陳亞蘭，牛 春，張 萍

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川 750101)

泰樂菌素(Tylosin)是一種由弗氏鏈霉菌(Streptomycesfradiae)產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類獸用抗生素，外觀為淡黃色粉末，微溶于水，易溶于有機溶劑，呈弱堿性[1]，由美國研究者Hamill等[2]于1959年發(fā)現(xiàn)，是國際上目前使用最廣泛的獸用抗生素之一[3-4 ]。泰樂菌素對革蘭陽性菌、某些革蘭陰性球菌、支原體、分枝桿菌、螺旋體及原蟲等有抑制作用，常用于防治由支原體感染引起的豬氣喘病，也可以治療豬痢疾、萎縮性鼻炎、關(guān)節(jié)炎、豬丹毒、鉤端螺旋體病等[5]。此外泰樂菌素還可添加到飼料中作為畜禽的抗菌促生長添加劑，促進畜、禽的生長以及對飼料的利用率，被廣泛地應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)及獸醫(yī)治療，所以國際國內(nèi)市場需求量極大[6-8]。目前，在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中，弗氏鏈霉菌是泰樂菌素的主要生產(chǎn)菌[9-11]。泰樂菌素主要由泰樂菌素A、泰樂菌素B、泰樂菌素C和泰樂菌素D四種組分構(gòu)成，其中泰樂菌素A為主要組分，且生物活性最強。工業(yè)生產(chǎn)上要求A組分含量≥85%，四種組分的總含量≥95%。

弗氏鏈霉菌泰樂菌素生物合成基因簇(tylgene cluster)從抗性基因tylB延伸至tlrC，約85 kb，含43個ORFs提供泰樂菌素合成所需完整的結(jié)構(gòu)基因，其中tylF編碼的大菌素-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(Macrocin-O-Methyltransferase)催化泰樂菌素 C3 位羥基的甲基化反應(yīng)[12]，催化泰樂菌素C轉(zhuǎn)化為泰樂菌素A，泰樂菌素 C3 位羥基的甲基化反應(yīng)是泰樂菌素生物合成的最后一步，也是限速反應(yīng)[13]；tylE編碼去甲基大菌素-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(Demethylmacrocin-O-methyltransferase)催化去甲基大菌素轉(zhuǎn)化為大菌素(Macrocin, tylosin C)；tylCV編碼碳霉糖轉(zhuǎn)移酶(Mycarosyl transferase)，負責(zé)將碳霉糖(Mycarose)轉(zhuǎn)移到去甲基拉克亭霉素(Demethyllactinomycin)，合成去甲基大菌素(Demethylmacrocin)。

外源基因?qū)腈溍咕某Ｓ梅椒ㄓ蠵EG介導(dǎo)的原生質(zhì)體法、電轉(zhuǎn)化法和接合轉(zhuǎn)移法[14-15]，相較于其他兩種方法，接合轉(zhuǎn)移法除了操作簡單外，還可以避開包外核酸酶，一定程度上能克服鏈霉菌對外源基因的限制[16]，在鏈霉菌遺傳操作中廣泛應(yīng)用。鏈霉菌工程菌構(gòu)建中常用的載體為pSET152整合型表達載體，含阿泊拉霉素抗性基因，能通過噬菌體 φC31 的attB位點特異性整合到鏈霉菌染色體上[17-18 ]，是鏈霉菌常用的質(zhì)粒。紅霉素抗性基因啟動子(permE)是已知的鏈霉菌組成型強啟動子，它常用于在鏈霉菌中提高目的基因(簇)的表達水平，以方便目的基因(簇)的表達產(chǎn)物或所生物合成化合物的檢測，以及提高目標(biāo)化合物的生物合成水平等[19-20]。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒 弗氏鏈霉菌、質(zhì)粒pSET152(含有紅霉素抗性基因啟動子permE)均由寧夏泰瑞制藥股份有限公司保藏。

1.2 載體、限制性內(nèi)切酶和試劑 質(zhì)粒提取試劑盒、DNA回收試劑盒、全基因組提取試劑盒和各種酶均購自TakaRa公司。

1.3 培養(yǎng)基和抗生素 大腸桿菌的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基；弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基為高氏一號培養(yǎng)基；大腸桿菌-鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基；孢子預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基為2×YT；發(fā)酵培養(yǎng)基采用公司內(nèi)部培養(yǎng)基[21]。

LB中氨芐青霉素(Ampicillin, Amp)使用量為25 μg/mL，安普霉素(Apramycin, Apr)儲存濃度為50 μg/mL, 卡那霉素(Kanamycin, Kan)的使用量為25 μg/mL，萘啶酮酸(Naphthylpyruvic acid, Nap)的使用量為50 μg/mL。

1.4 目的基因的獲取 從GenBank下載permE、tylF、tylE和tylCV的基因序列，根據(jù)序列使用引物設(shè)計軟件 Primer Premier 5分別設(shè)計permE、tylF、tylE和tylCV的重疊延伸PCR引物(表1)，其中permE的上游和tylCV的下游分別引入EcoRV和XbaI酶切位點。以弗氏鏈霉菌全基因組為模板，PCR擴增獲得所需要的目的基因片段，純化后置于-20 ℃保存，備用。

表1 目的基因擴增引物及酶切位點Fig 1 Primers and restriction sites for target gene amplification

1.5 重組片段permE-tylF-tylE-tylCV的獲得 用重疊延伸PCR法連接permE、tylF、tylE和tylCV基因，實驗方法為：以permE和tylF為模板，用引物P-f/F-r擴增獲得permE-tylF基因片段，純化后-20 ℃保藏；以permE-tylF和tylE為模板，用引物P-f/E-r擴增獲得permE-tylF-tylE基因片段，純化后-20 ℃保藏；以permE-tylF-tylE為模板，用引物P-f/CV-r擴增獲得permE-tylF-tylE-tylCV基因片段，純化后-20 ℃保藏。

1.6 構(gòu)建重組載體pSET152-permE-tylF-tylE-tylCV使用EcoRV和XbaI酶37 ℃，過夜酶切pSET152質(zhì)粒和permE-tylF-tylE-tylCV基因片段，回收酶切產(chǎn)物。按照目的基因與載體的摩爾比為7的比例加入酶切后的pSET152質(zhì)粒和permE-tylF-tylE-tylCV基因片段，16 ℃的溫度下在T4 DNA連接酶的作用下過夜反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5a大腸桿菌后再轉(zhuǎn)入ET12567大腸桿菌，篩選陽性克隆子。

1.7 ET12567(pUZ8002, pSET152)與弗氏鏈霉菌的接合轉(zhuǎn)移 將轉(zhuǎn)化子的過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接在LB中，在50 μg/mL的安普霉素條件下，37 ℃培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，到合適濃度(OD600在0.4～0.6)收集菌體；用等體積新鮮的LB洗滌菌體兩次洗掉抗生素，0.1倍體積的LB懸浮備用。刮取適量孢子研磨，將研磨液于漏斗中過濾，收集濾液，50 ℃熱激10 min，冷卻到室溫后加入等體積的2×YT孢子預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基；37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)2～4 h，3000 r/min離心收集孢子，并懸浮于1 mL的培養(yǎng)液中，打散孢子備用；按照供受比為10∶1(或1∶1)將處理過的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)物和孢子懸液混合，混勻后涂布平板[22-23]。培養(yǎng)21 h后覆蓋萘啶酮酸(50 μg/mL)和安普霉素(50 μg/mL)。

1.8tylF、tylE和tylCV基因雙拷貝菌株泰樂菌素效價檢測 將適量弗氏鏈霉菌菌絲體與接合子的菌絲體接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、230 r/min連續(xù)培養(yǎng)7 d后，取硫酸鋁酸化后的上清液檢測泰樂菌素效價，檢測方法參見文獻[24]。

1.9 接合子的分子水平驗證 將出發(fā)菌與接合子的菌絲接種到含有Apr的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長后期，提取全基因組。分別以引物P-f/CV-r進行PCR擴增。

2 結(jié)果與分析

2.1permE、tylF、tylE和tylCV基因的擴增 以弗氏鏈霉菌全基因組為模板，分別用引物P-f/P-r、F-f/F-r、E-f/E-r、CV-f/CV-r擴增強啟動子permE、tylF、tylE和tylCV基因，基因片段大小為270 bp(圖1a)、735 bp(圖1b)、1188 bp(圖1c)和1386 bp(圖1 d)，將PCR產(chǎn)物純化后保藏至-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 重疊延伸PCR法連接permE、tylF、tylE和tylCV基因 通過重疊延伸PCR法獲得重組基因片段permE-tylF-tylE-tylCV，大小約為3500 bp，電泳結(jié)果如圖2所示，在3500 bp處出現(xiàn)單一、清晰的條帶，說明重組片段連接正確，可用于后續(xù)實驗。將該片段膠回收后于-20 ℃保藏備用。

圖2 重組基因片段permE-tylF-tylE-tylCV電泳圖Fig 2 Electrophoretic diagram of recombinant gene fragment permE-tylF-tylE-tylCV

2.3 供體菌的構(gòu)建 篩選到一株陽性克隆子，提取質(zhì)粒進行PCR驗證(圖3)和酶切驗證(圖4)，在約3500 bp處擴增出了目的條帶，使用EcoRV和XbaI也切出了約3500 bp大小的片段，結(jié)合空載體的酶切結(jié)果(圖5)，初步說明pSET152-permE-tylF-tylE-tylCV重組載體構(gòu)建成功，測序結(jié)果表明tylF、tylE和tylCV基因均與GenBank上發(fā)表的序列相同。至此，pSET152-permE-tylF-tylE-tylCV重組載體構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實驗。

圖3 pSET152-permE-tylF-tylE-tylCV重組載體PCR驗證結(jié)果Fig 3 PCR verification results of recombinant vector pSET152-permE-tylF-tylE-tylCV

圖4 pSET152-permE-tylF-tylE-tylCV重組載體酶切驗證結(jié)果Fig 4 Results of enzyme digestion verification of recombinant vector pSET152-permE-tylF-tylE-tylCV

圖5 pSET152載體酶切結(jié)果Fig 5 pSET152 vector digestion result

2.4 重組菌株的搖瓶發(fā)酵驗證 從接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)皿中共挑選了20個單菌落，并將其于試管斜面培養(yǎng)，培養(yǎng)12 d后僅有13個單菌落斜面長勢較好，斜面孢子層較厚，呈白色。刮取適量帶有少量培養(yǎng)基的斜面孢子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進行搖瓶發(fā)酵驗證，培養(yǎng)7 d后測定效價(連續(xù)培養(yǎng)3批)，結(jié)果如表2所示。其中3、6、7、8、9、10和13號連續(xù)三批的效價趨于穩(wěn)定，且高于出發(fā)菌株，分別高出約12%、9%、9%、18%、23%、29%和21%。用液相色譜儀分析3、6、7、8、9、10和13號單菌落的發(fā)酵液，結(jié)果如表3所示。通過表2可得，7、8、9、10、13號單菌落發(fā)酵液中泰樂菌素A的含量顯著(P≤0.05)高于出發(fā)菌，其中10號單菌落泰樂菌素A在10.778 min出峰(圖6)，相對峰面積為59.07%，高出出發(fā)菌11.66%。同樣，10號單菌落的泰樂菌素C也顯著(P≤0.05)高于其它4株菌和出發(fā)菌，而泰樂菌素B和泰樂菌素D的變化不顯著，說明增加tylE和tylCV基因的拷貝數(shù)可有效提高泰樂菌素C的含量，增加tylF基因的拷貝數(shù)可積累泰樂菌素A。

圖6 RTL21-10單菌落發(fā)酵液液相色譜峰圖Fig 6 Liquid chromatographic peak of fermentation broth of RTL21-10 single colony

表2 連續(xù)3批發(fā)酵搖瓶效價測定情況Tab 2 Determination of fermentation titer for three consecutive batches of shaker

表3 各單菌落發(fā)酵液組分Tab 3 Components of fermentation broth of each single colony

2.5 工程菌株的PCR驗證 提取 RTL21-10單菌落的全基因組，并以該全基因組為模板，用引物P-f/CV-r擴增permE-tylF-tylE-tylCV片段，電泳結(jié)果如圖7所示，在3500 bp處有單一、清晰的條帶，說明弗氏鏈霉菌tylF、tylE、tylCV雙拷貝工程菌構(gòu)建成功。

圖7 RTL21-10號單菌落PCR驗證結(jié)果Fig 7 PCR verification results of RTL21-10 single colony

3 討 論

本研究成功構(gòu)建了一株雙拷貝tylE、tylF和tylCV基因的高產(chǎn)泰樂菌素工程菌株，以上三個基因由強啟動子permE啟動表達，以確保發(fā)酵過程中工程菌的穩(wěn)定性，強化雙拷貝的tylF、tylE和tylCV基因的表達。采用以上策略，獲得一株弗氏鏈霉菌工程菌，單菌落編號為RTL21-10，效價比出發(fā)菌高出29%，利用液相色譜對RTL21-10單菌落的發(fā)酵液進行分析，各組分均優(yōu)于對照菌株。由此可見，增加泰樂菌素合成途徑中的相關(guān)基因的拷貝數(shù)可提高抗生素的產(chǎn)量，也可優(yōu)化組分。本研究成功構(gòu)建了高產(chǎn)泰樂菌素工程菌株，該方法為弗氏鏈霉菌的遺傳改造提供參考，具有重要的研究意義。

增加合成代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的拷貝數(shù)是鏈霉菌代謝工程育種的有效手段[25]，tylF基因編碼的大菌素-O-甲基轉(zhuǎn)移酶是限速酶，可催化泰樂菌素 C3 位羥基的甲基化反應(yīng)[26]。范亮等[27]構(gòu)建具有雙拷貝tylF基因的泰樂菌素基因工程菌，以解決泰樂菌素基因生物合成的限速環(huán)節(jié)，重組菌株泰樂菌素的發(fā)酵單位較出發(fā)菌株提高32.7%。馬次郎[28]等人構(gòu)建了雙拷貝tylD、tylF、tylJ基因的泰樂菌素工程菌，泰樂菌素發(fā)酵搖瓶效價較出發(fā)菌株提高了28.1%，該菌株tylD、tylF、tylJ表達水平高于出發(fā)菌株，并且在進入穩(wěn)定期后期表達量達到最大值。何翔宇[29]利用 Red/ET 同源重組技術(shù)構(gòu)建含有完整泰樂菌素生物合成基因簇的質(zhì)粒 pBAC-tyl，并將該質(zhì)粒在白色鏈霉菌 J1074(StreptomycesalbusJ1074)中進行異源表達，泰樂菌素的發(fā)酵產(chǎn)量達到 14.6 mg/L。此外，陳文青[30]利用紅霉素抗性基因啟動子permE在弗氏鏈霉菌中異源表達vhb基因，在5L發(fā)酵罐條件下研究發(fā)現(xiàn)，VHb蛋白的表達顯著促進了泰樂菌素合成與菌體的生長，這種作用越是在限氧條件下，表現(xiàn)的越是明顯。但是，在工業(yè)生產(chǎn)過程中，隨著泰樂菌素產(chǎn)量的不斷提高，部分泰樂菌素被還原為雷諾霉素(Relomycin)—— 一種嚴重影響泰樂菌素產(chǎn)品質(zhì)量的副產(chǎn)物，Huang等[31]從弗氏鏈霉菌中純化了該酶，并對其性質(zhì)進行了初步研究，確定了泰樂菌素還原酶隸屬于醛酮還原酶家族，朱慧等[32]的研究結(jié)果也證實了醛酮還原酶可催化還原泰樂菌素。

本研究成功構(gòu)建了高產(chǎn)泰樂菌素的工程菌株，但對tylE、tylF以及tylCV基因的表達情況還需進一步研究，以更深入的了解弗氏鏈霉菌工程菌株的代謝途徑。同時，在泰樂菌素的工業(yè)生產(chǎn)中，一方面可通過增加關(guān)鍵基因的拷貝數(shù)以提高泰樂菌素的產(chǎn)量，另一方面可通過抑制醛酮還原酶的活性以達到積累泰樂菌素的目的。