王文斌，朱海蘭，莫 靜，劉 迪，胡志剛＊＊，汪 波

（1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 武漢 430065；2. 湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院 武漢 430075；3. 湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 武漢 430062）

1 引言

從廣義上說(shuō)，重金屬是指金屬密度大于5g/cm3的金屬[1]。按照這個(gè)定義，有53 種天然存在的金屬屬于重金屬。重金屬在高濃度下對(duì)植物均有毒害，但其中一些，例如鋅（Zn）、鐵（Fe）和銅（Cu）等，在低濃度時(shí)是必要的營(yíng)養(yǎng)素，而其他一些，例如鎘（Cd）、鉻（Cr）和鉛（Pb），即使在極低的濃度下也會(huì)對(duì)植物造成危害。那些在低濃度下對(duì)植物表現(xiàn)出毒性的重金屬通常被稱為重金屬[2]。鎘被認(rèn)為是對(duì)人體健康最危險(xiǎn)的重金屬元素之一。人體攝入鎘過(guò)量會(huì)導(dǎo)致以腎小管病變?yōu)橹鞯哪I臟損害、以肺炎和肺水腫等為代表的呼吸系統(tǒng)損傷，造成骨骼疏松、萎縮、甚至斷裂等，嚴(yán)重危害人類健康。鎘不是植物生長(zhǎng)的必需元素[3]，對(duì)植物也有很強(qiáng)的毒害作用，鎘大量積累會(huì)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致植物葉片黃化枯敗、株高降低等現(xiàn)象，甚至使植物死亡[4-5]。植物在進(jìn)化過(guò)程中，已經(jīng)發(fā)展出了獨(dú)特的方法來(lái)獲取必需的營(yíng)養(yǎng)元素，抑制或富集土壤中的有毒金屬元素[6]。對(duì)重金屬在植物中累積途徑的深入了解將對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育研究和人類健康具有重要意義，而金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的克隆則是關(guān)鍵的第一步。

在植物吸收金屬后，金屬離子與載體蛋白結(jié)合形成螯合物進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)[7-8]。植物重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、重金屬ATP 酶、自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白等，其中大量研究表明自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白可以特異性轉(zhuǎn)運(yùn)鎘和錳[9]。NRAMP 家族蛋白是一類高度保守膜蛋白，在細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物體內(nèi)都廣泛存在。NRAMP 蛋白在不同物種間表現(xiàn)出功能差異和特異性表達(dá)。MmNRAMP1 最早在小鼠身上被發(fā)現(xiàn)，它主要通過(guò)對(duì)金屬離子吸收而調(diào)節(jié)對(duì)分枝桿菌的吞噬作用[10]。而植物中普遍存在多個(gè)NRAMP家族基因，模式植物擬南芥的NRAMP家族成員有6 個(gè)，水稻中有7 個(gè)，煙草有9 個(gè)。Bozzi 等[11]發(fā)現(xiàn)，NRAMP能夠結(jié)合或運(yùn)輸生物所需的二價(jià)金屬（Mn2+，F(xiàn)e2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+）和有毒金屬（Cd2+，Pb2+，和Hg2+），但不能運(yùn)輸二價(jià)堿土金屬離子（Mg2+和Ca2+）。超積累型東南景天有6個(gè)NRAMP家族基因，具有重金屬離子吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)功能[12-13]。如蘋(píng)果MhNRAMP1基因能夠在根部轉(zhuǎn)運(yùn)鎘離子，并抑制了抗細(xì)胞死亡相關(guān)基因的表達(dá)[14-15]。大豆GmNRAMP1可能參與鎘離子吸收轉(zhuǎn)運(yùn)[16]。萊茵衣藻NRAMP3的表達(dá)可能具有減少萊茵衣藻細(xì)胞內(nèi)Cd 的積累的作用[17]。超積累型東南景天受到鎘脅迫時(shí)，SaNRAMP6基因葉片表達(dá)量下降，根系表達(dá)量顯著增加，表明SaNRAMP6可能直接參與鎘的吸收 和 轉(zhuǎn) 運(yùn) 過(guò) 程[18]。 Cailliatte 等[12]認(rèn) 為 擬 南 芥AtNRAMP6是一種細(xì)胞內(nèi)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體，主要作用于液泡內(nèi)膜，并能影響鎘在細(xì)胞中的分布和可利用性。辣椒NRAMP1和NRAMP3基因主要參與Cd 從根部轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部的過(guò)程，NRAMP2、NRAMP5、NRAMP6基因參與辣椒根對(duì)Cd的吸收過(guò)程[19]。

黃連為湖北省“一縣一品”的道地藥材，湖北省利川市及周邊地區(qū)是黃連的道地產(chǎn)區(qū)，在我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥中具有悠久的使用歷史，最早可追溯到我國(guó)已知現(xiàn)存最早的本草著作《神農(nóng)本草經(jīng)》。黃連作為我國(guó)著名的傳統(tǒng)中藥，不僅在臨床上大量使用，還出口到國(guó)外，使其需求量大大增加。但是，黃連對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求嚴(yán)格，生長(zhǎng)期長(zhǎng)，導(dǎo)致黃連市場(chǎng)供需矛盾加劇，野生黃連被過(guò)度采挖逐漸變成三級(jí)瀕危植物，現(xiàn)市場(chǎng)上使用的主要是人工種植黃連。目前栽培黃連主產(chǎn)地為重慶石柱縣、湖北利川市，以及四川、湖南等地也有種植。而近年來(lái)黃連藥材出口檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)部分重金屬超標(biāo)，特別是鎘超標(biāo)，嚴(yán)重影響黃連產(chǎn)業(yè)發(fā)展[20]。對(duì)擬南芥、水稻等模式植物的研究結(jié)果表明，NRAMP 蛋白家族在植物對(duì)鎘的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)中起著重要作用。

2 研究思路與方法

本文旨在克隆分析黃連NRAMP基因特性，探討黃連Cd 吸收轉(zhuǎn)運(yùn)分子機(jī)制。以黃連基因組[21]測(cè)序結(jié)果為基礎(chǔ)，通過(guò)比對(duì)篩選出與擬南芥NRAMP基因同源性較高的黃連NRAMP5基因，通過(guò)PCR 技術(shù)克隆該基因的開(kāi)放讀碼框，并通過(guò)生物信息學(xué)分析黃連NRAMP5蛋白的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等（圖1），對(duì)基因功能以及編碼蛋白的性質(zhì)作出初步的判斷和預(yù)測(cè)，為研究黃連體內(nèi)重金屬鎘轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以及基因的功能作用提供參考依據(jù)，以期為后續(xù)的CcNRAMP5基因表達(dá)分析和功能驗(yàn)證研究提供基礎(chǔ)。

圖1 技術(shù)路線圖

3 研究與分析

3.1 材料、試劑與儀器

3.1.1 材料

黃連植株采自湖北省神農(nóng)架林區(qū)，種植于湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院分子生物實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)DNA條形碼鑒定為毛茛科植物味連（Coptis chinensis）。實(shí)驗(yàn)材料系實(shí)驗(yàn)室水培培養(yǎng)3周長(zhǎng)勢(shì)良好的黃連葉片。

3.1.2 試劑

pEASY?-Blunt 克隆載體和Trans1-T1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司。HLingene 瓊脂糖凝膠回收/PCR 產(chǎn)物純化試劑盒和Thermo Fisher cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于上?；萘枭锛夹g(shù)有限公司。IPTG 溶液（50 mg·mL-1）、X-Gal 溶液（20 mg·mL-1）、Amp 溶液（100 mg·mL-1）購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司。高效率PCR 酶KOD Dash 購(gòu)于東洋紡（上海）生物科技有限公司。植物總RNA 提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司。引物合成及測(cè)序由武漢天一華煜基因科技有限公司完成。

3.1.3 儀器

冷凍高速離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific）；Nano drop-2000 超微量分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific）；T100 型PCR 擴(kuò)增儀（美 國(guó)Bio-Rad）；GGI54TW 蒸汽消毒鍋（美國(guó)ZEALWAY 公司）；BCD-225TMPM 冰箱（海爾）；MX-RL-E 旋轉(zhuǎn)混懸儀（北京大龍興創(chuàng)）；DYY-10C 電泳儀（北京六一）；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）；LWB-26 雙列六孔電熱恒溫水浴鍋（上海龍躍）；UF55 干燥箱（德國(guó)Memmert 美墨爾特）；2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL 移液器（eppendorf，德國(guó)艾本德股份公司）等分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器等。

3.2 方法

3.2.1 目的基因的獲得

以擬南芥、水稻、東南景天等有文獻(xiàn)報(bào)道的NRAMP 蛋白序列為參考序列，比對(duì)黃連基因組，通過(guò)blastp比對(duì)尋找黃連NRAMP家族基因（e值≤e-10），并且將它們?cè)赑fam 蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pfam.xfam.org/search）中進(jìn)行檢驗(yàn)以確保其包含NRAMP 保守結(jié)構(gòu)域（PF01566），得到黃連NRAMP5基因。

3.2.2 總RNA的提取、檢測(cè)及cDNA的合成

黃連葉片用清水沖洗洗凈，濾紙吸干，并用液氮研磨成粉末，使用天根植物總RNA提取試劑盒提取總RNA。使用瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計(jì)檢測(cè)提取的RNA 質(zhì)量和濃度。然后以提取的總RNA 為模板，采用試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，50℃水浴20 min，85℃水浴10 min，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，儲(chǔ)存在-20℃。

3.2.3 黃連NRAMP5基因的克隆

依據(jù)已測(cè)得的黃連基因組數(shù)據(jù)，查找該基因上下游2000 bp 長(zhǎng)度，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物（上游引物L(fēng)F:AAGGAGGAGTGCATCCATTG，LR: CTGCATCTTTGG GTGTCAT；下游引物RF: ATGCAGTGATCTTACTCTC AATTCGGC, RR: TGTGGCAATGTGTGATTGTG）將目的序列片段擴(kuò)增，以確定黃連NRAMP5基因編碼序列。根據(jù)獲得的黃連NRAMP5基因序列，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物NRAMP-5F：5’-ATGGAAAGTGAAAATAC CCAAAAGG-3’，NRAMP-5R：5’-CTATTTATTCTGA TGTGTCATTTCAGC-3’。以反轉(zhuǎn)錄得到的黃連葉片cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得NRAMP5的完整編碼序列。PCR 反應(yīng)體系為：1μL KOD Dash，5μL 10 ×Buffer for KOD Dash，5μL 2 mM dNTPs，3μL cDNA，34μL ddH2O，1μL Forward Primer（10μmol·L-1），1μL Reverse Primer（10μmol·L-1），共50μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5 min；95℃30 s，62℃30 s，74℃1 min 30 s，反應(yīng)進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；74℃10 min。

PCR 產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后，純化產(chǎn)物與pEASYBlunt 克隆載體連接并轉(zhuǎn)化至Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑選陽(yáng)性克隆經(jīng)菌液PCR 驗(yàn)證長(zhǎng)度無(wú)誤后送武漢天一華煜基因科技有限公司測(cè)序。

3.2.4 黃連NRAMP5基因的生物信息學(xué)分析

序列組裝完成后，利用TBtools 軟件[22]查找黃連NRAMP5基因的開(kāi)放閱讀框并翻譯成氨基酸序列，在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)氨基酸序列進(jìn)行Blastp 比對(duì)；利用ExPASy 在線軟件分析NRAMP5編碼氨基酸序列的組成和理化性質(zhì)；利用ProtScale 在線工具進(jìn)行蛋白疏水性分析；利用SignalP 進(jìn)行蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)；利用ProtComp 在線軟件對(duì)NRAMP5的氨基酸序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位；利用TMHMM 通過(guò)隱馬爾可夫模型來(lái)預(yù)測(cè)蛋白跨膜區(qū)域判斷其是否為跨膜蛋白；利用SPOMA分析NRAMP5的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)并進(jìn)行預(yù)測(cè)，以了解局部空間結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL 預(yù)測(cè)CcNRAMP5蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)；使用MEGA 6.05 軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，采用Neighbor-Joining 法構(gòu)建蛋白質(zhì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap 統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)次數(shù)為500，其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)。

3.3 結(jié)果

3.3.1 黃連RNA的提取和黃連NRAMP5基因的克隆

根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，從黃連葉片中提取總RNA，選取凝膠電泳條帶清晰、吸光度與濃度均滿足實(shí)驗(yàn)要求的RNA 作為模板RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 樣品合成cDNA第一條鏈。

以黃連葉片cDNA 為模板，針對(duì)NRAMP5基因設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增了約1500 bp 的PCR 產(chǎn)物，與預(yù)期大小一致。將該片段切膠回收后與pEASY- Blunt 載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，PCR 鑒定為陽(yáng)性克隆的菌液進(jìn)行測(cè)序，最后將序列提交至GenBank，基因登錄號(hào)為KAF9609000.1。

用CodonCode Aligner 軟件拼接測(cè)序結(jié)果的峰圖，得到1611 bp 的cDNA 序列，經(jīng)TBtools 軟件分析發(fā)現(xiàn)其為一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框，共編碼536 個(gè)氨基酸。通過(guò)NCBI blastp 將該氨基酸序列與NR 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，與GenBank 已報(bào)道的其他植物的NRAMP5基因具有較高的相似性，將該基因命名為CcNRAMP5。利用Pfam 分析氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)CcNRAMP5 蛋白的第63-425 位氨基酸殘基是典型的NRAMP結(jié)構(gòu)域（PF01566），同時(shí)在第279-282 氨基酸殘基處有一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)（Nglycosylation site），屬于NRAMP超家族。

3.3.2CcNRAMP5基因編碼蛋白的序列分析

（1） 理化特性分析

利用ExPASy 數(shù)據(jù)庫(kù)的ProtParam 工具分析CcNRAMP5基因轉(zhuǎn)化的蛋白序列，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)的分子量為58.19 kD，等電點(diǎn)為7.62，帶負(fù)電荷的殘基（Asp+Glu）為37，帶正電荷的殘基（Arg+Lys）為38，含有20種氨基酸，亮氨酸含量最高，占比14%，色氨酸含量最低，占比1.3%，分子式為C2683H4257N667O729S21。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為33.7，屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

使用EXPASY 的Protscale 在線工具預(yù)測(cè)NRAMP5蛋白的親水性和疏水性（圖2），發(fā)現(xiàn)在第35 個(gè)氨基酸位置，最低峰值是-3.022，在第184 個(gè)氨基酸位置，最高峰值是3.711，平均親水性為0.574，這表明該蛋白是疏水性蛋白。

圖2 CcNRAMP5蛋白的親疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果

（2） CcNRAMP5 蛋白信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

SignalP-5.0 Server軟件分析結(jié)果顯示，含有Sec信號(hào)肽（Sec/SPI）的可能性為0.0016，不含有信號(hào)肽（Other）的可能性為0.9984，預(yù)測(cè)CcNRAMP5蛋白不含信號(hào)肽序列，不屬于分泌型蛋白。使用ProtComp 9.0 對(duì)CcNRAMP5的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果表明CcNRAMP5 蛋白質(zhì)定位于質(zhì)膜。利用TMHMM Server v. 2.0 預(yù)測(cè)CcNRAMP5 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane domain，TMD），對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基區(qū)域分別為78-110、121-143、147-169、178-200、220-242、263-285、323-345、365-387、391-413、426-448、463-485。結(jié)果表明，CcNRAMP5 蛋白含有11 個(gè)跨膜區(qū)域，具有膜蛋白的重要特征（圖3）。

圖3 黃連NRAMP5蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析

（3） CcNRAMP5蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

經(jīng)PRABI 網(wǎng)站的SOPMA 程序?qū)cNRAMP5 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)CcNRAMP5 蛋白主要由α 螺旋（a helix）、延伸鏈（Extended strand）、β 轉(zhuǎn)角（Beta turn）和無(wú)規(guī)則卷曲（Random coi）四部分結(jié)構(gòu)組成，分別占比47.57%、13.99%、2.99%和35.45%。α-螺旋與無(wú)規(guī)則卷曲是多肽鏈的主要結(jié)構(gòu)元件。

（4） 三維建模

三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析顯示（圖4），CcNRAMP5 蛋白與葡萄球菌錳轉(zhuǎn)運(yùn)突變體MntH 的晶體結(jié)構(gòu)（二價(jià)金屬陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體MntH）具有37%的序列相似性，以該蛋白（SMTL ID：5m8k.1.A）為模板，通過(guò)同源建模構(gòu)建CcNRAMP5 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，用于建模的氨基酸殘基范圍為36-493位，占編碼氨基酸總數(shù)的85.26%。

圖4 黃連NRAMP5蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

3.3.3 多序列比對(duì)分析

為研究黃連CcNRAMP5 蛋白在物種中的進(jìn)化位置和親緣關(guān)系，利用MEGA 6.05對(duì)水稻（Oryza sativa）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、歐洲油菜（Brassica napus）、波蘭小麥（Triticum polonicum）、可可（Theobroma cacao）、大麥（Hordeum vulgare）等植物的NRAMP5蛋白序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析比較（圖5）。結(jié)果表明，黃連CcNRAMP5與同為毛茛目的博落回McNRAMP5（Macleaya cordata, accession no.OVA12788.）、罌 粟PsNRAMP5（Papaver somniferum,accession no. XP_026445592.）親緣關(guān)系最近，與桑（Morus alba）、蘋(píng)果（Malus domestica）、可可（Theobromacacao）、香橙（Citrus junos）、甜橙（Citrus sinensis）等聚為一個(gè)大類。水稻與大麥、小麥聚為一支，可能與其均為單子葉植物相關(guān)。

圖5 黃連NRAMP5蛋白的多序列比對(duì)分析

4 討論

黃連屬于毛茛科植物，是現(xiàn)存雙子葉植物的重要基部類群之一，其根莖作為中藥使用已有2000多年的歷史，不但是中醫(yī)處方最常用品種，也是中成藥的重要原料。據(jù)《全國(guó)中成藥品種目錄》統(tǒng)計(jì)，以黃連作原料制生產(chǎn)的中成藥有黃連上清片、香連丸等108 種之多[23]。黃文麗等人[24]利用ICP-MS、細(xì)胞分餾、連續(xù)萃取等方法分析鎘在黃連中的分布及化學(xué)形態(tài)，發(fā)現(xiàn)黃連中Cd 的累積分布為：根＞莖＞葉＞子實(shí)，大部分富集在根部，少量遷移到地上部，且Cd主要積累在周皮、皮層、髓和根際維管束中，外周皮和皮層中Cd含量較高，髓和根際維管束中Cd含量較低，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)在黃連中Ca 與Cd 的時(shí)空分布位置相似，認(rèn)為Ca2+通道是Cd 進(jìn)入植物的一條途徑，對(duì)二價(jià)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的挖掘研究對(duì)解析其重金屬鎘富集機(jī)制，對(duì)推動(dòng)其無(wú)公害種植具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

NRAMP 家族基因在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，廣泛分布于哺乳動(dòng)物、酵母和高等植物中，并參與了金屬轉(zhuǎn)運(yùn)和抗微生物感染等多種過(guò)程。到目前為止，該家族的幾個(gè)成員已經(jīng)從擬南芥、水稻和番茄中分離出來(lái)。在本研究中，從黃連中克隆獲得可能參與鎘吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的NRAMP基因CcNRAMP5，并以此為基礎(chǔ)對(duì)其基本理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位以及結(jié)構(gòu)組成等方面進(jìn)行了分析。CcNRAMP5 蛋白具有11 個(gè)跨膜區(qū)，在第279-282 位氨基酸殘基處存在一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，含有一個(gè)NRAMP 特征結(jié)構(gòu)域，亞細(xì)胞定位在質(zhì)膜上，這符合NRAMP 蛋白的重要特征。序列相似性比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，黃連CcNRAMP5 蛋白與博落回、罌粟等植物的NRAMP5 蛋白親緣關(guān)系最近，序列相似性高，同時(shí)推測(cè)CcNRAMP5 蛋白可能與這些蛋白具有相似功能。

在水稻中，OsNRAMP5表達(dá)于質(zhì)膜中，參與水稻錳、鐵、鎘的轉(zhuǎn)運(yùn)，在水稻根表皮、外皮層、皮層外層以及木質(zhì)部周圍組織中均有表達(dá)[25-27]。大麥HvNramp5定位在質(zhì)膜上，是鎘和錳的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體[28]。擬南芥AtNRAMP3和AtNRAMP5位于液泡膜上，在擬南芥的根和葉中均有表達(dá)，作為鎘轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，他們參與鎘離子向細(xì)胞質(zhì)的外排，起重金屬解毒作用[29]。波蘭小麥TpNRAMP5可以運(yùn)輸Cd、Co、Mn，但對(duì)鐵和鋅含量沒(méi)有影響[30]。煙草中NRAMP基因在生物脅迫響應(yīng)和次生代謝途徑中具有特異性?？煽芍蠺cNRAMP3和TcNRAMP5可以轉(zhuǎn)運(yùn)生長(zhǎng)必需的二價(jià)金屬陽(yáng)離子（Fe、Mn）和Cd2+，敲除TcNRAMP5有望獲得低Cd 品種可可[31]。這說(shuō)明NRAMP家族基因在維持植物體對(duì)金屬的吸收和運(yùn)輸中起重要作用，尤其是對(duì)二價(jià)金屬離子，如Fe、Mn、Zn、Cu 和Cd。CcNRAMP5 是第一個(gè)從黃連植物中分離出來(lái)的NRAMP 金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員，與桑（Morus alba）[32]、蘋(píng)果（Malus domestica）[15]、可可（Theobroma cacao）、香橙（Citrus junos）[33]親緣關(guān)系較近，可能與黃連植物體內(nèi)包括Cd在內(nèi)的二價(jià)金屬離子的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，其機(jī)制和功能在進(jìn)一步的功能驗(yàn)證工作中將進(jìn)行探討。

5 結(jié)論

綜上所述，本次研究首次通過(guò)TA 克隆得到黃連NRAMP5基因，并運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征等進(jìn)行了分析預(yù)測(cè)，綜合前人研究結(jié)果，筆者推測(cè)黃連NRAMP5基因可能在黃連Cd 的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程發(fā)揮重要作用。