薛 霜，徐 松，鄭 成，徐丹丹，胡玉立，劉國(guó)興，李婷婷，石寶蘭，漆世華，謝紅玲

(國(guó)藥集團(tuán)動(dòng)物保健股份有限公司，武漢430075)

豬瘟是由豬瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)引起豬的一種急性、高度接觸性、致死性的傳染病。該病流行廣泛，發(fā)病與死亡率高，一年四季豬不分年齡均可發(fā)生，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。CSFV屬于黃病毒科瘟病毒屬成員，為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組長(zhǎng)約12.3 kb，由中間一個(gè)大的開放閱讀框(open reading frame, ORF)和兩端非編碼區(qū)5’-UTR(untranslated region)及3’-UTR構(gòu)成。ORF編碼一個(gè)由3898個(gè)氨基酸殘基組成的多聚蛋白，并在翻譯過程中或翻譯后被病毒自身編碼的蛋白酶和宿主細(xì)胞的蛋白水解酶加工切割成12種蛋白質(zhì)[1-3]。其中E2蛋白是CSFV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在CSFV中相對(duì)保守，是引起豬產(chǎn)生針對(duì)豬瘟保護(hù)性抗體的主要抗原，在豬瘟診斷和新型基因工程疫苗的研究上都起著重要作用[4-5]。

據(jù)報(bào)道，已有多種表達(dá)體系對(duì)CSFV E2蛋白進(jìn)行了成功表達(dá)。其中原核表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)周期快、表達(dá)量高、成本低等優(yōu)勢(shì)，但該系統(tǒng)不具有完善的蛋白翻譯修飾功能，表達(dá)的E2蛋白與天然蛋白有差異，免疫原性較差，大部分只能用于抗體檢測(cè)。CSFV E2蛋白的真核表達(dá)系統(tǒng)目前主要有酵母、桿狀病毒及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。其中前兩種表達(dá)系統(tǒng)主要優(yōu)點(diǎn)為蛋白表達(dá)量高，但存在表達(dá)量不穩(wěn)定的問題，而且所表達(dá)的目的蛋白加工修飾與蛋白本身的天然結(jié)構(gòu)存在差異，如糖基化水平和糖鏈結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致所表達(dá)蛋白的免疫原性及功能活性受到影響。而哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的翻譯修飾體系是最為完善的，該系統(tǒng)表達(dá)的重組外源蛋白最接近天然構(gòu)象。目前哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)大多為貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，在培養(yǎng)過程中需要加入外源血清，不僅增加了生產(chǎn)成本而且對(duì)下游上清中目的蛋白的純化造成影響。本研究選用可無血清懸浮培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞，并利用慢病毒包裝系統(tǒng)，建立了能穩(wěn)定表達(dá)CSFV E2蛋白的BHK細(xì)胞系，為E2蛋白功能研究及基因工程豬瘟疫苗的研制提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 BHK-21細(xì)胞、293T細(xì)胞、pCDH-CMV-IRES-EGFP-EF1-Puro質(zhì)粒由國(guó)藥集團(tuán)動(dòng)物保健股份有限公司實(shí)驗(yàn)室改造并保存；包裝質(zhì)粒pMD2.G、psPAX2購自北京擎科生物科技有限公司；Trans-stb13化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物公司。

1.2 主要試劑 PrimeSTAR HS DNA聚合酶、DNA片段回收純化試劑盒、質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、CpoⅠ內(nèi)切酶、NotⅠ內(nèi)切酶、SolutionⅠ快速連接酶均購自寶生物工程(大連)有限公司；嘌呤霉素購自北京索萊寶科技有限公司；HRP-羊抗小鼠IgG、DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；CSFV E2單抗由國(guó)藥集團(tuán)動(dòng)物保健股份有限公司實(shí)驗(yàn)室制備和保存；Ni-IDA親和層析柱購自中科森輝微球技術(shù)(蘇州)有限公司。

1.3 重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及慢病毒包裝 參考豬瘟病毒(C株)基因序列，對(duì)E2蛋白核苷酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，同時(shí)去除C端跨膜區(qū)的34個(gè)氨基酸，并在5’和3’端分別引入CpoⅠ和NotⅠ限制性酶切位點(diǎn)，在3’端引入6×His標(biāo)簽。優(yōu)化后的CSFV E2基因由北京擎科生物科技有限公司合成。分別用CpoⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)慢病毒表達(dá)載體pCDH-CMV-IRES-EGFP-EF1-Puro和合成的截短E2基因進(jìn)行雙酶切，膠回收約1061 bp大小的目的片段和8720 bp大小的載體片段，用SolutionⅠ連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans-stb13感受態(tài)細(xì)胞，之后挑取陽性菌提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定，獲得的陽性重組質(zhì)粒命名為pCDH-E2。將構(gòu)建的重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pCDH-E2與包裝質(zhì)粒pMD2.G、psPAX2共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝。

1.4 穩(wěn)定表達(dá)E2蛋白的細(xì)胞株篩選

1.4.1 細(xì)胞感染 準(zhǔn)備一塊6孔細(xì)胞板，每孔接種1×105～4×105對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的BHK-21貼壁細(xì)胞，分別設(shè)置空白孔、Control對(duì)照慢病毒孔和目的基因慢病毒孔，37 ℃培養(yǎng)過夜，當(dāng)細(xì)胞密度在40%～60%時(shí)進(jìn)行慢病毒感染；根據(jù)待感染細(xì)胞的 MOI值，分別往細(xì)胞中加入適量的Control對(duì)照慢病毒和目的慢病毒，混勻后，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)過夜。

1.4.2 穩(wěn)定細(xì)胞株篩選 12～24 h后，給細(xì)胞更換正常的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 48～72 h后加入終濃度為10 μg/mL的嘌呤霉素進(jìn)行陽性細(xì)胞系的篩選。每2 d更換新的培養(yǎng)基(含10 μg/mL的嘌呤霉素)，直到培養(yǎng)皿中不再出現(xiàn)細(xì)胞死亡，同時(shí)觀察綠色熒光。將藥物篩選后的混合穩(wěn)定克隆株消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，吸取100個(gè)細(xì)胞接種于10 mL培養(yǎng)基(含10 μg/mL的嘌呤霉素)中，吸打混合均勻后加入96孔細(xì)胞板中，100 μL/孔。3～5 d后，在顯微鏡下標(biāo)出只含有單個(gè)細(xì)胞克隆的有綠色熒光的細(xì)胞孔進(jìn)行傳代擴(kuò)增。擴(kuò)增到合適的細(xì)胞量后，進(jìn)行無血清懸浮培養(yǎng)及蛋白表達(dá)，將篩選后的穩(wěn)定細(xì)胞株命名為BHK-LV-E2。

1.4.3 E2蛋白的表達(dá)及純化 將傳代至第10代懸浮培養(yǎng)狀態(tài)較好(活力>90%)的BHK-LV-E2細(xì)胞株按0.6×106/mL初始細(xì)胞密度，置于37 ℃恒溫?fù)u床中進(jìn)行蛋白表達(dá)，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)并取樣，將CSFV E2單抗以1∶500倍稀釋作為一抗，辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體1∶1500倍稀釋作為二抗，Western Blot分析E2蛋白的表達(dá)情況。收獲第7天的表達(dá)樣品，離心取上清進(jìn)行Ni柱純化，收集純化過程各階段樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組慢病毒表達(dá)載體的鑒定 構(gòu)建的重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pCDH-E2經(jīng)CpoⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定顯示，可酶切出一條約1061 bp大小的目的片段和一條約8720 bp大小的載體片段(圖1)，同時(shí)測(cè)序結(jié)果也顯示合成的E2基因片段已正確插入表達(dá)載體中。

1：重組質(zhì)粒pCDH-E2的CpoⅠ/NotⅠ雙酶切產(chǎn)物；M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)1: Enzyme digestion products of pCDH-E2 plasmid by CpoⅠ/NotⅠ; M: DNA Marker

2.2 穩(wěn)定表達(dá)CSFV E2蛋白的細(xì)胞株篩選 表達(dá)質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，獲得重組慢病毒LV-E2。LV-E2感染BHK-21細(xì)胞后采用嘌呤霉素抗性篩選結(jié)合有限稀釋法挑取單細(xì)胞克隆進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選。結(jié)果顯示，篩選后的細(xì)胞形態(tài)正常，由于pCDH-CMV-IRES-EGFP-EF1-Puro質(zhì)粒攜帶綠色熒光蛋白基因EGFP，因此在倒置熒光顯微鏡下細(xì)胞顯示綠色熒光(圖2)。將篩選后獲得的陽性克隆進(jìn)行懸浮擴(kuò)大培養(yǎng)，取第10代懸浮培養(yǎng)的陽性細(xì)胞克隆株進(jìn)行蛋白表達(dá)穩(wěn)定性鑒定，Western blot分析結(jié)果顯示所構(gòu)建的BHK-LV-E2細(xì)胞傳至第10代仍能穩(wěn)定表達(dá)CSFV E2蛋白(圖3)。使用鎳離子親和層析柱對(duì)表達(dá)的E2蛋白進(jìn)行純化，結(jié)果顯示當(dāng)洗脫緩沖液中咪唑濃度為500 mmol/L時(shí)，可得到較為理想的純化蛋白條帶，且純化后的蛋白純度可達(dá)到90%以上(圖4)。

圖2 篩選后的陽性細(xì)胞熒光觀察結(jié)果(100×)Fig 2 Fluorescence observation results of positive cells(100×)

1～7：分別為BHK-LV-E2細(xì)胞表達(dá)1～7 d樣品；M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)1～7: Samples of BHK-LV-E2 cells expressed for 1～7 days; M: Protein Marker

1：表達(dá)樣品原液；2：流穿液；3～5：洗雜液；6～11：目的蛋白洗脫液；M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)1: Original liquid of expression sample； 2: Flow through liquid；3～5: Wash liquid； 6～11: Purified E2 proteins; M: Protein Marker

3 討論與結(jié)論

近年來各種病原變異新毒株層出不窮，豬場(chǎng)所使用的疫苗毒株也種類繁多，減毒疫苗和滅活疫苗混用，造成豬場(chǎng)的疫病防控現(xiàn)狀非常復(fù)雜。特別是某些已經(jīng)感染其他病原的豬場(chǎng)免疫減毒活疫苗的時(shí)候可能出現(xiàn)多種病原相互協(xié)同、相互促進(jìn)的現(xiàn)象，反而造成豬場(chǎng)疫病的爆發(fā)。對(duì)于CSFV，傳統(tǒng)的豬瘟減毒活疫苗C株的保護(hù)效果有目共睹，但是基于目前豬場(chǎng)復(fù)雜的防疫現(xiàn)狀，更為安全的豬瘟滅活疫苗將能更好地滿足目前的疫病防控需求。亞單位疫苗是病毒粒子的一部分，不含有核酸，具有安全性好、穩(wěn)定性強(qiáng)和無需滅活的優(yōu)點(diǎn)。E2蛋白是CSFV上最主要的抗原蛋白，能夠誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，具有良好的免疫原性，可制成標(biāo)記性疫苗通過抗體檢測(cè)區(qū)分疫苗免疫豬及野毒感染豬，用于豬場(chǎng)凈化評(píng)估。因此E2蛋白是研制CSFV新型重組疫苗和抗體檢出方法的重要候選抗原[6-7]。獲得高純度的E2蛋白是研制E2亞單位疫苗的重要基礎(chǔ)。相對(duì)于原核表達(dá)系統(tǒng)而言，哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有翻譯后加工與修飾表達(dá)蛋白的能力，表達(dá)出的蛋白更接近于病毒天然抗原蛋白結(jié)構(gòu)，且通常可分泌于細(xì)胞上清中，有利于目的蛋白的純化[8]。目前，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞系的方法常用的有慢病毒感染與真核表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。相較于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞的方法，慢病毒表達(dá)系統(tǒng)具有構(gòu)建周期短和高效的表達(dá)特性[9-10]。

CSFV E2蛋白屬于跨膜蛋白，為使E2蛋白能夠可溶性的表達(dá)于細(xì)胞上清中并利于蛋白的進(jìn)一步純化，本研究將編碼E2蛋白跨膜區(qū)的基因刪除后引入了His純化標(biāo)簽。并且本研究使用的pCDH-CMV-IRES-EGFP-EF1-Puro質(zhì)粒是經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室改造優(yōu)化后的一種慢病毒載體質(zhì)粒，可實(shí)現(xiàn)目的基因和篩選標(biāo)記基因共用一個(gè)啟動(dòng)子高效表達(dá)，提高多基因穩(wěn)定共表達(dá)細(xì)胞株的篩選效率。因此，通過對(duì)綠色熒光的觀察即可評(píng)估細(xì)胞的抗性篩選效果，并且可以使用流式細(xì)胞分選儀將綠色熒光強(qiáng)的細(xì)胞分選富集起來，這樣大大加快了篩選高表達(dá)目的蛋白單克隆細(xì)胞的速度。此外，構(gòu)建的重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pCDH-E2含有經(jīng)真核細(xì)胞偏嗜性密碼子優(yōu)化的編碼CSFV E2蛋白的基因，且在E2基因上游加入了信號(hào)肽促進(jìn)E2蛋白的分泌表達(dá)。研究結(jié)果顯示，經(jīng)抗性篩選結(jié)合有限稀釋法挑取單細(xì)胞克隆進(jìn)行多輪篩選后，在熒光顯微鏡下觀察，所有細(xì)胞都顯示綠色熒光，表明成功篩選出陽性單克隆細(xì)胞。本研究選用了適合無血清懸浮培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞作為表達(dá)細(xì)胞，該細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖速度較快，特別適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，且表達(dá)的E2蛋白是分泌在細(xì)胞上清中的，均為加工成熟的蛋白，免疫原性更好。使用無血清的培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，在能夠大批量獲得E2蛋白的同時(shí)可避免蛋白純化時(shí)的血清干擾，從而提高蛋白純度，節(jié)約生產(chǎn)成本。Western bolt檢測(cè)第10代細(xì)胞的表達(dá)，結(jié)果顯示E2基因已經(jīng)整合到宿主細(xì)胞的基因組中。應(yīng)用鎳離子親和層析柱對(duì)表達(dá)的E2重組蛋白進(jìn)行了純化，純度可達(dá)90%以上。本研究成功構(gòu)建了可穩(wěn)定表達(dá)CSFV E2蛋白的BHK-LV-E2細(xì)胞系，該細(xì)胞系表達(dá)的E2抗原易于純化，為深入探討 CSFV E2蛋白的生物學(xué)特性和CSFV基因工程疫苗研制提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。