馮秋琴 黃 歡 陳宏君 田 曼

1.廣東省珠海市婦幼保健院小兒呼吸科，廣東珠海 519000；

2.廣東省珠海市婦幼保健院兒童腦發(fā)育與康復科，廣東珠海 519000；

3.南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院呼吸科，江蘇南京 210008

毛細支氣管炎是一種下呼吸道感染性疾病，具有潛在危及生命的危險，主要感染嬰幼兒，并在幾天內(nèi)出現(xiàn)咳嗽，呼吸過度，喘息等臨床表現(xiàn)[1]。在這些患兒中，住院患呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）感染的毛細支氣管炎嬰兒中有3%～10%出現(xiàn)呼吸衰竭[2]。另外，外周血單個核 細 胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）在很多炎癥反應過程中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺疾病中紅霉素的治療依賴單個核細胞的參與作用，紅霉素可以增加單個核細胞HDAC的活性，并減少NF-kB轉(zhuǎn)錄活性及IL-8的合成[3]。蛋白質(zhì)乙?；?，是一種重要的表觀遺傳修飾模式，在宿主防御病毒感染中起著關鍵作用。組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases，HDACs）則是通過調(diào)控蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)-脫氧核糖核酸，進而調(diào)控細胞功能[4-5]。組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylasesinhibitor，HDACi）目前在臨床應用廣泛。如曲古抑制素A（trichostatin A，TSA），因其作為抗癌藥物的潛在用途而受到關注。除了具有抗癌活性之外，還表現(xiàn)出有效的抗炎特性，其治療效果已在感染性休克、類風濕性關節(jié)炎和哮喘中得到證實[6-7]。另外，TSA被發(fā)現(xiàn)可降低丙型肝炎病毒的復制[8]。本研究旨在從動物水平探討HDACi[代表藥物TSA及辛二酰苯胺異羥肟酸（SAHA）]對RSV毛細支氣管炎小鼠血液PBMC細胞培養(yǎng)上清液中炎癥因子、氧化應激因子的表達影響。TSA、SAHA可能是調(diào)節(jié)RSV誘導的毛細支氣管炎的一種新的治療方法，為臨床新治療手段提供基礎研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇40只8～10周齡的雌性BALB/c小鼠（購自南京大學動物研究中心）；藥品TSA、SAHA均 購 自Sigma-Aldrich（St.Louis，MO，USA，批 號T20190006/S202103154）；細胞培養(yǎng)需要的DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Carlsbad，CA，USA；丙二醛（MDA），一氧化氮（NO）檢測試劑盒購自Jiancheng Bioengineering Institute批號CAS542-78-9/CAS15917-77-8；白 介 素-6（IL-6）、腫 瘤 壞 死 因 子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自上海Ex Cell Biology Inc，批號CAS148157-34-0/CAS94948-59-1。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 本實驗已通過我院倫理委員會審核。40只8～10周齡的雌性BALB/c小鼠，先在無特定病原體的條件下飼養(yǎng)，溫度（25±1）℃；濕度60%；12 h光照周期，給予標準的嚙齒動物飼料，自由飲水。采用隨機數(shù)表法將40只小鼠分為四組：正常對照組10只、RSV處理組10只、TSA+RSV處理組10只、SAHA+RSV處理組10只。所有動物研究均按照NIH指南進行[12]，在異氟烷輕度麻醉下，用PBS注射入對照組10只小鼠鼻內(nèi)，再向處理組30只小鼠鼻內(nèi)接種RSV病毒（5×105 PFU），處理組每組10只小鼠共30只，通過離體噬斑測定確認RSV感染。TSA+RSV處理組、SAHA+RSV處理組在RSV注射后的當天、注射后第1天和注射后第2天，將TSA[0.5 mg/（kg·d）]和SAHA[25 mg/（kg·d）]1 ml腹腔內(nèi)注射3 d，藥物滿3 d后處死小鼠，對照組10只小鼠這3 d腹腔注射生理鹽水1 ml作對照處理。

1.2.2 應用Q-PCR測定HDACi對RSV病毒復制的影響 四組動物均在藥物處理3 d后處死小鼠，提取小鼠肺組織，通過測量RSV-病毒載量，使用RT-qPCR定量肺組織中RSV-L基因表達的水平。

1.2.3 PBMC的獲取 四組均在藥物處理3 d后處死小鼠，提取小鼠肺泡灌洗液2 ml，同時取肺組織備用。血液取后應用肝素抗凝，與等量PBS混勻。在離心管中加入適量淋巴細胞分離液（使用前需恢復至室溫，淋巴細胞分離液與血樣1∶1）。用滴管將血樣沿管壁緩慢疊加于分層液面上，保持清楚的界面。室溫水平離心后管內(nèi)分為3層，在上、中層界面處有一個以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶，用吸管直接吸取，并重復洗滌2次，得到外周血PBMC。

1.2.4 PBMC的培養(yǎng) 將獲得的四組小鼠的外周血PBMC以含100 ml/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液重懸至1×106個/ml，培養(yǎng)于24孔板中，每孔1 ml，加入植物血凝素，終濃度為50 mg/L，細胞培養(yǎng)24 h后留取細胞培養(yǎng)液，留待測定上清液中炎癥因子和氧化應激分子表達水平。

1.2.5 酶聯(lián)免疫ELISA檢測炎癥因子、氧化應激因子水平 體外培養(yǎng)四組PBMC細胞，24 h后留取上清液，通過ELISA測量促炎細胞因子IL-6和TNF-α的水平；測定氧化應激相關分子MDA和NO的水平。

1.2.6 組織病理學分析 四組動物藥物處理3 d后，處死小鼠，用2×0.5 ml等份預冷的PBS灌注肺部，隨后將肺組織固定在10%福爾馬林溶液中并包埋在石蠟中，在載玻片上切割石蠟切片（4 μm），用標準方案進行蘇木精和伊紅（HE）染色。在光學顯微鏡下觀察病理損傷的程度。

2 結(jié)果

2.1 HDACi藥物TSA、SAHA可以抑制RSV復制

使用PCR技術檢測肺部RSV病毒載量，將RSV感染的小鼠暴露于HDACi藥物TSA、SAHA后病毒載量下降，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）。見表1。

表1 各組RSV病毒載量比較（copies/ml）

2.2 TSA、SAHA可以抑制RSV誘導的毛細支氣管炎小鼠模型中PBMC炎性細胞因子和氧化應激因子的釋放

為確定HDAC抑制劑是否影響RSV誘導的氣道炎癥，使用ELISA測量PBMC細胞上清液中促炎細胞因子的產(chǎn)生，結(jié)果顯示TSA或SAHA處理抑制IL-6和TNF-α的釋放，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）。見表2。另外，氧化應激相關因子NO水平有下降趨勢；MDA的水平在藥物處理后也明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）。見表3。

表2 各組促炎細胞因子IL-6、TNF-α釋放水平比較（pg/ml，x ± s）

表3 各組氧化應激相關分子NO、MDA釋放水平比較（x ± s）

2.3 組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA、SAHA可以減輕RSV病毒引起的肺損傷

光學顯微鏡下觀察四組小鼠肺部病理損傷的程度，結(jié)果顯示RSV處理組炎癥浸潤情況明顯高于對照組，表現(xiàn)為支氣管周圍、血管周圍及肺泡中明顯的炎癥細胞浸潤，TSA+RSV處理組及SAHA+RSV處理組肺部炎癥浸潤情況較RSV組明顯減輕，其中SAHA+RSV組炎癥抑制作用表現(xiàn)得更明顯（圖1）。提示HDACi在RSV感染肺部中起到明顯的抗炎作用。

圖1 四組小鼠肺組織HE染色評估氣道炎癥的嚴重程度和肺損傷的情況比較

3 討論

目前對于RSV的病理機制研究有很多，但尚不明確，其中一個關鍵點是RSV感染后出現(xiàn)不同臨床癥狀的個體，有些人只有輕微的感冒癥狀，不需要特殊治療，而在另一些人中，RSV感染可能導致嚴重的疾病，包括毛細支氣管炎或肺炎，嚴重時甚至威脅生命[9]。

組蛋白去乙?；窰DACs在基因表達調(diào)控中起著至關重要的作用，它通過乙?；腿ヒ阴；M蛋白來調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，有研究證實組蛋白乙?；刂颇承┎《镜母腥綶10]。在感染人類的諸多病原體中，HDACs與病毒復制和發(fā)病有關，包括皰疹病毒、人乳頭瘤病毒、柯薩奇病毒、乙型丙型肝炎、HCV和人類免疫缺陷病毒HIV-1[11]。如在丙肝病毒感染期間，HDACi類藥物SAHA通過改變宿主細胞中基因（如OPN和Apo-A1）的表達而對HCV復制發(fā)揮抑制作用。本研究探究組蛋白乙?；欠裨赗SV復制和病毒誘導的氣道炎癥的調(diào)節(jié)中起作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，HDACs中HDAC2的異常表達在肺部參與介導了嚴重哮喘或慢性阻塞性肺疾病患者的甾體抗性作用[12]，但具體參與機制尚未研究。另外，外周血單個核細胞已證實在很多炎癥反應過程中發(fā)揮重要作用，基于這些研究基礎，本研究提示，用HDACi處理RSV感染的小鼠，RSV病毒的復制被抑制。

HDACi在體外和體內(nèi)均發(fā)揮抗炎作用。HDACi類藥物TSA可減輕過敏性哮喘小鼠模型中的炎癥[13]，使用HDACi減輕了脂多糖誘導的急性小鼠肺損傷[14]。本研究表明，使用TSA、SAHA可顯著減輕RSV誘導的促炎細胞因子的產(chǎn)生IL-6和TNF-α的釋放，IL-6和TNF-α的表達降低可以解釋HDACis處理后毛細支氣管炎小鼠模型中中性粒細胞和T細胞浸潤的減少。

另外，氧化應激相關因子參與多種形式的組織損傷，包括對脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等細胞成分的損害[15]。在本研究中，RSV感染的小鼠的肺中NO，MDA顯著增加，而HDACi逆轉(zhuǎn)了這一過程。

總之，本研究探討了HDACi在抑制RSV感染、調(diào)節(jié)病毒誘導的氣道炎癥中的功能和參與的相關機制。未來需進行藥物臨床試驗，進一步明確和驗證去乙酰化酶抑制劑HDACi在RSV誘導的患者氣道炎癥中的作用情況和參與的相關機制，為HDACi類藥物將來進入臨床治療呼吸道疾病提供重要的數(shù)據(jù)支持。