張 妤,孫冰清,姜 芹,顧 欣,吳雨珊,張文剛,商 軍

(上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103)

腸球菌(Enterococcus)屬于革蘭氏陽性球菌，廣泛存在于土壤、植物以及人類和動物胃腸道中，是人類及動物腸道中常見菌群之一，也是條件致病菌，可引起人及動物多種疾病[1-2]。腸球菌具有堅(jiān)厚的細(xì)胞壁，對頭孢菌素、氨基糖苷類等多種抗菌藥物天然耐藥，同時(shí)它可通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子-基因盒系統(tǒng)等方式從其他細(xì)菌獲取耐藥基因，從而產(chǎn)生獲得性耐藥[3]。腸球菌屬中較為常見的是糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)和屎腸球菌(EnterococcusFaecium)[4]。糞腸球菌常被報(bào)道為致病性或潛在致病性細(xì)菌的耐藥基因貯藏庫[5]。同時(shí)，腸球菌引起的感染病例中，屎腸球菌的感染比例呈現(xiàn)出上升趨勢[6]。中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)統(tǒng)計(jì)顯示，醫(yī)院臨床病例中分離得到的腸球菌多重耐藥現(xiàn)象十分嚴(yán)重[7]。耐藥腸球菌的產(chǎn)生增加了臨床抗感染工作的難度，也逐漸成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題。由于動物源腸球菌的耐藥基因存在著可能通過養(yǎng)殖環(huán)節(jié)、屠宰環(huán)節(jié)及食物鏈等多種途徑傳播的風(fēng)險(xiǎn)，因此，對人類健康造成潛在威脅，給養(yǎng)殖業(yè)也帶來風(fēng)險(xiǎn)。為了解近年來上海市動物源腸球菌耐藥情況及MIC(minimal inhibitory concentration)變遷情況，擬選擇豬、雞、牛養(yǎng)殖場為研究對象，對常見10種抗菌藥物的耐藥性進(jìn)行監(jiān)測與分析，并計(jì)算得到MIC50與MIC90。MIC為最小抑制病原微生物生長的藥物濃度，相對應(yīng)的MIC50和MIC90分別指抑制50%和90%病原微生物生長的抑菌濃度，常用于衡量抗菌藥物抵抗病原微生物的能力[8]。因此，開展動物源糞腸球菌、屎腸球菌耐藥性監(jiān)測，可了解上海地區(qū)動物源腸球菌耐藥性本底情況，為抗菌藥物使用的風(fēng)險(xiǎn)評估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。通過比較五年間MIC50和MIC90的變遷情況，可掌握本市糞腸球菌及屎腸球菌對不同藥物的耐藥發(fā)展趨勢，對遏制腸球菌耐藥、保障公共衛(wèi)生安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株 458株糞腸球菌及283株屎腸球菌，分離自2017～2021年自上海地區(qū)21家養(yǎng)殖場(2家牛場、7家雞場、12家豬場)的豬/牛肛門、雞泄殖腔拭子，凍存于-80 ℃冰箱。糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29212(美國菌種保藏中心)。

1.1.2 試劑與儀器 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(tryptose soya agar,TSA)、陽離子調(diào)節(jié)MH肉湯(cationadjusted Mueller-Hinton broth,CAMHB)(青島海博公司)；0.9%生理鹽水(121 ℃高壓滅菌30 min)；凍干型革蘭氏陽性菌藥敏板，內(nèi)含慶大霉素(gentamicin,GM)、阿莫西林/克拉維酸(amoxicillin,AMC)、青霉素(penicillin,P)、頭孢西丁(cefoxitin,FOX)、頭孢噻呋(ceftiofur,XNL)、氧氟沙星(ofloxacin,OFX)、恩諾沙星(enrofloxacin, ENR)、氟苯尼考(florfenicol,FFC)、萬古霉素(vancomycin,VA)、利奈唑胺(linezolid,LNZ)等10種抗菌藥物(復(fù)興診斷科技(上海)有限公司)；比濁儀、Sensititre AIM全自動菌液接種儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 腸球菌抗菌藥物敏感性測試 將凍存的腸球菌接種至TSA上，36 ℃培養(yǎng)18 h，挑取2～3個(gè)新鮮培養(yǎng)的單菌落，置于3 mL滅菌生理鹽水中，使用比濁儀將細(xì)菌濃度調(diào)整至0.48～0.52麥?zhǔn)蠁挝唬考s為1 × 108CFU/mL，隨后使用CAMHB進(jìn)行200倍稀釋，接種于含不同藥物濃度的96 孔凍干型細(xì)菌藥敏板中，每孔100 μL，置于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，分別設(shè)置陽性對照孔(加入待測菌液)、陰性孔(加入無菌CAMHB)。同時(shí)使用糞腸球菌ATCC 29212進(jìn)行藥敏測定作為質(zhì)控。

1.2.2 結(jié)果判讀 自培養(yǎng)箱中取出藥敏板，置于襯有黑底板的光線下肉眼觀察結(jié)果。依據(jù)美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)對抗菌藥物敏感性結(jié)果進(jìn)行判讀，判讀標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。S(Susceptible)是指細(xì)菌對抗菌藥敏感，當(dāng)MIC值小于表1中抗菌藥物臨床折點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)所示值時(shí)，則判為S；R(Resistance)是指細(xì)菌對某種抗菌藥耐藥, 當(dāng)MIC值大于表1中抗菌藥物臨床折點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)所示值時(shí)，則判為R;I(Intermediate)是指細(xì)菌對抗菌藥中度敏感，當(dāng)MIC值為表1中抗菌藥物臨床折點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)所示區(qū)間或者不為S或R時(shí)，則判為I[9]。藥敏板上陰性對照孔內(nèi)應(yīng)無細(xì)菌生長，液體未見渾濁；陽性對照孔內(nèi)有細(xì)菌生長，液體渾濁，且質(zhì)控菌株的 MIC 值在規(guī)定的范圍內(nèi)，則藥敏板結(jié)果有效。

表1 腸球菌對常見抗菌藥物的折點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控菌株MIC范圍Tab 1 Break point criteria of Enteroccus against common antibiotics and MIC range of quality control strains

2 結(jié)果與分析

2.1 腸球菌耐藥率比較 結(jié)果顯示，糞腸球菌及屎腸球菌均對頭孢西丁(99.6%，95.4%)、氧氟沙星(93.0%，59.8%)及頭孢噻呋(89.3%，65.4%)的較為耐藥；對青霉素(4.8%，10.6%)、阿莫西林/克拉維酸(0.4%，2.8%) 較為敏感；未分離到耐萬古霉素的腸球菌。兩種腸球菌對氟苯尼考(59.8%，24.2%)、慶大霉素(56.1%，12.0%)、利奈唑胺(48.3%，4.9%)、恩諾沙星(33.2%，17.3%)的耐藥率存在較大差異，且糞腸球菌比屎腸球菌更為耐藥。動物源糞腸球菌及屎腸球菌對10種抗菌藥物的耐藥率結(jié)果見圖1所示。

圖1 糞腸球菌及屎腸球菌對10種抗菌藥物的耐藥率Fig 1 The resistance rates of E.faecalis and E.faecium to 10 kinds of antibiotics

2.2 腸球菌MIC變遷情況

2.2.1 β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物 2017-2021年β-內(nèi)酰胺類藥物對糞腸球菌的MIC值見表2、表3。五年間，頭孢噻呋MIC50保持在32 μg/mL，MIC90在2017年有所上升后，近年來呈下降趨勢；阿莫西林/克拉維酸MIC502017年由2 μg/mL下降至0.5 μg/mL后均保持在該水平，同時(shí)MIC90呈下降趨勢，由16 μg/mL下降至1 μg/mL。

表2 2017-2021年頭孢噻呋及阿莫西林/克拉維酸對糞腸球菌MIC值(μg/mL)Tab 2 MIC values of ceftiofur and amoxicillin/ clavulanate potassium against E.faecalis (μg/mL)

表3 2017-2021年青霉素及頭孢西丁對糞腸球菌MIC值(μg/mL)Tab 3 MIC values of penicillin and cefoxitin against E.faecalis (μg/mL)

青霉素、苯唑西林、頭孢西丁對糞腸球菌的MIC值均較為穩(wěn)定，其中青霉素MIC50保持在4 μg/mL，MIC90雖比2017、2018年有所上升，但整體仍保持在4 μg/mL；糞腸球菌對苯唑西林及頭孢西丁有較高耐藥，五年間，苯唑西林MIC50及MIC90均為≥4 ug/mL，苯唑西林MIC50及MIC90均為≥128 μg/mL。

2017-2021年β-內(nèi)酰胺類藥物對屎腸球菌的MIC值見表4、表5。五年間，青霉素、阿莫西林/克拉維素的MIC50均較為穩(wěn)定，MIC90均呈下降趨勢，其中青霉素MIC50保持在4～8 μg/mL，MIC90由256 μg/mL下降至4 μg/mL；阿莫西林/克拉維酸MIC50保持在0.25～0.5 μg/mL，MIC90由64 μg/mL下降至1 μg/mL。

表4 2017-2021年青霉素及阿莫西林/克拉維酸對屎腸球菌MIC值(μg/mL)Tab 4 MIC values of penicillin and amoxicillin/clavulanate potassium against E.faecium (μg/mL)

表5 2017-2021年頭孢噻呋及頭孢西丁對屎腸球菌MIC值(μg/mL)Tab 5 MIC values of ceftiofur and cefoxitin against E.faecium (μg/mL)

苯唑西林對屎腸球菌的MIC值較為穩(wěn)定，MIC50及MIC90均保持在大于4 μg/mL；而頭孢噻呋及頭孢西丁的耐藥性變化趨勢較為相似，其中頭孢噻呋的MIC50于2018年下降至4 μg/mL，2019年有所上升，2021年下降至32 μg/mL，MIC902018年下降至128 μg/mL后又再次回升至256 μg/mL；頭孢西丁MIC50于2019年有所上升，后由32 μg/mL下降至16 μg/mL，MIC90由大于128 μg/mL下降至32 μg/mL。

2.2.2 氟喹諾酮類抗菌藥物 2017-2021年氟喹諾酮類藥物對糞腸球菌的MIC值見表6。五年間，恩諾沙星的MIC50處于較低水平保持在1～2 μg/mL，MIC90則保持在大于64 μg/mL；氧氟沙星的MIC50由16 μg/mL降為4 μg/mL，MIC90于2020年由256 μg/mL降為64 μg/mL。

表6 2017-2021年恩諾沙星及氧氟沙星對糞腸球菌MIC值(μg/mL)Tab 6 MIC values of enrofloxacin and ofloxacin against E.faecalis (μg/mL)

2017-2021年氟喹諾酮類藥物對屎腸球菌的MIC值見表7。五年間，恩諾沙星及氧氟沙星的MIC50均處于較低水平，恩諾沙星保持在0.5～2 μg/mL，氧氟沙星保持在2～4 μg/mL；MIC90均于2017年有所上升，恩諾沙星上升至64 μg/mL，氧氟沙星上升至256 μg/mL，兩者近年來均處于下降趨勢，恩諾沙星為波動下降，2021年降為4 μg/mL，氧氟沙星于2017年上升至256 μg/mL，后下降至8 μg/mL保持至今。

表7 2017-2021年恩諾沙星及氧氟沙星對屎腸球菌MIC值(μg/mL)Tab 7 MIC values of enrofloxacin and ofloxacin against E.faecium (μg/mL)

2.2.3 氨基糖苷類、氯霉素類、糖肽類、唑烷酮類抗菌藥物 2017-2021年慶大霉素、氟苯尼考、利奈唑胺及萬古霉素對糞腸球菌的MIC值見表8。五年間，慶大霉素的MIC50為上升趨勢，MIC90均保持在大于2048 μg/mL；氟苯尼考MIC50保持在32～64 μg/mL，MIC90為下降趨勢，由128 μg/mL下降至64 μg/mL；利奈唑胺的MIC50保持在4～8 μg/mL，MIC90保持在8 μg/mL；萬古霉素的MIC50和MIC90五年來均較為穩(wěn)定，期間略有浮動，MIC50保持在1 μg/mL， MIC90保持在2 μg/mL。

表8 2017-2021年慶大霉素、氟苯尼考、利奈唑胺及萬古霉素對糞腸球菌MIC值(μg/mL)Tab 8 MIC values of gentamicin, florfenicol, linezolid and vancomycin against E.faecalis (μg/mL)

2017-2021年慶大霉素、氟苯尼考、利奈唑胺及萬古霉素對屎腸球菌的MIC值見表9。五年間，慶大霉素的MIC50為下降趨勢，由8 μg/mL下降至4 μg/mL，MIC90于2018年上升至512 μg/mL，近年來為波動下降，2021年下降至8 μg/mL；氯霉素類抗菌藥物氟苯尼考MIC50及MIC90均為下降趨勢，MIC50由64 μg/mL下降至2 μg/mL，MIC90由128 μg/mL下降至4 μg/mL；利奈唑胺的MIC50保持在2 μg/mL，MIC90由8 μg/mL降為2 μg/mL；萬古霉素的MIC50和MIC90五年來均較為穩(wěn)定， MIC50保持在0.5～ 1 μg/mL， MIC90保持在1～2 μg/mL。

3 分析與討論

腸球菌是人與動物腸道正常的棲息菌，近年來逐漸證實(shí)具有致病能力，臨床上可引起嚴(yán)重的感染和疾病，如心內(nèi)膜炎、菌血癥、泌尿系統(tǒng)等，也可感染雞、鴨、豬、牛、羊、水產(chǎn)品等多種食品動物，導(dǎo)致疾病發(fā)生[10-14]。動物源腸球菌的耐藥基因可通過養(yǎng)殖環(huán)境、食物鏈等傳遞給人。此外，有研究表明，耐藥腸球菌的耐藥基因可在質(zhì)粒等移動元件介導(dǎo)水平傳播給其他病原菌，給人類健康和公共衛(wèi)生帶來威脅[15]。

3.1 腸球菌耐藥性比較 整體看來，上海地區(qū)動物源糞腸球菌耐藥性比屎腸球菌更為嚴(yán)重。糞腸球菌和屎腸球菌均對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物中的頭孢類藥物有高耐藥率(65%～99%)，這可能與腸球菌對頭孢類藥物具有固有耐藥性有關(guān)[16],這也與河南地區(qū)李金磊等[17]、東北地區(qū)李延山等[18]的結(jié)果一致；兩者對青霉素、阿莫西林/克拉維酸敏感，耐藥率較低(均低于15%)，與東北地區(qū)李延山等[18]的結(jié)果一致，但四川地區(qū)張國明等[19]、寧夏地區(qū)王文等[20]的研究均顯示腸球菌對青霉素均較為耐藥(均高于50%)，這可能與養(yǎng)殖場用藥有關(guān)，說明腸球菌的耐藥情況存在著地域差異；根據(jù)喹諾酮類藥物的耐藥結(jié)果，兩者均對氧氟沙星更為耐藥(58%～93%)，對恩諾沙星更為敏感(17%～34%)，與新疆地區(qū)陳萬昭等[21]的研究結(jié)果一致；根據(jù)氨基糖苷類及氯霉素類藥物的耐藥結(jié)果，糞腸球菌更為耐藥，對慶大霉素(56.1%)及氟苯尼考(59.8%)的耐藥率均高于屎腸球菌(慶大霉素12.0%，氟苯尼考24.2%)。

值得注意的是，糞腸球菌對利奈唑胺的耐藥率為48.3%，屎腸球菌為4.9%。利奈唑胺是治療由多重耐藥革蘭氏陽性菌包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和耐萬古霉素腸球菌(VRE)引起嚴(yán)重感染的重要藥物[22]，而養(yǎng)殖場治療用藥中并無利奈唑胺。由于利奈唑胺是一種細(xì)菌蛋白質(zhì)合成抑制劑，抑制蛋白質(zhì)合成的初始階段，不影響翻譯起始tRNA的形成、延伸與終止階段，和以往抗菌藥物抑制蛋白合成的作用方式不同[23]，因此,利奈唑胺與其他抗菌藥物不易發(fā)生交叉耐藥，在體外也不易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥[24]。故造成上海地區(qū)動物源糞腸球菌利奈唑胺較高耐藥率的原因可能有二：一是其自身發(fā)生了23S rRNA V區(qū)突變，此突變?yōu)樽钪饕哪退帣C(jī)制，且糞腸球菌比屎腸球菌更容易被誘導(dǎo)突變[25]；二是耐藥基因發(fā)生轉(zhuǎn)移，如氯霉素-氟甲砜霉素耐藥(cfr)基因(可能來自于耐氟苯尼考的菌株)、cfr(B)基因及optrA基因，該類耐藥多通過外源性質(zhì)粒介導(dǎo)[24]。研究表明，動物源腸球菌很可能作為耐藥基因的貯存庫，成為crf、cfr(B)、optrA基因等耐藥基因的潛在來源，通過耐藥基因的克隆擴(kuò)增或水平轉(zhuǎn)移在環(huán)境中傳播[26-27]。本研究未發(fā)現(xiàn)耐萬古霉素腸球菌(VRE)，但仍應(yīng)嚴(yán)格控制藥物的使用，避免交叉耐藥，防止VRE的出現(xiàn)。

隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，開展動物源性食品的耐藥性風(fēng)險(xiǎn)評估勢在必行，耐藥率本底情況為耐藥性風(fēng)險(xiǎn)評估計(jì)算中不可或缺的一部分[28]，本研究結(jié)果為細(xì)菌耐藥性風(fēng)險(xiǎn)評估提供了數(shù)據(jù)支撐。

3.2 腸球菌MIC變遷分析 根據(jù)MIC變遷結(jié)果，2017～2021年上海地區(qū)動物源糞腸球菌對阿莫西林/克拉維酸、氧氟沙星的MIC50及MIC90均呈下降趨勢；慶大霉素的MIC50為上升趨勢，MIC90五年來無明顯改變，但腸球菌對氨基糖苷類藥物具有天然耐藥性[29-30]，美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI) 建議將腸球菌在氨基糖苷類藥物上的耐藥程度分為中度耐藥和高度耐藥，慶大霉素為目前已知的高水平耐藥[31]；對利奈唑胺耐藥率較高，但其MIC50及MIC90五年來無明顯改變，MIC90為8 μg/mL,非高濃度抗菌藥物耐藥；對其余6種抗菌藥物的MIC50和MIC90五年來無明顯改變，其中，對青霉素、萬古霉素均保持敏感。2017～2021年上海地區(qū)動物源屎腸球菌對阿莫西林/克拉維酸、頭孢西丁及氟苯尼考的MIC50及MIC90均呈下降趨勢；青霉素、恩諾沙星、氧氟沙星、利奈唑胺的MIC50五年來無明顯改變，MIC90呈下降趨勢，說明高濃度耐藥菌數(shù)量有所下降；對其余4種抗菌藥物的MIC50和MIC90五年來無明顯改變，其中慶大霉素、頭孢噻呋MIC90均處于較高水平耐藥，萬古霉素處于敏感。

上海地區(qū)動物源腸球菌除對阿莫西林/克拉維酸、青霉素、萬古霉素較為敏感之外，對多種抗菌藥物均有較高的耐藥率，不同腸球菌屬細(xì)菌對同一抗菌藥物存在不同程度的耐藥現(xiàn)象。五年間，腸球菌對頭孢西丁、青霉素、阿莫西林/克拉維酸、恩諾沙星、氧氟沙星及利奈唑胺存在不同程度耐藥性下降趨勢，耐藥情況有好轉(zhuǎn)趨勢,除對慶大霉素、頭孢噻呋有天然耐藥性外[29-30]，其余3種抗菌藥物MIC變遷無明顯改變，耐藥性無下降趨勢。因此仍需進(jìn)一步加強(qiáng)對抗菌藥物的規(guī)范使用及動物源腸球菌的耐藥性監(jiān)測，在進(jìn)行治療用藥時(shí)，應(yīng)根據(jù)不同腸球菌屬合理選擇抗菌藥物，合理輪換用藥，進(jìn)一步遏制動物源細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。

上海地區(qū)動物源腸球菌對多種抗菌藥物具有不同程度的耐藥，糞腸球菌耐藥性整體高于屎腸球菌。五年來，整體耐藥情況有好轉(zhuǎn)趨勢，仍需繼續(xù)加強(qiáng)腸球菌耐藥性監(jiān)測。