李 敏，王亢宗，李艷林，宋 偉，鄭寶江，徐志超，薛哲勇，華 欣

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 哈爾濱 150006）

刺五加（Eleutherococcus senticosus）為五加科五加屬多年生落葉灌木，其根莖發(fā)達(dá)，莖常密布細(xì)刺，掌狀復(fù)葉互生，傘形花序，漿果狀核果[1]；多分布于我國(guó)東北地區(qū)，是我國(guó)一種傳統(tǒng)中藥。根據(jù)《藥典》記載，以其干燥的根，莖，根莖入藥；其性味辛，苦，溫，有益氣健脾，補(bǔ)腎安神之功效。近年來(lái)的研究表明，刺五加具有多種藥理作用，如抗炎[2]，抗氧化[3]，提高免疫能力[4]，抗疲勞[5]以及抗癌等[6]。

刺五加富含多種活性代謝產(chǎn)物，包括三萜皂苷類(lèi)，多糖類(lèi)，黃酮類(lèi)，酚酸類(lèi)，香豆素，木脂素等小分子化合物，皂苷類(lèi)化合物是刺五加的主要活性成分之一[7]。近年研究表明，刺五加皂苷具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)遷移[8]，促進(jìn)神經(jīng)元樹(shù)突擴(kuò)展活性[9]，影響細(xì)胞因子活性[10]，增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力[11]等多種生理活性，在食品醫(yī)藥等方面有良好的前景。然而，20世紀(jì)80年代初對(duì)刺五加自然資源的過(guò)度開(kāi)采造成了刺五加自然資源的破壞，使刺五加被列為漸危物種[12]；而刺五加皂苷結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，在植物體中含量較低，使通過(guò)植物體分離提取、化學(xué)合成等手段獲取刺五加皂苷相對(duì)困難，進(jìn)而限制其應(yīng)用。因此通過(guò)生物學(xué)與生物信息學(xué)手段，研究刺五加三萜皂苷生物合成路線(xiàn)，利用合成生物學(xué)方法獲得三萜皂苷對(duì)解決刺五加皂苷來(lái)源問(wèn)題具有重要意義。

刺五加中具有多種五環(huán)三萜皂苷，根據(jù)糖苷配基的類(lèi)型，可以分為齊墩果烷型（oleanane），去甲齊墩果烷型（noroleanane），羽扇豆烷型（lupine）和3,4-半開(kāi)環(huán)羽扇豆烷型（3,4-secolupane）等不同類(lèi)型，其中齊墩果烷型和去甲齊墩果烷型的變體最多[13]。在植物體中三萜皂苷的前體來(lái)源于甲羥戊酸（MVA）途徑和2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸（MEP）途徑，以同為五加科的人參為例：異戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）在香葉基焦磷酸合酶（GPS）的作用下縮合成香葉基焦磷酸（GPP），GPP 在法尼基焦磷酸合酶（FPS）的作用下與IPP 聚合成法尼基焦磷酸（FPP），兩個(gè)FPP 經(jīng)鯊烯合成酶（SS）縮合形成角鯊烯，角鯊烯在鯊烯氧化酶作用下環(huán)氧化為2,3-氧化鯊烯[14]。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶（HMGR）是MVA 萜類(lèi)合成途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶，在刺五加萜類(lèi)物質(zhì)的生物合成過(guò)程中起到重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)截短的HMGR（tHMGR）基因在植物中過(guò)量表達(dá)時(shí)，萜類(lèi)次生物質(zhì)代謝反應(yīng)產(chǎn)物的含量明顯高于對(duì)照植株。因此，在植物中過(guò)量表達(dá)tHMGR成為生產(chǎn)倍半萜和三萜類(lèi)物質(zhì)的普遍適用的方法[15]。氧化鯊烯環(huán)化酶（oxidosqualene cyclase,OSC）是一個(gè)基因超家族，具有DCTAE 和QW 等保守序列，包含β-香樹(shù)素合酶（β-Amyrin Synthase）、達(dá)瑪烷二醇合酶（Dammarenediol Synthase）、環(huán)阿屯醇合酶（Cycloartenol Synthase）、羽扇豆醇合酶（Lupeol Synthase）、羊毛甾醇合酶（Lanosterol Synthase）等類(lèi)型[16]。氧化鯊烯環(huán)化酶可催化2,3-氧化鯊烯經(jīng)質(zhì)子化、環(huán)化、重排、去質(zhì)子化完成環(huán)化作用，生成三萜皂苷的前體。其中，齊墩果烷型三萜皂苷的生物合成是由β-香樹(shù)素合酶參與完成的，2,3-氧化鯊烯經(jīng)過(guò)β-香樹(shù)素合酶作用以“椅-椅-椅”式環(huán)化生成β-香樹(shù)素；CYP716A與CPR1家族基因發(fā)生連續(xù)氧化生成齊墩果酸;最后經(jīng)過(guò)細(xì)胞色素P450 酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的修飾生成多種多樣的三萜皂苷。目前包括人參、三七、越南人參在內(nèi)的許多五加科植物中參與三萜皂苷環(huán)化和修飾的酶已經(jīng)被鑒定[17-20]，而刺五加中的三萜環(huán)化酶還沒(méi)有被鑒定。本研究通過(guò)對(duì)刺五加基因組中潛在OSC進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，表達(dá)定量及功能驗(yàn)證，挖掘了一個(gè)刺五加三萜環(huán)化酶EsOSC5，為刺五加皂苷生物合成通路的研究提供了重要支持和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

刺五加種植于東北林業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田，于2021 年6月采集根、葉、一年生內(nèi)莖、一年生外莖、二年生內(nèi)莖等作為實(shí)驗(yàn)材料。本氏煙草（Nicotiana benthamiana）用于基因瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

RNA 提取試劑TRIzol Reagent（康為試劑生物公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA 生物技術(shù)公司）、2×Rapid Taq Master Mix 高保真酶、膠回收試劑盒（OMEGA 公司）、ClonExpress ⅡOne Step Cloning Kit重組酶（Vazyme 生物公司）、質(zhì)粒提取試劑盒（OMEGA公司）、農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞（GV3101）、pEAQ 植物表達(dá)載體（實(shí)驗(yàn)室保存菌種）、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒2*SYBR qPCR Master Mix（悠揚(yáng)生物科技公司）。

PCR 儀（Eppendorf AG 22331 Hambury），分光光度計(jì)（V-1200 SPECTROPHOTOMETER），冷凍干燥機(jī)（SCIENTZ-10N，購(gòu)于寧波新芝生物科技股份有限公司），Roche LC480熒光定量PCR儀。

1.3 刺五加EsOSC5基因的克隆及生物信息學(xué)分析

從PFAM 34.0下載OSCNC 端種子序列stockholm格式的比對(duì)結(jié)果（PF13243, PF13249），用于搜索OSC基因序列。通過(guò)HMMER 2.3.2 軟件包的hummbuild腳本（默認(rèn)參數(shù)）對(duì)種子序列建立HMM 模型，通過(guò)hmmsearch 腳本（默認(rèn)參數(shù)）對(duì)預(yù)測(cè)的刺五加蛋白序列執(zhí)行搜索，發(fā)現(xiàn)潛在OSC序列，并設(shè)計(jì)引物EsOSC5-F/R（表1）對(duì)EsOSC5基因進(jìn)行克隆。以刺五加根的cDNA 為模板，使用2*Rapid Taq Master Mix 高保真酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，體系為：95℃5 min;95℃15 s,58℃30 s,72℃1 min,32 個(gè)循環(huán)；72℃5 min；4℃保存。膠回收后與T5 載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序。使用MEGAX 軟件來(lái)構(gòu)建EsOSC基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，在NCBI 中查找人參（Panax ginseng），胡蘿卜（Daucus carota）具有不同功能的OSC基因，將刺五加假定EsOSC（EsOSC5）基因與人參，胡蘿卜的已知OSC基因進(jìn)行Align，Bootstrap 值設(shè)為1000，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

使用在線(xiàn)軟件SWISS-MODEL (expasy.org)對(duì)EsOSC5 進(jìn)行同源建模，通過(guò)AutoDock 對(duì)蛋白質(zhì)EsOSC5 和小分子2,3-氧化鯊烯進(jìn)行分子對(duì)接，使用PyMOL進(jìn)行可視化。

通過(guò)在線(xiàn)軟件ExPASy - ProtParam tool 計(jì)算EsOSC5 的各種物理或化學(xué)參數(shù)，包括分子量、等電點(diǎn)、原子組成、不穩(wěn)定性指數(shù)和疏水性。

使用MEGAX 對(duì)刺五加EsOSC5、人參PgOSC、擬南芥AtOSC 蛋白序列進(jìn)行clustw 多序列比對(duì)，MEGAX clustw默認(rèn)參數(shù)，ESPript可視化。

使用kallisto 0.46.2在默認(rèn)參數(shù)下對(duì)預(yù)測(cè)的EsOSC定量，通過(guò)prism8.0 分析其組織特異性。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，設(shè)計(jì)引物qEsOSC5-F/R，內(nèi)參基因actin-F/R（表1）。

1.4 刺五加EsOSC5基因表達(dá)載體的構(gòu)建及瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)

采用Gateway 的方法經(jīng)過(guò)BP 反應(yīng)將刺五加EsOSC5基因連接在pDONR-207 載體上，引物設(shè)計(jì)為attB-EsOSC5-F/R（表1）。將BP 反應(yīng)的質(zhì)粒通過(guò)LR反應(yīng)連入pEAQ 載體，挑取陽(yáng)性單克隆測(cè)序。本實(shí)驗(yàn)將燕麥（Avena sativa）中的HMGR（AstHMGR）基因截短后導(dǎo)入pEAQ 載體，以AstHMGR基因過(guò)表達(dá)煙草作為對(duì)照組，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pEAQ-EsOSC5、pEAQ-tHMGR分別轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101 中搖菌培養(yǎng)，待兩者菌液OD600值為0.2 時(shí)，6000 rpm 離心5 min集菌。使用Argomix 接種緩沖液（10 mM MgCl2,10 mM MES(pH=5.6),150 μM 乙酰丁香酮）分別對(duì)收集到的pEAQ-EsOSC5、pEAQ-tHMGR菌液重懸，將此兩種懸浮菌液暗培養(yǎng)2 h 后注射于生長(zhǎng)1 個(gè)月的本氏煙草葉片下表皮中，處理組及對(duì)照組均設(shè)置三個(gè)重復(fù)。

1.5 刺五加EsOSC5基因瞬時(shí)表達(dá)煙草代謝產(chǎn)物的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)菌液懸浮液侵染煙草并收集其代謝產(chǎn)物。pEAQ-EsOSC5、pEAQ-tHMGR菌液侵染煙草5-7 天之后，分別收集注射過(guò)的煙草葉片，通過(guò)GCQQQ-MS 儀器（Thermo Fisher Trace 1310ISQ，美國(guó)）測(cè)定次生代謝產(chǎn)物的成分及含量。將收集到的煙草葉片凍干、研磨之后分別稱(chēng)取10 mg粉末，加皂化劑1 mL（無(wú)水乙醇90%，超純水10%，氫氧化鉀10%，以1 mg·mL-1糞醇溶于DMSO作為內(nèi)標(biāo)：10 μL·mL-1），75℃皂化1 h后打開(kāi)管蓋，繼續(xù)75℃加熱至乙醇蒸發(fā)。向干燥的樣品中加入500 μL 色譜級(jí)乙酸乙酯，并渦旋振蕩，其后加入500 μL超純水再次渦旋振蕩。離心1 min使溶液分層（上層液體為黃色，下層液體為綠色）。取50 μL上層液（乙酸乙酯層）移至進(jìn)樣小瓶襯管中，旋干后重懸于50 μL 衍生化試劑TMA 咪唑（tri-Sil Z）中，70℃加熱30 min，使用GC-QQQ-MS儀器檢測(cè)代謝物。

色譜條件：色譜柱為ZB-5 HT（0.25 mm×30 m，Thermo Fisher scientific），載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL·min-1，進(jìn)樣口溫度280℃，進(jìn)樣量為1 μL，分流比為20:1。程序升溫：起始溫度為170℃，5℃·min-1升溫至290℃，保持4 min，25℃·min-1升溫至340℃。質(zhì)譜條件：電子能量為70 eV，質(zhì)量掃描范圍60-800。以β-香樹(shù)脂醇（β-amyrin）為標(biāo)準(zhǔn)品，外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果

2.1 刺五加EsOSC5基因的克隆及生物信息學(xué)分析

測(cè)序結(jié)果表明，獲得的刺五加EsOSC5（NCBI 登錄號(hào)為OM681328）基因CDS 區(qū)最大開(kāi)放閱讀框ORF 全長(zhǎng)為2286 bp，編碼761個(gè)氨基酸，結(jié)果如圖1所示。通過(guò)分析得出蛋白質(zhì)EsOSC5的分子式為C3964H5983N1045O1118S45，分子量為87609.14，原子總數(shù)為12155，等電點(diǎn)為6.10，親水性平均系數(shù)（GRAVY）-0.356，表明該蛋白具有疏水性，不穩(wěn)定指數(shù)為50.83，表明該蛋白是不穩(wěn)定的。

圖1 刺五加EsOSC5基因克隆

由MEGAX 軟件構(gòu)建的刺五加、人參、胡蘿卜的OSC蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明，刺五加EsOSC5蛋白與人參PgBASS2801.2有較高的同源性（圖2），bootstrap 有99.4%的置信度，且二者進(jìn)化程度相近。故刺五加EsOSC5蛋白可能與人參PgBASS2801.2有相似的功能，均為β-amyrin synthase。

圖2 刺五加EsOSC5與人參，胡蘿卜OSC的系統(tǒng)進(jìn)化分析

本實(shí)驗(yàn)對(duì)EsOSC5，人參OSC及擬南芥OSC進(jìn)行clustw 多序列比對(duì)，結(jié)果如圖3 所示。DCTAE 基序在OSCs 中高度保守，是角鯊烯環(huán)氧化的起始序列，這個(gè)基序中的酸性羧基殘基Asp釋放質(zhì)子攻擊底物的末端環(huán)氧環(huán)，從而引發(fā)環(huán)形成的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。MWCYCR基序是β- amyrin 合成酶的一個(gè)特征基序，其中，Trp 控制齊墩酰陽(yáng)離子的穩(wěn)定、Tyr 參與五環(huán)三萜的形成。QW基序則參與穩(wěn)定OSC 的結(jié)構(gòu)。SWISS-MODEL 是歐洲瑞士生物信息中心開(kāi)發(fā)的蛋白質(zhì)同源建模程序，提供全自動(dòng)的計(jì)算流程，此類(lèi)同源建模算法首先選定輸入一級(jí)序列的同源蛋白結(jié)構(gòu)，然后以同源蛋白的三維結(jié)構(gòu)為模板利用理論計(jì)算方法進(jìn)行優(yōu)化[21]。本實(shí)驗(yàn)利用SWISS-MODEL 預(yù)測(cè)EsOSC5的蛋白結(jié)構(gòu)，通過(guò)AutoDock 對(duì)蛋白質(zhì)EsOSC5 和小分子2,3-氧化鯊烯進(jìn)行分子對(duì)接（圖4）。

圖3 EsOSC5與人參和擬南芥的β-amyrin synthase的序列比對(duì)

圖4 EsOSC5與2,3-氧化鯊烯分子對(duì)接

根據(jù)刺五加轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)EsOSC5 在不同組織中的表達(dá)水平通過(guò)prism8.0 進(jìn)行分析。由圖5 可知，相較于刺五加葉（LEAF），一年生內(nèi)莖（1N），一年生外莖（1W）以及兩年生內(nèi)莖（2N），EsOSC5 在刺五加根（ROOT）中表達(dá)量明顯提高，且該結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果一致。因此，我們選取刺五加根的cDNA進(jìn)行克隆基因，同時(shí)為后續(xù)代謝組的測(cè)定提供參考。

圖5 刺五加中EsOSC5的組織特異性分析

2.2 刺五加EsOSC5基因瞬時(shí)表達(dá)煙草代謝產(chǎn)物的測(cè)定

經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，分別收集pEAQ-EsOSC5、pEAQ-tHMGR菌液侵染后的煙草葉片，其代謝產(chǎn)物組成及含量通過(guò)GC-QQQ-MS 進(jìn)行測(cè)定分析。結(jié)果顯示處理組（EsOSC5）的代謝物相比于對(duì)照組（tHMGR）產(chǎn)生了新的色譜峰，且與β-香樹(shù)脂醇（β-amyrin）標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間一致，進(jìn)一步對(duì)比二級(jí)質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)兩者為同一種物質(zhì)，即β-amyrin。由此表明，EsOSC5基因可促進(jìn)刺五加β-amyrin（三萜皂苷）的合成積累，即β-amyrin 是由EsOSC5基因調(diào)控產(chǎn)生，該基因?yàn)榇涛寮应?香樹(shù)脂醇合酶基因（圖6）。

圖6 GC/MS總離子流圖譜

3 討論

三萜皂苷是刺五加中一類(lèi)重要的次生代謝產(chǎn)物，其優(yōu)良的生理藥理活性使之有可觀(guān)的醫(yī)用藥用應(yīng)用前景。但因其結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，且在植株中含量較低，使其通過(guò)傳統(tǒng)的化學(xué)提取、合成量產(chǎn)較為困難。解析刺五加三萜皂苷的次生代謝途徑，通過(guò)合成生物學(xué)的方法實(shí)現(xiàn)刺五加三萜皂苷工業(yè)化生成的意義不言而喻。三萜合酶在不同植物品系中的自然變異使從不同植物體中發(fā)現(xiàn)高效的氧化鯊烯環(huán)化酶成為可能，且為三萜生物代謝工程提供了新的活力。本研究挖掘并驗(yàn)證了一個(gè)主要在刺五加根中表達(dá)的催化刺五加中2,3-氧化鯊烯“椅-椅-椅”式環(huán)化形成刺五加三萜皂苷前體的β-香樹(shù)素合酶基因——EsOSC5。Li L A 等研究表明人參β-amyrin synthase 在根中有較高的表達(dá)量，與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符[22]。相較于親緣關(guān)系更遠(yuǎn)的擬南芥β-amyrin synthase，EsOSC5和人參β-amyrin synthase 序列更為相似，他們具有一致的DCTAE 保守序列，和幾乎一致的QW（QXXXGXW）保守序列，區(qū)別只在于于第三個(gè)QW 保守序列發(fā)生L-＞P的突變，它們同屬疏水氨基酸，只有側(cè)鏈上一個(gè)CH2的差異；擬南芥BAS 則與他們有更大的差異，除了每個(gè)QW 和DCTAE都具有一個(gè)以上的位點(diǎn)發(fā)生氨基酸性質(zhì)變異，還存在氨基酸的增添和缺失。盡管如此，與β-amyrin synthase功能密切相關(guān)的473-489基序，特別是纈氨酸是保守的，這個(gè)氨基酸的突變會(huì)引起OSC 酶功能的改變，例如在擬南芥中V484→A484 可能會(huì)引起產(chǎn)物向camelliol C的轉(zhuǎn)化[23-25]。

植物五環(huán)三萜類(lèi)化合物主要通過(guò)甲羥戊酸途徑和戊糖磷酸途徑合成2,3-氧化鯊烯，之后在氧化鯊烯環(huán)化酶OSC 的作用下環(huán)化成不同的三萜骨架，最后在細(xì)胞色素P450（CYP）及糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT）的修飾下形成多種皂苷[26]。目前，本實(shí)驗(yàn)挖掘并鑒定了刺五加β-amyrin synthase 基因EsOSC5，為鑒定刺五加中其他OSC的功能提供了思路，同時(shí)為解析刺五加中三萜皂苷類(lèi)化合物代謝途徑及實(shí)現(xiàn)其生物合成奠定了基礎(chǔ)。刺五加中富含多種三萜皂苷。例如：刺五加葉中齊墩果烷型三萜皂苷acanthopanaxosides A、B、C；3,4-開(kāi)環(huán)- 羽扇豆烷型三萜皂苷 Inermoside，1-Deoxychiisanoside， 24-Hydroxychiisanoside， 11-deoxyisochiisanoside；羽 扇 豆 烷 型 三 萜 皂 苷Chiisanoside 和Daucosterol[27-29]。然而，我們對(duì)于參與刺五加三萜皂苷生物合成的細(xì)胞色素P450 及糖基轉(zhuǎn)移酶尚不明確。相對(duì)于參與三萜皂苷次生代謝的CYP和UGT，OSC有著更為保守的序列及相對(duì)較小的家族分歧，這使得挖掘具有功能的OSC相較于CYP、UGT更為容易。而鑒定已知功能的OSC，有助于進(jìn)一步挖掘參與同一通路的CYP和UGT；一方面，協(xié)同行使代謝功能的不同基因，其表達(dá)水平可能存在連鎖；另一方面，這些功能基因可能在進(jìn)化的某一時(shí)期聚集，形成生物合成基因簇（BGCs），或者因易位、倍增、丟失等事件而分離，這將在近緣物種的染色體共線(xiàn)性分析中顯示，有助于挖掘相關(guān)的功能基因，描述潛在的進(jìn)化事件。接下來(lái)的工作將結(jié)合這些內(nèi)容，繼續(xù)挖掘刺五加三萜皂苷生物合成通路中的其他OSC基因及其下游基因CYP和UGT，解析刺五加三萜皂苷代謝途徑并實(shí)現(xiàn)其生物合成。