肖偉,張新莊,曹亮,王振中

(1.中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 連云港 222000;2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司,江蘇 連云港 222000)

中藥產(chǎn)業(yè)傳承與創(chuàng)新發(fā)展是國(guó)家重大戰(zhàn)略需求,但面臨著傳承不足,創(chuàng)新不夠,作用發(fā)揮不充分的困境。習(xí)近平總書記明確提出了繼承和創(chuàng)新相結(jié)合的發(fā)展方向,只有落實(shí)好繼承與創(chuàng)新,才能將中醫(yī)藥這一祖先留給我們的寶貴財(cái)富繼承好、發(fā)展好、利用好。中成藥可工業(yè)化生產(chǎn)、普適性應(yīng)用,具有很強(qiáng)的可持續(xù)發(fā)展特征,既繼承了中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論,又可運(yùn)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)解析其特征,功能主治與化學(xué)藥藥理作用及適應(yīng)癥相接近,利于中醫(yī)藥學(xué)傳統(tǒng)理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論的融通,也有利于中醫(yī)藥的學(xué)術(shù)傳承與推廣應(yīng)用。然而,如何將傳統(tǒng)中醫(yī)藥的宏觀調(diào)節(jié)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的微觀治療(靶蛋白和通路)統(tǒng)一起來(lái),在繼承的基礎(chǔ)上闡明中藥科學(xué)內(nèi)涵,是中成藥發(fā)展的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題,也是最基礎(chǔ)的問(wèn)題。中醫(yī)藥與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論的差異需要以中成藥為載體進(jìn)行解析,從而促進(jìn)兩個(gè)體系互通與融合。

首先,中成藥源于中醫(yī)藥理論,需繼承功能主治內(nèi)涵,即“功效”特點(diǎn),用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)解讀后,讓現(xiàn)代醫(yī)學(xué)聽得懂、看得清。其次,需要解析清楚中藥多成分-多靶點(diǎn)-多途徑作用特征中“中藥復(fù)雜體系-功效成分群”“機(jī)體復(fù)雜體系-功效相關(guān)靶點(diǎn)群”之間的相互作用關(guān)系和特點(diǎn)。解析的功效成分群應(yīng)能轉(zhuǎn)化至實(shí)際生產(chǎn),保證可實(shí)現(xiàn)、可控制;功效相關(guān)靶點(diǎn)群能從多維度的體內(nèi)外藥效試驗(yàn)和循證臨床研究中得到印證。以上研究將能形成現(xiàn)代中藥安全、有效、質(zhì)量可控的系統(tǒng)證據(jù)鏈,從而構(gòu)成可被中西醫(yī)都認(rèn)同的中藥創(chuàng)新發(fā)展的基石。為此,圍繞中成藥功效成分群發(fā)現(xiàn)及其如何應(yīng)用于生產(chǎn)全過(guò)程質(zhì)量控制開展了一些探索研究工作,現(xiàn)整理如下。

1 中成藥功效成分群發(fā)現(xiàn)

藥物有效性的內(nèi)涵是“物質(zhì)清晰、機(jī)制明確、量效精準(zhǔn)”。中成藥是源于中藥復(fù)方的多組分組合藥物,既有中醫(yī)整體觀用藥規(guī)則,又有多重療效的療效關(guān)系,如何賦予其量效特點(diǎn)準(zhǔn)確依據(jù)?功能主治的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)核又是什么?因此解析其物質(zhì)基礎(chǔ)功效機(jī)制和量效范圍是體現(xiàn)中成藥原創(chuàng)優(yōu)勢(shì)的核心,亟需建立中成藥復(fù)雜體系整體功效成分群的研究方法。為此我們從“中成藥是什么在起作用、怎么起作用、在什么劑量范圍更有效”為出發(fā)點(diǎn),以“中成藥功效成分群”為核心(圖1),嘗試探索解析中成藥效應(yīng)特點(diǎn)和整合效應(yīng)機(jī)制、配伍配比和劑量-效應(yīng)關(guān)系,使中成藥具備“安全、有效”的藥物基本屬性,同時(shí),又能回歸宏觀的傳統(tǒng)理論。

圖1 中藥功效成分群

1.1 基于疾病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)擾動(dòng)的中藥功效成分群發(fā)現(xiàn)技術(shù)

首先以疾病不同癥狀、臨床指標(biāo)為出發(fā)點(diǎn)構(gòu)建生物子網(wǎng)絡(luò),進(jìn)而搭建疾病相關(guān)分子網(wǎng)絡(luò),利用現(xiàn)代色譜、質(zhì)譜等波譜技術(shù)進(jìn)行中成藥全成分譜檢識(shí);其次通過(guò)文本挖掘、ADME預(yù)測(cè)、分子對(duì)接、網(wǎng)絡(luò)擾動(dòng)分析等預(yù)測(cè)中成藥主要活性成分群和潛在靶點(diǎn)群;然后對(duì)潛在靶點(diǎn)群進(jìn)行基因注釋(GO)和生物通路富集等生物信息分析,綜合解析靶點(diǎn)-生物通路-臨床指標(biāo)/癥狀的機(jī)制,進(jìn)而揭示中成藥的作用機(jī)理,闡釋科學(xué)內(nèi)涵[1-2](圖2)?；谏鲜鏊悸?聯(lián)合北京大學(xué)等多個(gè)高校團(tuán)隊(duì)搭建了天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)、中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析系統(tǒng)、中醫(yī)藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)[3],構(gòu)建了中藥多成分的ADME、靶點(diǎn)預(yù)測(cè)等模型,實(shí)現(xiàn)了從中藥成分ADME分析,到靶點(diǎn)預(yù)測(cè)、通路分析和整合功效分析。

圖2 基于疾病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)擾動(dòng)的中成藥功效成分發(fā)現(xiàn)

1.2 基于組分譜效的中藥功效成分群發(fā)現(xiàn)技術(shù)

借助化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)指紋圖譜化學(xué)信息與藥效指標(biāo)信息進(jìn)行相關(guān)性分析,將“可視”的“譜”成分與“可測(cè)”的“效”作用聯(lián)系起來(lái),從而解析中成藥潛在的功效成分群。采用硅膠柱色譜、制備色譜等方法將中成藥分離成多個(gè)流分,根據(jù)色譜檢識(shí)結(jié)果合并類似組分,獲得化學(xué)成分差異較大的不同部分,采用正交試驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法設(shè)計(jì)制備得到化學(xué)成分有明顯交叉但含量均不一樣的組分,一方面用UPLC-MS采集這些組分總離子流圖,與前期建立的中成藥化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),獲得組分的共有峰;另一方面在靶點(diǎn)、細(xì)胞、離體組織、整體動(dòng)物模型上評(píng)價(jià)組分的活性;最后采用灰色關(guān)聯(lián)度和偏最小二乘法(PLS)分析共有峰相對(duì)峰面積和不同藥理活性數(shù)據(jù)相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)功效成分群[4]。

1.3 基于活性導(dǎo)向下的中藥功效成分群發(fā)現(xiàn)技術(shù)

利用HPLC/UPLC-Q-TOF/MS/MS對(duì)中成藥化學(xué)成分全面檢識(shí)的基礎(chǔ)上,以色譜圖為檢測(cè)手段,采用大孔樹脂、溶劑萃取等方式將提取物分離為化學(xué)成分基本不交叉的不同餾分,通過(guò)細(xì)胞、離體組織、整體動(dòng)物的活性評(píng)價(jià),確定主要活性部位;進(jìn)一步采用硅膠柱色譜、反相色譜、凝膠柱色譜以及制備液相等分離技術(shù)對(duì)活性部位進(jìn)行化學(xué)成分的分離鑒定,經(jīng)體外酶學(xué)、細(xì)胞試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證和體內(nèi)藥效確證,最終明確中成藥的主要活性成分群[5]。考慮到中藥有效成分含量低、多種結(jié)構(gòu)類似物共存、種類繁多、化學(xué)穩(wěn)定性差、理化性質(zhì)跨度大,經(jīng)典柱色譜法效率低、成本高、重現(xiàn)性差且難以規(guī)?；苽?聯(lián)合科研院所的化學(xué)團(tuán)隊(duì)從連續(xù)色譜分離技術(shù)、真空色譜技術(shù)和二維色譜分離技術(shù)入手,研發(fā)了多通道邏輯控制閥控制的工業(yè)級(jí)動(dòng)態(tài)軸向壓縮色譜系統(tǒng)與連續(xù)分離裝備[6],搭建可高效、規(guī)?；苽渲兴幗M分/成分色譜平臺(tái),實(shí)現(xiàn)中藥化學(xué)成分連續(xù)性、自動(dòng)化、質(zhì)量可控、收率穩(wěn)定的制備,為中藥活性成分群體內(nèi)藥效驗(yàn)證和體外活性篩選提供有力支撐。

1.4 基于“高通量轉(zhuǎn)錄組-高內(nèi)涵-整體驗(yàn)證”的中藥功效成分篩選技術(shù)

圍繞疾病病理過(guò)程建立系列相關(guān)細(xì)胞模型,通過(guò)藥物處理和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,并結(jié)合生物信息學(xué)分析技術(shù),篩選差異表達(dá)基因及轉(zhuǎn)錄本,利用差異基因進(jìn)一步富集到差異顯著的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、代謝通路和疾病通路。在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建基于靶點(diǎn)和通路的高通量-高內(nèi)涵篩選模型篩選中成藥的活性成分群,結(jié)合入血成分分析和體內(nèi)動(dòng)物藥效評(píng)價(jià),從而解析中成藥的功效成分群[7]。

1.5 基于配伍配比的中成藥功效成分發(fā)現(xiàn)技術(shù)

多成分組合是控制復(fù)雜疾病的一種有效的治療策略,而組合成分?jǐn)?shù)增加引起的組合可能性幾何倍數(shù)增加使得高通量辨識(shí)出協(xié)同組合藥對(duì)十分困難,計(jì)算預(yù)測(cè)模型為多成分組合藥物的研究提供了可能。中藥復(fù)方是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下遵照君臣佐使和七情和合配伍形成的臨床有效方劑,是多靶點(diǎn)組合藥物典型代表?？梢?中藥中成分間的相互作用是其起效的物質(zhì)基礎(chǔ),由此嘗試對(duì)功效成分的配伍配比進(jìn)行探索。建立臨床組合藥物數(shù)據(jù)庫(kù)(PreDC)中藥物組合標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)集,提取化學(xué)結(jié)構(gòu)、藥理學(xué)、基因組學(xué)、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)等特征,利用貝葉斯網(wǎng)絡(luò)整合多維參數(shù)形成綜合特征,采用最大熵原理構(gòu)建多成分互作關(guān)系預(yù)測(cè)模型[2]和信息流原理構(gòu)建基于生物網(wǎng)絡(luò)的多線程藥物協(xié)同定量計(jì)算模型[8],預(yù)測(cè)中藥多成分協(xié)同配比,隨后采用分子印跡技術(shù)結(jié)合體內(nèi)外藥理模型解析中成藥的功效成分群[9]。

綜上,中成藥功效成分發(fā)現(xiàn)群研究建立了兩個(gè)技術(shù)體系(圖3),通過(guò)功效成分辨識(shí)、制備、集成、聚集,確定了中成藥功效成分群;通過(guò)功效成分量效范圍評(píng)價(jià)、確認(rèn),確證了中成藥功效成分群的量效關(guān)系,從而發(fā)現(xiàn)中成藥代表功效的成分群,解析成分群整合作用機(jī)制。

圖3 中藥功效成分群發(fā)現(xiàn)技術(shù)

2 基于功效成分群的中成藥生產(chǎn)全過(guò)程質(zhì)量控制策略

在“藥品質(zhì)量是設(shè)計(jì)、生產(chǎn)出來(lái)的,不是檢驗(yàn)出來(lái)的”這一理念下,對(duì)中成藥產(chǎn)品整個(gè)生命周期內(nèi)功效成分群傳遞過(guò)程進(jìn)行質(zhì)量管理和全產(chǎn)業(yè)鏈質(zhì)量追溯體系探索研究,以期建立從藥材采集、加工、投料、提取到成品的中成藥全過(guò)程質(zhì)量控制體系(圖4)。

圖4 中成藥生產(chǎn)全過(guò)程質(zhì)量控制策略

2.1 藥材到飲片的質(zhì)量控制體系

建立藥材的全時(shí)段多波長(zhǎng)融合指紋圖譜和功效成分群定量測(cè)定方法,結(jié)合收率等指標(biāo),利用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)等統(tǒng)計(jì)方法建立分析模型,考察產(chǎn)地,確定最佳采收期、加工方法和炮制工藝參數(shù),對(duì)藥材生產(chǎn)中產(chǎn)地適宜性、種植、田間管理、病蟲害綜合防治、包裝貯藏、運(yùn)輸進(jìn)行生產(chǎn)調(diào)查,制定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程,建立中藥材生產(chǎn)管理規(guī)范的技術(shù)要求。采集離線藥材紅外光譜圖,進(jìn)行異常點(diǎn)剔除處理后,優(yōu)化功效成分近紅外原始光譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理方法和建模最佳光譜波段,運(yùn)用主成分回歸分析法(PCA)、PLS等統(tǒng)計(jì)分析方法建立功效成分的最佳校正定量分析模型,結(jié)合藥材功效成分群一測(cè)多評(píng)的定量測(cè)定方法、定性指紋圖譜,制定藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系[10]。

2.2 飲片到中間體的質(zhì)量控制體系

建立飲片、中間體的多波長(zhǎng)多維融合指紋圖譜和多功效成分定量測(cè)定方法。確定不同生產(chǎn)工段的關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQAs),如功效成分群含量或轉(zhuǎn)移率、浸膏質(zhì)量等,經(jīng)數(shù)據(jù)地圖、數(shù)據(jù)整理、數(shù)據(jù)清洗后、提取特征,結(jié)合CQAs,采用Pearson相關(guān)分析與灰色關(guān)聯(lián)分析相結(jié)合的方法,篩選潛在關(guān)鍵工藝參數(shù)(CPPs),再利用提取的物料屬性(CMAs),采用PLS算法結(jié)合變量重要性投影(VIP)、方差膨脹因子(VIF)和回歸系數(shù),篩選潛在關(guān)鍵物料屬性,以關(guān)鍵工藝參數(shù)/物料屬性為輸入變量,建立CQAs的PLS模型,辨識(shí)工段的關(guān)鍵工藝參數(shù),通過(guò)對(duì)工段的工藝參數(shù)和質(zhì)量參數(shù)的關(guān)聯(lián)分析,明確生產(chǎn)過(guò)程中工藝參數(shù)對(duì)質(zhì)量屬性的影響,為工段關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQAs)在線監(jiān)控、預(yù)測(cè)性調(diào)控和質(zhì)量持續(xù)改進(jìn)提供支撐[11-12]。

在線采集工段過(guò)程中樣品的近紅外光譜圖和離線檢測(cè)功效成分群含量后,對(duì)近紅外光譜圖,分別采用三維空間分布值和線性相關(guān)性統(tǒng)計(jì)量或杠桿值(Leverage)和學(xué)生化殘差(Studentized residual)及馬氏距離(Mahalanobis distance)等方法進(jìn)行異常點(diǎn)的剔除處理,以校正集及交叉驗(yàn)證集模型相關(guān)系數(shù)(R2)、校正集及交互驗(yàn)證集均方根驗(yàn)證誤差(RMSEC,RMSEP)為指標(biāo),對(duì)功效成分近紅外原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理方法和建模最佳光譜波段篩選,之后運(yùn)用PLS或最小二乘支持向量機(jī)法(LS-SVM)或人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法(ANN)等方法優(yōu)化建立功效成分的最佳校正定量分析模型,快速準(zhǔn)確得到工段過(guò)程中未知樣品的功效成分含量,進(jìn)而達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的目的[13-15]。

2.3 中間體到成品的質(zhì)量控制體系

建立離線的成品指紋圖譜、藥材-中間體-成品的全過(guò)程融合指紋圖譜和多功效成分的定量測(cè)定方法,制定相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)合大數(shù)據(jù)分析思路和生產(chǎn)操作,綜合采用數(shù)據(jù)地圖、數(shù)據(jù)整理、數(shù)據(jù)清洗、特征提取以及過(guò)程建模等方法,從生產(chǎn)大數(shù)據(jù)中辨識(shí)制劑成型工段中關(guān)鍵工藝參數(shù)。引入近紅外光譜分析技術(shù),建立基于近紅外光譜的在線定量分析模型,實(shí)時(shí)檢測(cè)功效成分群含量;結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)過(guò)程控制(MSPC)技術(shù)建立統(tǒng)計(jì)模型,形成工序過(guò)程/成品的主成分得分、HotellingT2和DmodX軌跡圖,監(jiān)控過(guò)程操作參數(shù)的異常波動(dòng),制定工藝過(guò)程批放行定量和定性標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)現(xiàn)過(guò)程操作參數(shù)的全程監(jiān)控,觀測(cè)過(guò)程中的質(zhì)量變化[16-18]。

3 討論

“功效成分群”是中成藥成分群與靶點(diǎn)群多維關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)化的效應(yīng)物質(zhì)總和,可轉(zhuǎn)化為中成藥生產(chǎn)過(guò)程控制的質(zhì)量標(biāo)志物,對(duì)中成藥現(xiàn)代化生產(chǎn)具有重要意義。本團(tuán)隊(duì)多年來(lái)圍繞功效成分群發(fā)現(xiàn)及其在全過(guò)程質(zhì)量控制方面做的工作,以保障中成藥質(zhì)量均一性,提升其有效性,滿足現(xiàn)代社會(huì)對(duì)其需求。盡管在功效成分群研究方面建立了多種研究策略,但其中仍有諸多限制,需要融合更多領(lǐng)域的技術(shù)方法,多尺度評(píng)價(jià)豐富功效成分群研究策略,將藥物作用與中醫(yī)病證相對(duì)應(yīng),更加系統(tǒng)地闡明中成藥的功效成分群。