黃 晶 郜趙偉 郭文濤 董 軻

空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院檢驗科，陜西西安 710038

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是中青年女性常見自身免疫病之一，可累及全身各系統(tǒng)。免疫失調既是SLE患者主要臨床表現之一，也是其發(fā)生發(fā)展的重要驅動要素。SLE患者免疫失調表現多樣，包括B細胞[1-2]、T細胞[3]、單核-巨噬細胞[4]等多種免疫細胞異常。其中B細胞免疫異常是SLE研究熱點之一。SLE治療藥物Belimumab通過靶向B淋巴細胞刺激因子，抑制B細胞生存及其向漿細胞分化，緩解病情[5]。因此，B細胞異常在SLE發(fā)生發(fā)展中作用關鍵。本研究篩選SLE患者B細胞差異表達基因，并進行功能分析，為探討SLE發(fā)病機制和篩選潛在治療靶點提供參考。

1 資料與方法

1.1 轉錄組數據集

GSE4588數據集包括7例SLE患者和9例健康者B細胞轉錄組信息；GSE10325數據集包括14例SLE患者和9例健康者B細胞轉錄組信息；GSE30153數據集包括17例SLE患者和9例健康者B細胞轉錄組信息。

1.2 差異表達基因篩選

利用GEO2R分析工具篩選各數據集中SLE患者B細胞差異表達基因（differential expression genes，DEGs），對照為健康者B細胞。DEGs篩選條件：|Log2FC|≥1且P< 0.01，FC：Fold change。通過對3組DEGs取交集得到共有DEGs。

1.3 DEGs功能分析

利用DAVID分析工具對DEGs進行基因本體（GO）注釋和KEGG通路分析，利用R軟件制作氣泡圖對GO和KEGG分析結果進行可視化處理。

1.4 蛋白互作網絡（protein-protein interaction，PPI）分析

利用STRING在線數據庫對DEGs編碼蛋白進行PPI構建，篩選聯合評分> 0.4的中置信度互作節(jié)點數據。

1.5 統(tǒng)計學分析

DEGs利用t檢驗的P值和差異倍數進行篩選，篩選標準：|Log2FC|≥1及P< 0.01。對DEGs進行GO及KEGG分析，雙側檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 SLE患者B細胞DEGs

根據DEGs篩選標準，分別在GSE4588、GSE30153及GSE10325數據集中篩選到1608（621上調，987下調）、62（56上調，6下調）和366（190上調，176下調）個DEGs（圖1A）。取交集后，共篩選到9個 共 有DEGs：USP18、RRM2、OAS3、MAN1A1、IFITM1、IFI44L、IFI44、CD38及CD1C（圖1B）。其中，8個基因表達上調，CD1C表達下調（圖1C）。

圖1 SLE患者B細胞DEGs篩選

2.2 共有DEGs的功能分析

上述DEGs參與的生物學過程（GO_BP）包括：對病毒的響應、病毒防御、病毒基因組復制負調控、Ⅰ型干擾素信號通路。KEGG通路分析顯示DEGs參與造血細胞譜系（圖2）。

圖2 SLE患者B細胞DEGs的GO和KEGG分析結果

2.3 DEGs編碼蛋白互作分析

在9個DEGs編碼蛋白中：RRM2及MAN1A1與其他7個DEGs無互作關系；CD1C和CD38之間存在互作，與其他7個DEGs無互作；IFI44、OAS3、IFI44L、IFITM1及USP18彼此之間存在互作關系（圖3）。

圖3 SLE患者B細胞DEGs編碼蛋白PPI分析

3 討論

SLE患者出現抗核抗體、抗dsDNA抗體等多種自身抗體，表明B細胞免疫反應的異常[6-8]。因此，鑒定SLE患者B細胞異常表達基因，對SLE發(fā)病機制及治療靶點研發(fā)具有重要價值。本研究共篩選到8個表達上調基因（USP18、RRM2、OAS3、MAN1A1、IFITM1、IFI44L、IFI44及CD38）及1個表達下調基因（CD1C）。其中，IFI44、OAS3、IFI44L、IFITM1及USP18彼此間存在蛋白互作，為核心DEGs。功能分析表明DEGs主要與機體對病毒感染的響應相關。

USP18是一種干擾素信號通路抑制分子，可以特異性地將ISG15從其底物蛋白上切割，從而保護蛋白不受降解。USP18基因多態(tài)性與多發(fā)性硬化的易感性相關[9]。Yang等[10]研究顯示USP18缺失可以上調小鼠體內調節(jié)性T細胞（Treg）的細胞分化。由于多項研究表明SLE體內Treg水平顯著下調[11-13]，因此，USP18上調可能對SLE發(fā)生具有重要作用。然而，B細胞USP18上調的作用尚待進一步研究。RRM2在DNA復制、細胞周期調節(jié)中起到關鍵作用。RRM2在SLE中的作用尚未見報道。本研究發(fā)現SLE患者B細胞RRM2表達上調，可能與B細胞的異常增殖活化相關，還需深入研究。

干擾素信號通路在SLE發(fā)生發(fā)展過程中起到關鍵作用。本研究篩選的DEGs：OAS3、IFITM1、IFI44L及IFI44均為干擾素誘導蛋白。OAS3可以降解病毒RNA，文獻研究[8，14]結果顯示，長鏈非編碼RNA—MALAT1可通過上調OAS2、OAS3及OASL促進SLE病情進展，表明OAS3在SLE發(fā)生發(fā)展中起到關鍵作用。文獻研究[15-16]表明IFI44L甲基化水平在伴有腎損傷SLE患者中顯著低于無腎損傷SLE患者，在康復期SLE患者中顯著高于活動期SLE患者，表明IFI44L甲基化水平降低可能促進SLE病情進展。由于甲基化水平往往與基因表達水平呈負相關，提示IFI44L表達升高可能促進SLE發(fā)展。此外，Shen等[17]報道IFI44可能是狼瘡性腎炎（LN）的關鍵基因，對該病具有一定的診斷價值。Lood等[18]發(fā)現SLE患者血小板中IFITM1表達顯著上調，并促進血管系統(tǒng)受累，提示IFITM1在促進SLE病情進展中作用關鍵。

CD38參與核苷酸代謝，目前已有多項治療腫瘤的CD38靶向藥物上市或處于臨床試驗中[19-20]。研究顯示CD38缺失小鼠的自身免疫性炎癥水平顯著降低，提示CD38可作為控制自身免疫反應的治療靶點[21]。Cole等[22]研究結果顯示，達雷妥尤單抗是一種CD38單抗藥物，在體外能夠耗盡SLE和類風濕性關節(jié)炎患者外周血單個核細胞中的漿細胞，提示CD38靶向治療對SLE患者有潛在價值。

CD1C屬于非多態(tài)性抗原呈遞蛋白家族分子，表達于B細胞和樹突狀細胞。Yuan等[23]研究發(fā)現，與健康者相比，SLE和狼瘡性腎炎患者體內CD1C+樹突狀細胞數量顯著減少，利用間充質干細胞治療可以通過增加CD1C+樹突狀細胞數量，緩解病情。然而，CD1C+B細胞在SLE中的作用尚待進一步研究。

隨著高通量測序技術的進步，各類疾病的轉錄組數據愈加豐富，已成為篩選疾病關鍵基因和潛在治療靶點的重要資源。SLE患者臨床表現復雜，目前的治療手段和靶點仍然較少，篩選更多新型治療靶點對SLE患者具有重要臨床意義。本研究利用SLE患者B細胞轉錄組數據，篩選出9個差異表達基因，為SLE發(fā)生發(fā)展的分子機制提供理論參考。下一步需要對其中多個基因的功能，尤其是對B細胞免疫的調控作用進行深入研究，以揭示其在SLE發(fā)病中的作用及其潛在臨床應用價值。