RSD分別為2.1%、2.1%、2.2%、1.1%。

2.2.8 回收率試驗(yàn) 采取加樣回收率法(按1∶1加入)，取同一批已知含量的淫羊藿提取物(四川恒通，批號200302)約0.1 g共6份，精密稱定，分別精密加入一定量的2.2.2項(xiàng)下混合對照品溶液，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取上述供試品溶液10 μL，依法測定，計(jì)算回收率，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的加樣回收率分別為93.6%、95.5%、100.1%、92.4%，RSD分別為2.2%、1.8%、2.2%、2.1%。

2.3 校正因子的測定及考察

2.3.1 校正因子的測定 取2.2.2項(xiàng)下濃度為20 μg/mL對照品混合溶液，分別進(jìn)樣10 μL，測定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的峰面積，按照2.1項(xiàng)下方法分別計(jì)算朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C與內(nèi)參物淫羊藿苷間的RCF，結(jié)果見表2。

表2 相對校正因子的測定Tab 2 Results of the RCFs tests

2.3.2 校正因子的重復(fù)性試驗(yàn) 按照2.2.2項(xiàng)下方法，配制混合對照品溶液，平行4份，分別進(jìn)樣10 μL，分別計(jì)算朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C與內(nèi)參物淫羊藿苷間的RCF。表3結(jié)果顯示，RSD≤3.0%，表明RCF重復(fù)性良好。

表3 相對校正因子重復(fù)性試驗(yàn)Tab 3 Results of RCFs repeatability tests

2.3.3 校正因子的耐用性考察

2.3.3.1 不同儀器對校正因子的影響 試驗(yàn)中采用eclipse plus C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)分別在Agilent 1260和Thermofisher D3000進(jìn)樣測定，對淫羊藿類黃酮間的RCF進(jìn)行了測定。表4結(jié)果顯示，在不同品牌色譜儀上RCF無顯著性差異，RSD≤3.0%。

表4 采用不同儀器測得的相對校正因子Tab 4 RCFs measured in different instruments

2.3.3.2 不同色譜柱對校正因子的影響 試驗(yàn)中在不同高效液相色譜儀(Agilent 1260、Thermofisher D3000)上，分別試驗(yàn)2種不同品牌的色譜柱eclipse plus C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm)和Symmetry C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，對4種淫羊藿類黃酮間RCF進(jìn)行了測定。結(jié)果顯示，RCF無顯著性差異，RSD≤3.0%(表5和表6)。

表5 采用不同色譜柱測得的相對校正因子-Agilent 1260Tab 5 RCFs measured in different chromatographic columns-Agilent 1260

表6 采用不同色譜柱測得的相對校正因子-Thermofisher D3000Tab 6 RCFs measured in different chromatographic columns-Thermofisher D3000

2.3.3.3 不同柱溫對校正因子的影響 采用Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)和eclipse plus C18色譜柱，分別在不同柱溫(25、30、35 ℃)條件下對4種淫羊藿黃酮間的RCF進(jìn)行測定。表7結(jié)果顯示，RCF無顯著性差異，RSD≤3.0%。

表7 采用不同柱溫測得的相對校正因子Tab 7 RCFs measured at different temperatures

2.3.3.4 不同流速對校正因子的影響 采用Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)和eclipse plus C18色譜柱，分別在不同流速(0.9、1.0、1.1 mL/min)條件下對4種淫羊藿黃酮間的RCF進(jìn)行了測定。表8結(jié)果顯示，RCF無顯著性差異，RSD≤3.0%。

表8 采用不同流速測得的相對校正因子Tab 8 RCFs measured at different flow rates

2.3.3.5 校正因子的確定 在上述色譜條件下，分別測定不同進(jìn)樣體積時,按照2.1項(xiàng)下的方法，以淫羊藿苷(Icarrin，簡稱I)為內(nèi)標(biāo), 計(jì)算朝藿定A(Epimedin A，簡稱A)、朝藿定B(Epimedin B，簡稱B)、朝藿定C(Epimedin C，簡稱C)的RCF分別為0.831、0.820、0.918。

2.4 待測組分色譜峰的定位 本文采用相對保留值(待測成分與內(nèi)標(biāo)調(diào)整保留時間之比)作為定位標(biāo)準(zhǔn)，并在不同品牌高效液相色譜系統(tǒng)和不同色譜柱下對此參數(shù)進(jìn)行考察，見表9，各成分的相對保留值波動較小，RSD≤3.0%，表明利用相對保留值進(jìn)行峰的定位是可行的。

表9 不同儀器和色譜柱下測得的相對保留值Tab 9 Relative retention values measured in different instruments and columns

2.5 淫羊藿提取物含量測定QAMS法與外標(biāo)法的結(jié)果比較 分別稱取淫羊藿提取物(過80目篩)約0.1 g (n=4)，精密稱定，按2.2.3項(xiàng)下方法制備各供試品溶液，精密吸取各供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，依法測定。采用外標(biāo)法和QAMS法計(jì)算自提及市售的淫羊藿提取物中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷含量，見表10。外標(biāo)法測定的含量值與QAMS法測定的含量值經(jīng)t檢驗(yàn)比較，P>0.05，表明這兩種方法測得結(jié)果無顯著性差異，由此說明QAMS法可用于淫羊藿提取物的多成分質(zhì)量評價研究。

表10 不同方法所測得的黃酮類物質(zhì)含量(n=2)Tab 10 Positioning results of the 4 analytes measured by QAMS and ESM methods mg/g

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)初期分別以50%甲醇、50%乙醇、70%甲醇、70%乙醇4種提取溶劑進(jìn)行超聲提取，發(fā)現(xiàn)以50%乙醇提取30 min具有相對較高的提取率。另外通過查閱文獻(xiàn)，分別以乙腈-水、乙腈-0.02%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液等為流動相，比較其峰型、基線、分離度等，發(fā)現(xiàn)乙腈-水作為流動相既簡便又可滿足分離需求，故根據(jù)結(jié)果分析，確定了色譜條件。

本試驗(yàn)還分別考察了不同色譜柱、不同儀器下各待測組分色譜峰的保留時間及相對保留時間，結(jié)果顯示各保留時間差異顯著，但其與內(nèi)標(biāo)物的相對保留時間波動較小。因此采用相對保留時間法進(jìn)行淫羊藿藥材中各待測組分色譜峰的定位。

中藥成分的多樣性和整體作用機(jī)理，決定了單一成分不能全面反映中藥材的質(zhì)量。以《中國藥典》為代表的中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)確立了“從單指標(biāo)向多指標(biāo)、從指標(biāo)性成分向藥效成分控制”的發(fā)展方向[8-9]。QAMS法可以實(shí)現(xiàn)通過測定一種成分的含量達(dá)到多指標(biāo)控制的目的，能夠一定程度上解決中藥對照品供應(yīng)緊缺、價格昂貴等問題。在《中國藥典》中，QAMS法已成功應(yīng)用于丹參、生姜等藥材，是目前中藥質(zhì)量控制和評價模式新的發(fā)展趨勢之一[3]。淫羊藿含多種活性成分，僅依據(jù)淫羊藿苷對其進(jìn)行質(zhì)量評價，無法真實(shí)評價其內(nèi)在質(zhì)量，且淫羊藿經(jīng)歷提取過程轉(zhuǎn)換成提取物后，不同廠家提取工藝、水平不同將極大的影響提取物的質(zhì)量及藥理活性，故其質(zhì)量評價需要一個多指標(biāo)綜合性評價方式。本試驗(yàn)通過一系列方法學(xué)考察證明了QAMS法能夠綜合反映淫羊藿提取物的整體質(zhì)量且不提高分析成本，驗(yàn)證了QAMS法在淫羊藿提取物質(zhì)量控制中的可行性和適應(yīng)性，為此類中藥的質(zhì)量控制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供了參考方法。