潘秋，閆玉冰，田聰陽(yáng)，張志清，于彤，柴欣樓，楊然

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)航空總醫(yī)院，北京 100012；4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院，北京100053

高血脂引發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化及冠心病等成為老年人致死的主要原因，膽固醇作為脂代謝過(guò)程的重要部分，被認(rèn)為是疾病進(jìn)展的重要影響因素，降膽固醇藥物的研究是當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。迄今為止，批準(zhǔn)上市的抑制膽固醇吸收藥物只有依折麥布，其與他汀類(lèi)藥物聯(lián)合應(yīng)用相比單一使用他汀類(lèi)藥物可以更好地降低低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，但藥物聯(lián)用往往會(huì)增加肝功能損傷及肌痛等不良反應(yīng)發(fā)生率。

降脂1號(hào)是本課題組從名老中醫(yī)郭維琴臨床經(jīng)驗(yàn)方中提煉的處方，具有活血消食、祛濕健脾功效，臨床用于治療高膽固醇血癥，但其具體作用機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)采用高脂乳劑誘導(dǎo)建立高脂血癥大鼠模型及Caco-2細(xì)胞脂質(zhì)蓄積模型，以小腸為切入點(diǎn)，從膽固醇攝取及排出2個(gè)環(huán)節(jié)探討其作用機(jī)制，為降脂1號(hào)的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞

8 周齡SPF 級(jí)雄性SD 大鼠48 只，體質(zhì)量（180±20）g，斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2019-0010。常規(guī)飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)清潔級(jí)動(dòng)物房，（溫度22±2）℃、12 h明暗交替，自由進(jìn)食飲水，使用許可證號(hào)SYXK（京）2019-0010。本實(shí)驗(yàn)由北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞株購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。

1.2 藥物及制備

降脂1號(hào)顆粒由中日友好醫(yī)院制劑室提供，灌胃前用去離子水稀釋溶解；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前用去離子水稀釋?zhuān)⒂诔瑑艄ぷ髋_(tái)內(nèi)用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌分裝，-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。阿托伐他汀片，輝瑞制藥有限公司，批號(hào)20140326，20 mg/片，將藥片粉碎，使用蒸餾水溶解，制成濃度為1.05 mg/mL溶液。丙硫氧嘧啶片，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)1021045，50 mg/片。依折麥布片，默沙東（中國(guó)）有限公司，批號(hào)20160181，10 mg/片。

1.3 主要試劑與儀器

ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G5（ABCG5）兔多克隆抗體（美國(guó)Proteintech 公司，批號(hào)27722-1-AP），NPC1L1多克隆抗體（美國(guó)Thermo公司，批號(hào)PA1-16800），超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)PV-9002），DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)ZLI-9018），DAPI染色液（北京Solarbio，批號(hào)C0065）。120全自動(dòng)生化分析儀（日本東芝），D-37520 高速離心機(jī)（德國(guó)Sigma），RM2235切片機(jī)（德國(guó)Leica），G1150H石蠟包埋機(jī)（德國(guó)Leica），CJT-E-Ⅱ超凈工作臺(tái)（北京市昌平長(zhǎng)城空氣凈化設(shè)備公司）。

1.4 分組、造模及給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，48只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、阿托伐他汀組和降脂1號(hào)低、中、高劑量組，每組8只。高脂乳劑按照課題組前期方法配制：豬油30 g、膽固醇5 g、蛋黃粉5 g、丙硫氧嘧啶0.5 g、吐溫-80 4 mL，加蒸餾水定容至100 mL，80 ℃水浴攪拌充分溶解形成高脂乳劑。對(duì)照組予蒸餾水灌胃，其余各組每日固定時(shí)間按2 mL/kg予高脂乳劑灌胃，共6周。造模第2周開(kāi)始給藥，給藥劑量按人與大鼠體表面積進(jìn)行計(jì)算，降脂1號(hào)低、中、高劑量組分別為0.37、1.1、3.3 g/kg（相當(dāng)于臨床等效劑量的1/3、1、3倍），阿托伐他汀組為2.1 mg/kg，灌胃體積2 mL/kg，每日1次，連續(xù)6周。

1.5 取材

末次給藥結(jié)束后大鼠禁食不禁水12 h，稱(chēng)量體質(zhì)量，10%水合氯醛腹腔注射（5 mL/kg）麻醉，腹主動(dòng)脈取血，用于血脂及肝腎功能指標(biāo)檢測(cè)。取小腸組織，預(yù)冷生理鹽水沖凈，迅速置于4%多聚甲醛中固定。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

Caco-2 細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素的完全培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（約第5日），加入胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀加完全培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×10～1×10個(gè)/mL，將細(xì)胞懸液接種至12孔Transwell板，每孔接種細(xì)胞1×10個(gè)，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種后第1周隔日更換培養(yǎng)基，1周后每日更換培養(yǎng)基，至第21日細(xì)胞分化成熟，將細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、依折麥布組和降脂1號(hào)低、中、高濃度組。

1.7 細(xì)胞造模與給藥

對(duì)照組細(xì)胞用不含胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，模型組細(xì)胞用含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，依折麥布組和降脂1號(hào)低、中、高濃度組分別在模型組基礎(chǔ)上加入依折麥布和低、中、高濃度降脂1號(hào)同時(shí)處理24 h。根據(jù)CCK8預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，降脂1號(hào)低、中、高濃度分別為0.3、0.6、1.2 mg/mL，依折麥布濃度為50 μmol/L。

1.8 指標(biāo)檢測(cè)

1.8.1 一般情況

每日觀察大鼠毛色、狀態(tài)，每周測(cè)量大鼠體質(zhì)量。

1.8.2 血脂及肝腎功能指標(biāo)檢測(cè)

采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）水平，本實(shí)驗(yàn)由北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院完成。

1.8.3 HE染色

將固定后的小腸組織從4%多聚甲醛中取出，蒸餾水沖洗過(guò)夜，脫水機(jī)梯度脫水，石蠟包埋，切片（5 μm），常規(guī)HE染色，光鏡下觀察小腸組織病理變化。

1.8.4 免疫組化檢測(cè)

小腸組織石蠟切片脫蠟至水，微波爐加熱修復(fù)抗原，流水沖洗，10%山羊血清室溫孵育30 min，滴加ABCG5 一抗（1∶500）、NPC1L1 一抗（1∶100），37 ℃孵育1 h，滴加二抗，室溫孵育30 min，全自動(dòng)封片機(jī)封片，光學(xué)顯微鏡下觀察，以棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。應(yīng)用ImageJ1.53e圖像分析軟件，根據(jù)陽(yáng)性染色面積和強(qiáng)度計(jì)算平均光密度（MOD）。MOD＝積分光密度÷染色面積。

1.8.5 免疫熒光檢測(cè)

用6孔板制作細(xì)胞爬片，造模及加藥處理后，收集細(xì)胞，將Caco-2 細(xì)胞懸液滴至爬片上，放入37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，滴加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞完全貼滿(mǎn)爬片時(shí)，取出細(xì)胞爬片放入細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入4%多聚甲醛室溫固定，分別滴加ABCG5 一抗（1∶200）、NPC1L1 一抗（1∶100），4 ℃孵育過(guò)夜，滴加熒光二抗，室溫孵育1 h，DAPI復(fù)染，封片，共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。應(yīng)用Image J 1.53e圖像分析軟件，計(jì)算平均熒光強(qiáng)度（累計(jì)熒光強(qiáng)度÷染色面積）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 降脂1號(hào)對(duì)模型大鼠一般情況的影響

對(duì)照組大鼠毛色潔凈有光澤，行動(dòng)靈活，精神狀態(tài)良好，體質(zhì)量有所增加；模型組大鼠毛色干黃無(wú)澤，活動(dòng)減少，形體逐漸消瘦；阿托伐他汀組大鼠形體更加消瘦；降脂1號(hào)低、中、高劑量組大鼠毛色黃而少澤，形體消瘦有所好轉(zhuǎn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，因麻醉過(guò)量及灌胃不當(dāng)，共有14只大鼠死亡。

2.2 降脂1號(hào)對(duì)模型大鼠血脂及肝腎功能指標(biāo)的影響

血脂檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠TC、LDL-C水平明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，阿托伐他汀組與降脂1號(hào)各劑量組大鼠TC、LDL-C水平明顯降低（＜0.05，＜0.01）。各組大鼠TG、HDL-C差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血脂水平比較（，mmol/L）

肝腎功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠ALT、BUN、SCr水平明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，降脂1號(hào)高劑量組大鼠ALT水平明顯降低（＜0.05），降脂1號(hào)中、高劑量組大鼠BUN水平明顯降低（＜0.01），阿托伐他汀組和降脂1號(hào)低、高劑量組大鼠SCr水平明顯降低（＜0.01）。各組大鼠AST差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肝腎功能指標(biāo)比較（）

2.3 降脂1號(hào)對(duì)模型大鼠小腸組織病理變化的影響

對(duì)照組大鼠小腸肌層完整，上皮隱窩及絨毛排列整齊，刷狀緣整齊；模型組大鼠小腸局部肌層較薄，相鄰絨毛融合，間隙變寬，排列疏松有缺失，部分腺體碎裂；阿托伐他汀組大鼠小腸相鄰絨毛融合變寬，排列疏松有缺失，部分腺體碎裂；降脂1號(hào)低、中劑量組大鼠小腸絨毛排列較模型組和阿托伐他汀組緊密、規(guī)則，絨毛高度有所恢復(fù)，相鄰絨毛融合較少；降脂1號(hào)高劑量組大鼠小腸相鄰絨毛部分融合，排列略疏松，部分上皮細(xì)胞脫落，部分腺體碎裂。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠小腸組織形態(tài)（HE染色，×20）

2.4 降脂1 號(hào)對(duì)模型大鼠小腸組織ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G5、NPC1L1表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠小腸組織ABCG5表達(dá)降低，NPC1L1表達(dá)升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；與模型組比較，降脂1號(hào)低劑量組大鼠小腸組織NPC1L1表達(dá)明顯降低（＜0.05），降脂1號(hào)各劑量組大鼠小腸組織ABCG5表達(dá)升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。見(jiàn)圖2、圖3、表3。

表3 各組大鼠小腸組織ABCG5、NPC1L1蛋白表達(dá)比較［M（Q1，Q3），MOD］

圖2 各組大鼠小腸組織ABCG5陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化染色，×20）

圖3 各組大鼠小腸組織NPC1L1陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化染色，×20）

2.5 降脂1號(hào)對(duì)Caco-2細(xì)胞ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G5、NPC1L1蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞ABCG5、NPC1L1表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；與模型組比較，降脂1號(hào)高濃度組細(xì)胞ABCG5表達(dá)明顯升高，NPC1L1表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01），見(jiàn)圖4、圖5、表4。

圖4 各組Caco-2細(xì)胞ABCG5陽(yáng)性表達(dá)（免疫熒光染色，×20）

圖5 各組Caco-2細(xì)胞NPC1L1陽(yáng)性表達(dá)（免疫熒光染色，×20）

表4 各組Caco-2細(xì)胞ABCG5、NPC1L1蛋白表達(dá)比較（，平均熒光強(qiáng)度）

3 討論

LDL-C和TC水平升高是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病重要的危險(xiǎn)因素。中藥復(fù)方可以通過(guò)多組分、多靶點(diǎn)、多通路干預(yù)血脂代謝，從而實(shí)現(xiàn)安全有效調(diào)脂的目的。本課題組以小腸膽固醇代謝為切入點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)降脂1號(hào)可有效降低高脂血癥大鼠血脂水平，并且具有良好的肝腎保護(hù)作用，可明顯改善小腸病變程度，恢復(fù)小腸吸收、排出膽固醇平衡，從而達(dá)到有效降脂的目的。

本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中模型組及給藥組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，丙硫氧嘧啶可明顯減少大鼠進(jìn)食量和體質(zhì)量，灌胃高脂乳劑后進(jìn)食量進(jìn)一步減少，而體質(zhì)量可小幅回升。有報(bào)道，給予大鼠0.2%丙硫氧嘧啶灌胃可導(dǎo)致LDL-C、TC、TG、HDL-C水平升高，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不完全一致，考慮可能是本實(shí)驗(yàn)配制的丙硫氧嘧啶濃度偏高，對(duì)甲狀腺抑制作用更明顯，大鼠進(jìn)食及消化功能明顯趨緩，脂質(zhì)代謝受到影響，TG水平不升反降。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，降脂1號(hào)各劑量組大鼠體質(zhì)量可緩慢增加，推測(cè)可能與降脂1號(hào)緩解丙硫氧嘧啶所致大鼠甲狀腺功能減退有關(guān)。

小腸在脂類(lèi)代謝過(guò)程中與肝臟協(xié)同分工發(fā)揮作用。HE染色發(fā)現(xiàn)，模型大鼠小腸組織明顯損傷，小腸相鄰絨毛融合，間隙變寬，排列疏松，部分腺體碎裂。降脂1號(hào)可顯著改善小腸病理形態(tài)，為發(fā)揮降脂作用提供必要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

NPC1L1在多個(gè)組織中廣泛表達(dá)，尤其在肝臟和小腸中高表達(dá)。NPC1L1能促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞攝取膽固醇，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量降低時(shí)，NPC1L1將移動(dòng)至細(xì)胞膜側(cè)，參與胞外膽固醇攝取進(jìn)入細(xì)胞。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，降脂1號(hào)能降低模型大鼠小腸組織NPC1L1蛋白表達(dá)，其中低劑量組效果最明顯，說(shuō)明減少小腸吸收膽固醇是降脂1號(hào)發(fā)揮降脂作用的重要環(huán)節(jié)之一。ABCG5/G8 屬于ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白半轉(zhuǎn)運(yùn)體，ABCG5/G8結(jié)合成異二聚體，其主要功能是將被攝取進(jìn)入小腸上皮細(xì)胞的膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)回腸腔。本實(shí)驗(yàn)中，雖然各組大鼠小腸組織ABCG5蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異，但降脂1號(hào)各劑量組ABCG5蛋白表達(dá)均有升高趨勢(shì)，其中低劑量組最明顯，提示降脂1號(hào)可促進(jìn)小腸排出膽固醇，降低血脂水平。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，降脂1號(hào)高濃度組細(xì)胞ABCG5表達(dá)明顯降低，與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致。我們認(rèn)為，這可能與大鼠實(shí)驗(yàn)采用丙硫氧嘧啶灌胃有關(guān)。研究表明，臨床或亞臨床甲狀腺功能減退可顯著改變血脂水平，多數(shù)高脂血癥患者伴有甲狀腺功能障礙。提示甲狀腺功能減退可能影響大鼠腸道膽固醇代謝功能，進(jìn)而導(dǎo)致膽固醇流出受損。

經(jīng)腸膽固醇排泄（TICE）是小腸的另一種外排機(jī)制，即膽固醇由血直接經(jīng)腸道分泌和排出體外。有研究表明，依折麥布誘導(dǎo)的TICE大多由ABCG5/G8介導(dǎo)，TICE在人體中很活躍，可能是刺激心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)患者消除膽固醇的新靶點(diǎn)。課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肝臟在膽固醇攝取及流出方面亦發(fā)揮積極作用，本實(shí)驗(yàn)中各給藥組大鼠血清膽固醇水平明顯下降，我們推測(cè)肝臟在調(diào)節(jié)膽固醇代謝方面的正向作用減輕了腸道ABCG5/G8外排膽固醇的負(fù)擔(dān)，但需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，降脂1號(hào)能夠降低高脂血癥大鼠血脂水平，低劑量用藥即可減輕小腸病理?yè)p傷，推測(cè)其機(jī)制可能與抑制小腸膽固醇吸收、促進(jìn)小腸膽固醇排出有關(guān)，其內(nèi)在的相互作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究為指導(dǎo)臨床用藥及藥物進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。