骨癌痛 (bone cancer pain, BCP) 常發(fā)生在癌癥晚期的骨轉(zhuǎn)移病人中，如乳腺癌、肺癌和前列腺癌

，引起劇烈的疼痛反應(yīng)。2020 年全世界約有1000 萬人死于癌癥

，約75%的癌癥晚期病人經(jīng)歷中度或重度疼痛，至少一半的病人使用現(xiàn)有的藥物無法有效的緩解

。阿片類藥物作為癌痛三階梯用藥，發(fā)揮著重要的作用，但也存在明顯的呼吸抑制、藥物依賴等不良反應(yīng)

，全世界超過1500 萬人經(jīng)歷著阿片類藥物使用障礙 (opioid use disorder, OUD)，急需尋找新的藥物和作用靶點(diǎn)。目前BCP 發(fā)病機(jī)制不清，最新的研究專注于BCP 的細(xì)胞和分子機(jī)制，以開發(fā)新的靶向治療

。

1.2 基于項(xiàng)目學(xué)習(xí)理論的復(fù)習(xí) 項(xiàng)目學(xué)習(xí)是一種通過完成一個(gè)項(xiàng)目(課題)來促進(jìn)學(xué)習(xí)者學(xué)習(xí)的方式，它以建構(gòu)主義為理論指導(dǎo)，以小組合作的方式進(jìn)行規(guī)劃和解決項(xiàng)目任務(wù)。項(xiàng)目學(xué)習(xí)強(qiáng)調(diào)以項(xiàng)目任務(wù)驅(qū)動(dòng)學(xué)生學(xué)習(xí)，它以信息加工心理學(xué)和認(rèn)知心理學(xué)為基礎(chǔ)，強(qiáng)調(diào)學(xué)習(xí)的過程以學(xué)生的主動(dòng)、合作學(xué)習(xí)為主，認(rèn)為學(xué)習(xí)是學(xué)生自主構(gòu)建知識(shí)的過程[2]。根據(jù)項(xiàng)目學(xué)習(xí)理論，新高考生物學(xué)復(fù)習(xí)尤其是“二考”復(fù)習(xí)從學(xué)生出發(fā)、以學(xué)生的問題為導(dǎo)向，指導(dǎo)學(xué)生對(duì)考試內(nèi)容進(jìn)行自主構(gòu)建、合作交流完成復(fù)習(xí)任務(wù)，達(dá)到對(duì)知識(shí)的深度學(xué)習(xí)和熟練應(yīng)用。

G 蛋白耦聯(lián)受體 (G protein-coupled receptors,GPCRs) 是人類最大的膜蛋白受體家族，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過1000 個(gè)人類GPCRs

。GPCRs 作為藥理學(xué)靶點(diǎn)一直備受關(guān)注，靶向GPCRs 的藥物占全球治療藥物市場(chǎng)份額約27%

。GPCRs 廣泛分布于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是疼痛治療最重要的靶點(diǎn)之一，針對(duì)每一種GPCRs 亞型特異性的藥物開發(fā)，都可能會(huì)提高鎮(zhèn)痛藥的療效，并最大限度地減少不良反應(yīng)

。

GPR160 (G protein-coupled receptors 160) 受體在物種間高度保守，廣泛存在于人類和嚙齒動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中

。研究表明，GPR160 受體參與了神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和維持，鞘內(nèi)注射GPR160-siRNA 能有效緩解痛覺過敏現(xiàn)象

。目前尚未發(fā)現(xiàn)GPR160 受體在BCP 中的相關(guān)報(bào)道，GPR160 受體是否參與BCP 的發(fā)病機(jī)制，以及如何影響B(tài)CP 的發(fā)生發(fā)展，將是本研究探討的內(nèi)容。本研究首次發(fā)現(xiàn)GPR160受體參與BCP大鼠脊髓中樞敏化的作用，為開發(fā)以GPR160 受體為靶點(diǎn)的藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

方 法

1.主要試劑和儀器

主要試劑：GPR160 抗體（美國(guó)Invitrogen）、GPR160-siRNA（上海吉瑪）、BCA 蛋白濃度試劑盒（碧云天）、逆轉(zhuǎn)錄酶和SYBR

Green (Thermo Scientific)、ELISA 試劑盒（聯(lián)科生物）。

CatWalk 步態(tài)分析結(jié)果顯示，與BCP 組大鼠相比，siGpr160 組大鼠在最大觸地面積(

＜ 0.001)、最大觸地面積時(shí)最大壓強(qiáng)(

＜ 0.05)、平均壓強(qiáng)(

＜0.001)顯著增加（見圖3D-F）。MWT 結(jié)果提示，鞘內(nèi)給藥后，siGpr160 組MWT 在BCP 術(shù)后第10 天(

＜ 0.05)、12 天(

＜ 0.001)顯著升高（見圖3G）。Western Blot 結(jié)果顯示，與BCP + sieGfp 組相比，BCP + siGpr160組GPR160蛋白顯著下降（

＜ 0.001，見圖3H）。

在嫁接之后要對(duì)嫁接苗利用拱棚覆蓋進(jìn)行溫度管理，頭3天白天保持28-30℃，夜間18-20℃，土溫25℃左右。3天后逐漸降低溫度，白天在25-27℃，夜間17-20℃。6天后可把小拱棚的薄膜掀開一部分，逐漸擴(kuò)大，逐步降低空氣相對(duì)濕度，8天后去掉小拱棚。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

雌性SD 大鼠，體重180～200 g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供（倫理審批號(hào)：2021-JUM 097），動(dòng)物飼養(yǎng)于22±2℃室溫下，維持大鼠12 h/12 h 晝夜節(jié)律，自由攝食攝水。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照國(guó)際疼痛學(xué)會(huì) (International Association for the Study of Pain,IASP) 關(guān)于應(yīng)用動(dòng)物進(jìn)行疼痛研究的倫理綱要進(jìn)行操作，整個(gè)過程盡量減少動(dòng)物的不適和使用量。

“大搬快治”工作開展以來，各級(jí)黨委政府領(lǐng)導(dǎo)高度重視，省、市主要領(lǐng)導(dǎo)、分管領(lǐng)導(dǎo)25次對(duì)“大搬快治”工作作出批示。層層落實(shí)工作責(zé)任，通過及時(shí)召開各類動(dòng)員會(huì)、部署會(huì)、推進(jìn)會(huì)，白天干完晚上干，密集開展實(shí)地調(diào)研、督查指導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)問題，當(dāng)場(chǎng)解決一個(gè)問題，真正做到問題不過夜、工作不停歇，有力推動(dòng)工作落實(shí)。如景寧畬族自治縣實(shí)行“督戰(zhàn)令”制度，縣委書記、縣長(zhǎng)親自督導(dǎo)“大搬快治”工作；蓮都區(qū)落實(shí)“后進(jìn)約談”機(jī)制，對(duì)工作不力的鄉(xiāng)鎮(zhèn)（街道）實(shí)行問責(zé)約談，有效保障了“大搬快治”的工作進(jìn)度。

雌性SD 大鼠92 只，第一部分分組：正常組（Na?ve 組，

= 8）、假手術(shù)組（Sham 組，

= 8）和骨癌痛組（BCP 組，

= 8）進(jìn)行

Frey 機(jī)械痛閾測(cè)定，其中Sham 組和BCP 組在第18 天取材用于CT (

= 3)、HE (

= 3)和免疫熒光(

= 2)。第二部分分組：Sham 組和BCP 組，Sham (

= 8)組和BCP 組(

= 8)用于RT-PCR 檢測(cè)GPR160 的mRNA 表達(dá)；Sham 組、BCP 6 天、BCP 12 天和BCP 18 天用于Western Blot 檢測(cè)GPR160 蛋白。第三部分分組：Sham 組(

= 8)、BCP 組(

= 8)、BCP +sieGfp 組(

= 8)和BCP + siGpr160 組(

= 8)用于

Frey 機(jī)械痛閾測(cè)定和步態(tài)分析，另Na?ve 組 (

=4)作為正常組對(duì)比；其中Na?ve 組(

= 4)、Sham 組(

= 4)、BCP 組(

= 4)和BCP + siGpr160 組(

= 4)用于TNF-α、IL-1β 和IL-6 的Western Blot 和ELISA檢測(cè)。

3.實(shí)驗(yàn)流程

第一部分：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境3 天后，于BCP造模前、造模后6 天、12 天和18 天進(jìn)行

Frey機(jī)械痛閾測(cè)定，其中于造模后12 天取材進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，第18 天取材進(jìn)行HE 和CT 檢測(cè)。第二部分：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境3 天后，進(jìn)行BCP 造模（Sham 組注射滅活癌細(xì)胞），于造模后6 天、12天和18 天取材Western Blot 實(shí)驗(yàn)；于造模后第12天取材（Sham 組和BCP 組，

= 8）進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。第三部分：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境3 天后，進(jìn)行

Frey 機(jī)械痛閾測(cè)定，然后BCP 造模（Sham 組注射滅活癌細(xì)胞），于造模后第3 天進(jìn)行鞘內(nèi)置管并驗(yàn)證成功后，于造模后第7 天、8 天、9 天、10天、11 天和12 天鞘內(nèi)給藥，并于造模后第6 天、7 天、8 天、9 天、10 天、11 天和12 天鞘內(nèi)給藥1 h后進(jìn)行

Frey 機(jī)械痛閾測(cè)定，第12 天鞘內(nèi)給藥1 h 后進(jìn)行步態(tài)分析，然后取材進(jìn)行Western Blot 和ELISA 實(shí)驗(yàn)。

4. BCP 模型的建立

參照我們之前的方法

建立大鼠BCP 模型。將保存于液氮中的Walker 256 乳腺癌細(xì)胞株取出，37℃水浴復(fù)蘇，取0.5 ml (2 ×10

) Walker 256 細(xì)胞種植于SD 大鼠腹腔，3～4 天后出現(xiàn)腹水。抽出腹水，用Hank's 液洗滌3 次，細(xì)胞計(jì)數(shù)。采用戊巴比妥鈉麻醉(50 mg/kg)，在左脛骨中下1/3 處縱向切開皮膚暴露脛骨，用微量注射器抽取10 μl Walker 256 乳腺癌細(xì)胞(1×10

)，從骨面向干骺端穿刺緩慢注入骨髓腔，Sham 組注入10 μl 滅活癌細(xì)胞，停留1 min 后拔出，立即用醫(yī)用膠封堵針孔。

5.鞘內(nèi)置管給藥

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與Na?ve或Sham組相比，BCP 組TNF-α (

＜ 0.001)、IL-1β (

＜ 0.001)和IL-6(

＜ 0.001)顯著增高；與BCP 組相比，siGpr160 組TNF-α (

＜ 0.01)、IL-1β (

＜ 0.01)、IL-6 (

＜ 0.001)顯著下降（見圖4A-C）。Western Blot 結(jié)果顯示，與Na?ve 或Sham 組相比，BCP 組TNF-α (

＜ 0.001)、IL-1β (

＜ 0.001)和IL-6 (

＜ 0.001)顯著增高；與BCP 組 相 比，siGpr160 組TNF-α (

＜ 0.01)、IL-1β(

＜ 0.05)、IL-6 (

＜ 0.05)顯著下降（見圖4D-G）。

6.機(jī)械痛閾的測(cè)定

采用

Frey 檢測(cè)BCP 大鼠機(jī)械刺激縮足反射閾值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)

，安靜環(huán)境下，將大鼠置于底部為0.5 cm×0.5 cm 鐵絲網(wǎng)格有機(jī)玻璃箱(20 cm×20 cm×25 cm)中，適應(yīng)環(huán)境30 min。采用

Frey 電子式機(jī)械測(cè)痛儀測(cè)定MWT，對(duì)準(zhǔn)大鼠左側(cè)足底中間部位，逐漸加壓，當(dāng)大鼠出現(xiàn)縮足、舔足、甩足時(shí)記錄壓力值，測(cè)定3 次，每次間隔10 s，取其平均值為MWT (g)。在BCP 術(shù)前、術(shù)后第6 天、12 天、18 天測(cè)定大鼠左足MWT (g)。BCP + siGpr160 組大鼠在BCP 術(shù)后7～12 天連續(xù)鞘內(nèi)注入GPR160-siRNA，對(duì)照組鞘內(nèi)注入GPR160-sieGfp，于BCP 術(shù)前、術(shù)后6 天、8 天、10 天、12 天鞘內(nèi)給藥1 h 后進(jìn)行測(cè)痛。

7.步態(tài)分析

使用CatWalk 步態(tài)分析系統(tǒng)對(duì)運(yùn)動(dòng)中的大鼠進(jìn)行步態(tài)分析，步態(tài)分析已被證明是測(cè)量疼痛相關(guān)行為的有效方法。光線從通道底部熒光管中發(fā)出，穿過玻璃板，大鼠腳印與玻璃板接觸時(shí)，光線向下反射，下方的高速攝像機(jī)捕捉到大鼠的腳印圖像，全程采集大鼠腳印的參數(shù)。采集前進(jìn)行訓(xùn)練，以勻速、無停頓地通過通道為準(zhǔn)。CatWalk 系統(tǒng)常采用腳印的接觸面積和強(qiáng)度作為衡量指標(biāo)

，因此，本研究采用以下三個(gè)指標(biāo)來評(píng)估骨癌痛前后的相關(guān)行為：①最大觸地面積 (max contact area)：足部接觸最多時(shí)的面積；②最大觸地面積時(shí)最大強(qiáng)度 (max contact max intensity)：足部接觸玻璃板時(shí)最大壓強(qiáng)；③平均強(qiáng)度 (mean intensity)：足部觸地面積最大時(shí)的平均強(qiáng)度。為了減小差異，本研究采用左后肢/右后肢比值來消除其他因素影響，數(shù)據(jù)采用左后肢/右后肢百分比形式。

8. CT 三維重建

建立骨癌痛模型后18 天，腹腔注射戊巴比妥鈉(100 mg/kg)深麻醉后取材（造模側(cè)下肢），對(duì)大鼠脛骨進(jìn)行CT 三維重建，觀察骨質(zhì)破壞情況，根據(jù)之前的研究

，CT 掃描參數(shù)如下：螺旋掃描，管電壓為120 kVp，層厚1 mm，層間距1 mm，核：U30u 中等光滑，SD 大鼠脛骨的CT 成像為高分辨率（視野為100 mm）。所有圖像通過西門子PACS系統(tǒng)軟件處理和分析。

9. HE 染色

建立骨癌痛模型后18 天，腹腔注射戊巴比妥鈉(100 mg/kg)取材，大鼠左側(cè)脛骨經(jīng)4%多聚甲醛固定、脫鈣、石蠟包埋、切片后進(jìn)行HE 染色。使用顯微鏡（日本Olympus）采集分析圖像，觀察腫瘤生長(zhǎng)及骨質(zhì)破壞情況。

10. Western Blot

11. Real-time PCR

大鼠脊髓背角取材（同Western Blot 步驟），Trizol 法提取總RNA，測(cè)定濃度后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermoscientific RevertAid cDNA synthesis Kit, USA) 將1000 ng RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀中進(jìn)行Real-time PCR 反應(yīng)，引物由上海生工設(shè)計(jì)合成。GPR160 Forward:5'-TTCCTTCGCTTACGGCTTCTTGC-3', Reverse: 5'-GCTTGGCTCTGGACAGATTAC-3'; β-actin Forward:5'-ATCACTATCGGCAATGAGCGGTTC-3', Reverse;5'- TGTTGGCATAGAGGTCTTTACGGATG-3'。PCR擴(kuò)增條件為：(50℃, 120 s; 95℃, 120 s)；擴(kuò)增循環(huán) 40次(95 ℃, 15 s; 60 ℃, 60 s)；溶解(95 ℃, 15 s; 60 ℃,60 s; 95 ℃, 15 s)。熒光實(shí)時(shí)定量PCR 采用2

法分析，相對(duì)表達(dá)量采用與β-actin 的比值；

ct、

ct 計(jì)算公式：

ct = 目的基因CT 值-內(nèi)參基因CT 值；

ct =

ct（處理組）-

ct（對(duì)照組）。

12.免疫熒光

CatWalk 步態(tài)分析系統(tǒng)作為研究機(jī)械性疼痛的方法

，本研究采用觸地面積和壓強(qiáng)作為參考指標(biāo)，數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，與Sham 組相比，BCP 組大鼠在最大觸地面積(

＜ 0.001)、最大觸地面積時(shí)最大壓強(qiáng)(

＜ 0.05)、平均壓強(qiáng)(

＜ 0.01)均顯著降低（見圖3 A-F）。

13. ELISA

大鼠BCP 造模后12 天取材（同Western Blot步驟），裂解液提取組織蛋白，10 倍稀釋蛋白上清，參照文獻(xiàn)

方法，并依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，加樣、富集孵育、洗板、加酶標(biāo)抗體、再次洗板、底物顯色和終止反應(yīng)，然后酶標(biāo)儀讀取450 nm 下樣本的OD 值。擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣本OD 值代入方程，計(jì)算樣品濃度。

14. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(100 mg/Kg)深麻醉后，在冰上快速取出大鼠脊髓腰段膨大處(L

-L

)脊髓背角，液氮儲(chǔ)存。組織40 mg 加入RIPA 裂解液（含PMSF和磷酸酶抑制劑）300 μl，超聲破碎勻漿，冰上裂解30 min，4℃ 14,000 r/min 離心20 min，吸取上清。BCA 法測(cè)定蛋白濃度，上樣緩沖液1:4配比，每孔加入40 μg 蛋白樣SDS-PAGE 膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，5% BSA 室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫2 h，ECL 顯影。使用Image J 軟件對(duì)圖片進(jìn)行灰度分析，GPR160 蛋白相對(duì)表達(dá)量以GPR160 蛋白條帶灰度值與GAPDH 條帶灰度值比值表示。

(4)螺栓的標(biāo)高控制。在螺栓高度的控制環(huán)節(jié)，其關(guān)鍵是安裝時(shí)入柱螺桿與柱箍筋的焊接質(zhì)量和定位標(biāo)高控制，而對(duì)過程的跟蹤復(fù)查僅是糾偏。

結(jié) 果

1.骨癌痛模型的建立

痛閾結(jié)果顯示，與Na?ve 組或Sham 組相比，BCP 組大鼠在6 天(

＜ 0.05)、12 天(

＜ 0.001)、18天(

＜ 0.001)的MWT 顯著降低（見圖1A）。CT成像顯示，與Sham 組相比，BCP 組大鼠在術(shù)后18天左側(cè)脛骨出現(xiàn)明顯的骨質(zhì)破壞（見圖1B）。脛骨組織病理學(xué)結(jié)果顯示，Sham 組骨髓腔可見正常的骨小梁結(jié)構(gòu)（見圖1C），而BCP 組骨髓腔內(nèi)可見被侵蝕的骨小梁結(jié)構(gòu)，骨髓腔充滿核大深染的腫瘤細(xì)胞（見圖1D）。

2. GPR160 在BCP 大鼠脊髓中的表達(dá)

免疫熒光結(jié)果顯示，與Sham 組相比，BCP術(shù)后12 天GPR160 的表達(dá)增強(qiáng)（見圖2A 和圖2C）；在BCP 術(shù)后12 天脊髓背角上，與對(duì)側(cè)(Contra)相比，造模側(cè)(Ipsi)的GPR160 表達(dá)增強(qiáng)（見圖2B）。Western Blot 結(jié)果顯示，與Sham 組相比，GPR160 蛋 白 在BCP 術(shù) 后6 天(

＜ 0.05)、12 天(

＜ 0.01)、18 天(

＜ 0.001)明顯增高（見圖2D）。Real-time PCR 結(jié)果顯示，與Sham 組相比，BCP 組GPR160 mRNA 表達(dá)顯著增加（

＜ 0.001，見圖2E）。

3.鞘內(nèi)注射GPR160-siRNA 對(duì)BCP 大鼠MWT及GPR160 蛋白的影響

大鼠BCP 造模后12 天，戊巴比妥鈉(50 mg/kg)深度麻醉，經(jīng)心尖穿入靜脈針至升主動(dòng)脈，快速灌注PBS 500 ml 后，再用4%多聚甲醛250 ml 灌注固定，將脊髓取出放入4%多聚甲醛固定6 h，然后在15 %和30%蔗糖溶液中梯度脫水48 h，擦干水分后使用OCT (Sakura)在-20℃包埋，切成16 μm厚的切片置于載玻片上，放入-80℃保存。切片使用PBS 洗滌，5% BSA 封閉室溫1 h，然后在4℃冰箱孵育一抗GPR160 (orb215127, Biorbyt, Cambridge,UK) 過夜，第2 天室溫復(fù)溫30 min, PBS 洗滌后，在室溫下二抗[Abcam, donkey anti-rabbit IgG H&L(Alexa Fluor

488), ab150073]孵育50 min, PBS 洗滌后滴加DAPI (Vectashield-DAPI mounting medium)封片，使用熒光共聚焦顯微鏡 (Zeiss, Germany) 采集圖像。

實(shí)驗(yàn)所用主要儀器：實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(Applied Biosystems)、電泳儀(Bio-Rad)、多功能酶標(biāo)儀(Bio Tek)、超微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific)、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（新芝）、共聚焦顯微鏡(Zeiss,Germany)、動(dòng)物步態(tài)分析系統(tǒng)(CatWalkXT)、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(GeneGnome)、

Frey 電子式機(jī)械測(cè)痛儀(BME-404)。

新興媒體的發(fā)展則打破了時(shí)空的局限，讓圖書館信息服務(wù)成為一個(gè)不受時(shí)空限制的交互平臺(tái)。讀者即可以隨時(shí)隨地通過各種智能終端實(shí)現(xiàn)對(duì)圖書館資源的訪問和數(shù)據(jù)下載，同時(shí)還可以利用即時(shí)通信工具或網(wǎng)絡(luò)論壇方式進(jìn)行問題的咨詢和發(fā)布，館員也可以實(shí)現(xiàn)隨時(shí)隨地的回復(fù)相應(yīng)的咨詢問題，使得館員為讀者服務(wù)的手段更加便捷化。

4.鞘內(nèi)注射GPR160-siRNA 對(duì)骨癌痛大鼠脊髓TNF-α、IL-1β 及IL-6 蛋白表達(dá)的影響

將大鼠戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后，在L

棘突處做一縱向切口，分離L

棘突旁肌肉和椎板，切除L

棘突，暴露L

椎間隙，用26 G 針刺破黃韌帶和硬脊膜，經(jīng)破口處置入PE-10 導(dǎo)管2 cm，18 G 硬膜外穿刺針在皮下穿一條隧道至頸背部，外露2 cm 固定，外口封閉，防止腦脊液外漏。術(shù)后第2 天經(jīng)PE-10 管注入2%利多卡因15 μl 測(cè)試，30 s內(nèi)出現(xiàn)下肢麻痹，30 min 左右恢復(fù)，表明置管成功。置管后單籠飼養(yǎng)，觀察2 天，出現(xiàn)肢體感覺或運(yùn)動(dòng)障礙、導(dǎo)管脫出的剔除，于BCP 造模后第7 天、8 天、9 天、10 天、11 天、12 天開始鞘內(nèi)注射GPR160-siRNA 或者對(duì)照藥物 (GPR160-sieGfp)，在BCP 造模后第12 天取材進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)需測(cè)取同種激勵(lì)不同電場(chǎng)條件下經(jīng)減振器減振后的加速度衰減的數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)采用型號(hào)為JZ-5激振器給減振器提供正弦力F，采用DH5299動(dòng)態(tài)信號(hào)采集器和GF-20型號(hào)的功率放大器對(duì)激振器的振幅A和頻率ω進(jìn)行控制以及采集各傳感器的數(shù)據(jù)，加速度傳感器型號(hào)是YJ9A的壓電傳感器；壓電力傳感器的型號(hào)為YFF-1。按照上述的實(shí)驗(yàn)器材以及實(shí)驗(yàn)想法設(shè)計(jì)出實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)示意圖3，其中虛線框中的直流穩(wěn)壓電源和高壓放大器組成了直流穩(wěn)壓高壓電源，為后續(xù)對(duì)比實(shí)驗(yàn)提供1000V的穩(wěn)定高壓。

討 論

骨癌痛 (BCP) 是一種復(fù)雜的慢性疼痛，國(guó)際上有多種研究骨癌痛的動(dòng)物模型

，這些模型在一定程度上可以產(chǎn)生與臨床骨癌痛病人相似的疼痛狀態(tài)，以便觀察骨癌痛的發(fā)生發(fā)展、骨質(zhì)破壞、中樞及外周組織中的分子生物學(xué)改變。

本研究采用姚明等

建立的骨癌痛模型，在造模后第6 天左足開始出現(xiàn)明顯的痛閾下降，且疼痛的程度和時(shí)間與行為學(xué)表現(xiàn)一致；HE 染色可見骨髓腔內(nèi)大量癌細(xì)胞和遭到破壞的骨小梁，CT 三維重建再次驗(yàn)證了BCP 組存在明顯的骨質(zhì)破壞；行為學(xué)CatWalk 步態(tài)分析結(jié)果顯示，BCP 組大鼠左足在最大觸地面積、最大觸地面積時(shí)最大壓強(qiáng)、平均壓強(qiáng)出現(xiàn)顯著下降，這與相關(guān)的研究結(jié)果一致

，驗(yàn)證模型成功。

隨著GPR160 受體的配體CARTp 的確定

，CARTp/GPR160 信號(hào)通路也被認(rèn)為與獎(jiǎng)賞、成癮、厭食和抑郁等有關(guān)

，其在疼痛中的作用也受到重視。Yosten 等

在坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型 (chronic constriction injury, CCI)上發(fā)現(xiàn)GPR160 受體參與痛覺過敏的發(fā)生。

4.3 詞匯密度與“個(gè)性風(fēng)格詞匯”之計(jì)算。詞匯密度計(jì)算方中，實(shí)詞是指名詞、動(dòng)詞、形容詞和副詞四類。根據(jù)Biber(2000：62),計(jì)算公式是：詞匯密度=實(shí)詞數(shù)÷總詞數(shù)×100%。Ure指出，詞匯密度可以作為區(qū)別語體正式程度的一個(gè)指標(biāo)，某文本的詞匯密度越高，則該文本的語體越接近正式端；反之，若該文本詞匯密度低，則可以說明，該文本越靠近非正式端，越接近自然口語。據(jù)Ure(1971：443-452)的研究，口語的詞匯密度大概通常低于40%，而在書面語里，詞匯密度通常要超過40%。

為了探究GPR160 受體在骨癌痛中的表達(dá)，本研究發(fā)現(xiàn)，與Na?ve 或Sham 組相比，BCP 組大鼠脊髓中GPR160 蛋白和mRNA 表達(dá)量均顯著增加，提示BCP 上調(diào)脊髓中GPR160 受體的蛋白和mRNA的表達(dá)，這與之前在神經(jīng)病理性疼痛中的研究結(jié)果一致

。為了進(jìn)一步明確GPR160 受體在BCP 中的作用，本研究鞘內(nèi)注射了GPR160-siRNA，結(jié)果顯示，與BCP + sieGfp 組 相 比，BCP + siGpr160 組 大 鼠MWT 顯著降低，GPR160 蛋白也顯著下降，提示抑制GPR160 受體有助于減輕骨癌痛；CatWalk 步態(tài)分析結(jié)果提示，與BCP 組相比，BCP + siGpr160 組大鼠在最大觸地面積、最大觸地面積時(shí)最大壓強(qiáng)、平均壓強(qiáng)出現(xiàn)顯著的上升，提示疼痛程度減輕。但同時(shí)也觀察到，鞘內(nèi)注射GPR160-siRNA 并沒有完全逆轉(zhuǎn)BCP 模型大鼠的痛閾下降程度（MWT 曲線并未達(dá)到基線水平），提示GPR160 受體途徑可能是參與大鼠骨癌痛發(fā)生和維持的重要機(jī)制之一。

炎癥因子（TNF-α、IL-1β 和IL-6）在疼痛信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著重要的作用

。本研究采用ELISA和Western Blot 檢測(cè)了骨癌痛大鼠脊髓中的炎癥因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Na?ve 或Sham 組相比，BCP組大鼠脊髓中的炎癥因子顯著升高，而在鞘內(nèi)注射GPR160-siRNA 后，炎癥因子水平出現(xiàn)顯著下降；與BCP + sieGfp 組相比，BCP + siGpr160 組的MWT 明顯的上升，提示抑制GPR160 受體后，減少了炎癥因子的釋放，減輕痛覺過敏反應(yīng)。

1.3 觀察指標(biāo) 對(duì)兩組患兒治療前后不同時(shí)段心率(HR)、呼吸頻率(R)、平均壓、血氧飽和度(SpO2)、新生兒行為神經(jīng)評(píng)分(NBNA)以及治療后不良反應(yīng)發(fā)生情況進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[6]。NBNA神經(jīng)功能評(píng)分主要包括行為能力、主動(dòng)肌張力及原始反射等5個(gè)方面，總分>35分表示正常，<35分表示異常[7]。

雖然BCP 的發(fā)病機(jī)制不清，但目前的普遍觀點(diǎn)歸納為：①周圍神經(jīng)損傷和炎癥介質(zhì)引起的傷害感受器的外周敏化

；②脊髓中廣泛的神經(jīng)化學(xué)變化導(dǎo)致的中樞敏化

；③下行抑制系統(tǒng)的喪失和異化系統(tǒng)的激活

。神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞在BCP 發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，在腫瘤細(xì)胞置入大鼠骨髓腔后，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，釋放大量的炎癥因子（如TNF-α、IL-1β 和IL-6），上調(diào)細(xì)胞表面的受體（如P2X3R、TLR4 和CX3CR1），并激活胞內(nèi)信號(hào)通路（如PI3K/Akt、NF-kB 和ERK通路）

。研究發(fā)現(xiàn)抑制TNFR1 和IL-6R 可減輕BCP 大鼠機(jī)械痛和熱痛過敏

；同樣，IL-1β 也可通過增加NMDA 受體NR1 亞基的磷酸化促進(jìn)BCP

。GPR160 受體在脊髓中的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)

，參與神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的信號(hào)傳遞。在鞘內(nèi)注射GPR160-siRNA 后，炎癥因子水平下降、MWT 上升，提示BCP 大鼠膠質(zhì)細(xì)胞的活化和/或神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞的交互作用可能受到了抑制。關(guān)于GPR160 受體在神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞中如何影響B(tài)CP 的發(fā)展，我們將進(jìn)一步深入研究。

本研究未進(jìn)行GPR160 的過表達(dá)處理，沒有進(jìn)一步探究GPR160 在興奮性神經(jīng)元或抑制性神經(jīng)元中的分布，接下來還將繼續(xù)GPR160 參與疼痛調(diào)節(jié)直接機(jī)制的研究。綜上所述，在本研究條件下，首次證明了GPR160 受體參與了脊髓水平大鼠骨癌痛的發(fā)生和維持，其機(jī)制可能與促進(jìn)炎癥因子釋放有關(guān)，這為臨床治療提供了新的思路。

首次登記時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)劃審批圖件準(zhǔn)確客觀的劃分被登記建筑的基本單元情況，不僅無需僅依靠第三方測(cè)繪成果，反而可以發(fā)現(xiàn)其不當(dāng)之處，有效杜絕一些測(cè)繪問題，例如重慶市于2010年就要求開發(fā)建設(shè)項(xiàng)目竣工后測(cè)繪的，必須結(jié)合規(guī)劃審批圖紙和房屋現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行測(cè)量，房屋測(cè)繪結(jié)果應(yīng)還原到規(guī)劃審批的設(shè)計(jì)內(nèi)容中去[8]。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。

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