王麗娜，田曉玲，劉鴻鶴，李欣南，郭國(guó)賢，蘭雨濛，劉 穎

(遼寧省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心，沈陽(yáng) 110016)

碘醚柳胺(C19H11Cl2I2NO3，CAS:22662-39-1，結(jié)構(gòu)式見圖1)是一種廣譜抗蠕蟲藥，是控制牛羊肝片吸蟲、大片吸蟲成蟲和幼蟲病的高效藥物，對(duì)血毛線蟲、巨片吸蟲和羊蠅蛆亦有較好作用。肝片吸蟲是一種人畜共患的食源性寄生蟲，主要寄生于哺乳動(dòng)物的膽道內(nèi)。人感染后可引起肝臟損害和出血，可造成膽管阻塞、肝實(shí)質(zhì)變性、黃疸等。分泌毒素具有溶血作用，且肝片吸蟲病的診斷較困難，往往在作出診斷之前已經(jīng)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)社會(huì)、畜牧業(yè)和人類健康帶來巨大威脅。對(duì)于此病的防治，主要靠抗肝片吸蟲藥物碘醚柳胺進(jìn)行治療，在歐洲、澳大利亞及南美等國(guó)家和地區(qū)已作為牛羊片形吸蟲病的首選藥物，被廣泛用于家禽、豬、牛等的飼料添加劑和獸藥中預(yù)防動(dòng)物疾病、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[1-6]。食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 31650-2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定碘醚柳胺在牛的肌肉、脂肪、肝和腎中最大殘留限量分別為30、30、10、40 μg/kg，在羊的肌肉、脂肪、肝和腎中最大殘留限量分別為100、250、150、150 μg/kg[7]。碘醚柳胺殘留檢測(cè)的主要方法為利用經(jīng)典的液-液分配樣品前處理、固相萃取去除雜質(zhì)[8]，高效液相色譜法[9-13]或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)[14-15]。截至目前我國(guó)尚無檢測(cè)牛羊組織中碘醚柳胺殘留量的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)也較少，主要集中在藥物劑型的研究和毒性研究，為了加強(qiáng)動(dòng)物性食品中碘醚柳胺的殘留監(jiān)控，按農(nóng)業(yè)部《農(nóng)業(yè)部關(guān)于下達(dá)2011年農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定和修訂項(xiàng)目資金的通知》(農(nóng)財(cái)發(fā)[2011]53號(hào)，任務(wù)編號(hào)為201113054)要求，制定了碘醚柳胺在牛羊組織中殘留檢測(cè)的液相色譜法，并對(duì)該方法的線性、檢測(cè)限、定量限、回收率等方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究。本方法針對(duì)牛、羊的肌肉、脂肪、肝、腎組織，建立高效液相色譜檢測(cè)方法，從而為該類藥物的殘留監(jiān)控提供科學(xué)依據(jù)。

圖1 碘醚柳胺結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structural formula of rafoxanidum

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 waters2695高效液相色譜儀(配備熒光檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司)；高速冷凍離心機(jī)(Biofuge Strators Centrifuge，德國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；均質(zhì)器(PRO250,美國(guó)Pro Scientific 公司)；氮吹儀(OA-SYS，美國(guó)Organomation Associates.Inc 公司)；MilliQ超純水器(美國(guó)Millipore公司)；碘醚柳胺對(duì)照品(純度99.0%)、乙腈(色譜純)、甲酸(色譜純)、氨水(分析純)、高氯酸(分析純)、Waters MAX固相萃取小柱(150 mg/6 mL)。牛羊組織空白試料來源于遼寧省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地建設(shè)工程中心。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取10 mg碘醚柳胺標(biāo)準(zhǔn)品，置100 mL量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，搖勻。-20 ℃保存，用乙腈稀釋成濃度為1 μg/mL對(duì)照品中間液。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：C18(4.6 mm×250 mm，粒徑5 μm)；流動(dòng)相：乙腈+0.1%甲酸溶液(85+15，V/V)；流速：1.0/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；配熒光檢測(cè)器(激發(fā)波長(zhǎng)335 nm；發(fā)射波長(zhǎng)510 nm)。

1.3.2 樣品溶液的制備

1.3.2.1 提取 稱取試料5 g(精確至±1%)于50 mL離心管中，加乙腈-丙酮溶液(80+20)15 mL，渦旋1 min，10000 r/min離心5 min，移取上清液。殘?jiān)儆?0 mL乙腈-丙酮溶液(80+20)重復(fù)提取一次，合并上清液。

1.3.2.2 凈化 固相萃取柱用乙腈-丙酮溶液(80+20)活化，加上清液，過柱。依次用乙酸乙酯5 mL、乙腈5 mL淋洗小柱，擠干。用1%甲酸乙腈溶液5 mL洗脫，收集。洗脫液于40 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?。?zhǔn)確加乙腈1 mL溶解殘?jiān)?，過0.45 μm濾膜，供高效液相色譜測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法專屬性考察 對(duì)照品溶液色譜圖見圖2。取空白牛羊組織樣品，按1.3.2項(xiàng)操作，得圖3。在上述條件下，樣品雜質(zhì)無干擾，專屬性良好。

圖2 對(duì)照品溶液色譜圖Fig 2 chromatogram of the standards

圖3 空白牛羊組織色譜圖Fig 3 chromatogram of blank tissue of sheep and cattle

2.2 線性范圍 分別精密量取適量10 μg/mL的碘醚柳胺儲(chǔ)備液，制得濃度為10、50、100、500、1000和5000 ng/mL系列對(duì)照溶液，上機(jī)測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照溶液濃度為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=898506x-8675.1，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。

2.3 檢測(cè)限與定量限的確定 空白試料按1.3.2項(xiàng)的步驟處理后，測(cè)定結(jié)果表明：在相應(yīng)的保留時(shí)間，空白試料對(duì)所測(cè)分析物無干擾。

檢測(cè)限(LOD)與定量限(LOQ)：添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于5 g空白樣品中，制成不同濃度的陽(yáng)性樣品。每個(gè)濃度5平行，重復(fù)3次。按1.3.2項(xiàng)操作經(jīng)提取凈化后上機(jī)測(cè)定，觀察藥物信噪比(S/N)和對(duì)應(yīng)藥物濃度。以S/N>3(按PtP算)作為方法檢測(cè)限，S/N>10(按PtP算)作為方法定量限。得出碘醚柳胺在牛羊肌肉、肝臟、腎臟、脂肪中的檢測(cè)限均為2.5 μg/kg，定量限均為5 μg/kg。各組織定量限回收率及精密度見表1～表8。

表1 空白羊肉中添加藥物后得到的回收率及批內(nèi)批間RSDTab 1 Results of recovery experiments and RSD in mutton(n=5)

表2 空白牛肉中添加藥物后得到的回收率及批內(nèi)批間RSDTab 2 Results of recovery experiments and RSD in beef(n=5)

表3 空白羊肝中添加藥物后得到的回收率及批內(nèi)批間RSDTab 3 Results of recovery experiments and RSD in sheep liver(n=5)

表4 空白牛肝中添加藥物后得到的回收率及批內(nèi)批間RSDTab 4 Results of recovery experiments and RSD in cattle liver(n=5)

表5 空白羊腎中添加藥物后得到的回收率及批內(nèi)批間RSDTab 5 Results of recovery experiments and RSD in sheep kidney(n=5)

表6 空白牛腎中添加藥物后得到的回收率及批內(nèi)批間RSDTab 6 Results of recovery experiments and RSD in cattle kidney(n=5)

表7 空白牛脂肪中添加藥物后得到的回收率及批內(nèi)批間RSDTab 7 Results of recovery experiments and RSD in cattle fat(n=5)

表8 空白羊脂肪中添加藥物后得到的回收率及批內(nèi)批間RSDTab 8 Results of recovery experiments and RSD in sheep fat(n=5)

2.4 方法的精密度 按1.3.2項(xiàng)操作，根據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 31650-2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》[7]中規(guī)定碘醚柳胺在牛和羊的肌肉、脂肪、肝和腎中最大殘留限量(MRL)分別制備低(1/2MRL)、中(MRL)、高(2MRL)三個(gè)濃度水平的質(zhì)量控制(QC)樣品，每一濃度進(jìn)行5樣本分析，重復(fù)3次。根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行樣品的濃度測(cè)定，求批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算結(jié)果見表1～表8。結(jié)果表明，空白肌肉、肝臟、腎臟、脂肪中15～500 ng/g添加濃度范圍內(nèi)的回收率為77.4%～93.8%，批內(nèi)批間RSD值均<15%。

2.5 回收率試驗(yàn) 按1.3.2項(xiàng)操作，制備低(1/2MRL)、中(MRL)、高(2MRL)三個(gè)濃度水平的質(zhì)量控制(QC)樣品，每一濃度進(jìn)行5樣本分析，根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行樣品的濃度測(cè)定。結(jié)果表明，空白肌肉、肝臟、腎臟、脂肪中15～500 ng/g添加濃度范圍內(nèi)的回收率為77.4%～93.8%，具體結(jié)果見表1～表8。

3 討論與小結(jié)

3.1 分析條件的優(yōu)化 碘醚柳胺在丙酮中溶解，在氯仿或乙酸乙酯中略溶，在甲醇中微溶，在水中不溶[16-17]。通過大量查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，實(shí)驗(yàn)中最先參考已經(jīng)報(bào)道的1%三乙胺乙腈[9]，磷酸-檸檬酸緩沖液[10]，乙腈[12]作為提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述三種提取液對(duì)于腎臟和脂肪提取回收率小于60%，且圖譜中干擾物質(zhì)較多，說明該方法不適用于基質(zhì)復(fù)雜的肝臟和脂肪，為了提高回收率，選擇乙腈-丙酮作為萃取溶劑，兼顧了丙酮的溶解性和乙腈的沉淀組織蛋白能力，獲得較好的提取效果，并有效去除了組織中蛋白質(zhì)等雜質(zhì)干擾。本文比較了乙腈和丙酮溶液不同比例的提取效果，結(jié)果表明當(dāng)乙腈-丙酮溶液體積比為80∶20時(shí)提取效果最佳，回收率最高，雜質(zhì)干擾最少。

MAX固相萃取柱(150 mg/6 mL)的填料是一種反相和陰離子交換復(fù)合模式“水可浸潤(rùn)型”聚合物吸附劑。該基質(zhì)潔凈，在pH 0～14范圍內(nèi)都穩(wěn)定，在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定，比表面積高，交換容量大，對(duì)酸性化合物具有高度的選擇性和靈敏度。本研究對(duì)比了HLB、C18、MAX固相萃取小柱，對(duì)添加回收率考察和雜質(zhì)干擾進(jìn)行分析，結(jié)果表明HLB固相萃取柱回收率低于 C18和MAX固相萃取柱。進(jìn)一步比較了C18和MAX固相萃取柱的凈化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C18固相萃取柱對(duì)于肝臟和脂肪的凈化效果差，雜質(zhì)干擾多，而MAX固相萃取柱對(duì)牛羊組織均有較好的凈化效果。

3.2 流動(dòng)相的選擇 參照文獻(xiàn)[9-10,12]，對(duì)比了乙腈-0.02 mol/L乙酸銨、甲醇、乙腈∶水(85∶15),乙腈+0.1%甲酸水(85+15)。結(jié)果顯示，上述四種流動(dòng)相，只有乙腈+0.1%甲酸水(85+15)能夠?qū)?duì)照品與牛羊所有組織雜質(zhì)完全分開，且無干擾。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 參照文獻(xiàn)[9-13,15-17]，發(fā)現(xiàn)碘醚柳胺檢測(cè)大多選擇選擇紫外檢測(cè)器，由于牛羊組織中基質(zhì)復(fù)雜，含有大量的脂肪和蛋白質(zhì)，待測(cè)物質(zhì)容易受到干擾，影響色譜分離。為了降低雜質(zhì)的干擾，本文選擇熒光檢測(cè)器，熒光檢測(cè)器專屬性強(qiáng)，選擇性好，靈敏度高，且只對(duì)熒光物質(zhì)有響應(yīng)，能夠有效降低基質(zhì)干擾，提升檢測(cè)靈敏度。應(yīng)用熒光檢測(cè)器進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示碘醚柳胺在激發(fā)波長(zhǎng)335 nm；發(fā)射波長(zhǎng)510 nm處，雜質(zhì)干擾小，響應(yīng)值最大。

本試驗(yàn)建立的樣品前處理分析方法凈化效果好，回收率高，專屬性強(qiáng)、靈敏度高，測(cè)得碘醚柳胺在肌肉、肝臟、腎臟、脂肪中的檢測(cè)限均為2.5 μg/kg，定量限均為5 μg/kg，回收率在77.4%～93.8%之間，適用于牛羊組織中碘醚柳胺殘留量檢測(cè)。