楊麗萍 ， 馮德強(qiáng) ， 王艷妮 ， 段小花

(云南中醫(yī)藥大學(xué) 云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 云南 昆明 650500)

腎葉山螞蝗[Desmodiumrenifolium(L.) Schindl.]是云南省西雙版納州傣族人民常用的植物藥之一，其主要功能為清熱解毒、止咳化痰、通氣止痛、利水退黃，主治熱季感冒頭痛、咽喉腫痛、咳嗽喘息、體弱多病、性冷淡等[1-2]。云南傣族民間醫(yī)生長(zhǎng)期運(yùn)用腎葉山螞蝗泡酒治療腎虛證，并取得了很好的療效，但對(duì)于其在治療腎虛方面相關(guān)的藥效藥理研究尚未見報(bào)道。中醫(yī)理論認(rèn)為腎為“先天之本”“生命之源”，中醫(yī)學(xué)對(duì)男子性功能障礙主要責(zé)之于腎、心、肝三臟，且主要在于腎臟，采用補(bǔ)腎壯陽(yáng)的藥物治療性功能障礙，是中醫(yī)常用之法。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)功效的中藥可通過性激素、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等方面發(fā)揮其改善性功能的效應(yīng)[3]。因此，本試驗(yàn)通過研究腎葉山螞蝗對(duì)雄性大鼠性行為和性激素的影響，初步探討其補(bǔ)腎壯陽(yáng)的藥效及作用機(jī)制，為其進(jìn)一步的應(yīng)用開發(fā)以及民間流傳的科學(xué)與否提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，體重(200±20)g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK(川)2013-24，飼養(yǎng)在明暗交替，室溫18～22 ℃，相對(duì)濕度40%～65%的環(huán)境中，自由飲水采食。

1.2 試驗(yàn)儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI公司產(chǎn)品；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、全波長(zhǎng)掃描式多功能酶標(biāo)儀，均為美國(guó)THERMO FISHER公司產(chǎn)品。

1.3 藥材和試劑 龜鹿補(bǔ)腎片，購(gòu)自廣東新寶制藥有限公司；腎葉山螞蝗由云南省高校民族醫(yī)藥現(xiàn)代研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；睪酮酶聯(lián)免疫試劑盒和雌二醇酶聯(lián)免疫試劑盒，均購(gòu)自伊萊瑞特生物科技有限公司。

1.4 藥材提取 腎葉山螞蝗分別采用水提和醇提的方法得到相應(yīng)的提取物。醇提：加8倍量95%乙醇進(jìn)行連續(xù)回流提取，重復(fù)3次，每次 45 min，合并提取液后趁熱抽濾，濾液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮揮干乙醇，即得乙醇提取液，保存?zhèn)溆谩Ｋ幔杭?倍量的冷水浸泡藥材1～2 h，煮沸45 min，過濾；藥渣加5倍量水繼續(xù)煎煮35 min，過濾，再重復(fù)煎煮1次后合并3次濾液濃縮，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 雌性大鼠的準(zhǔn)備 為消除雌性大鼠在進(jìn)行交配試驗(yàn)時(shí)動(dòng)情期不同帶來的影響，進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除，并注射雌激素，具體方法為：雌性大鼠在10%水合氯醛[0.3 mL/(100 g·bw)]麻醉后，背部朝上固定于鼠板上，在大鼠最末肋骨下，腋中線和距脊柱外側(cè)約2 cm交叉處剪除長(zhǎng)毛，切開皮膚和背肌，有乳白色發(fā)亮的脂肪團(tuán)，其中包埋著卵巢。用小鑷子輕夾脂肪團(tuán)，拉出切口外，分離脂肪，即見粉紅色卵巢，取一絲線將卵巢下輸卵管及脂肪一并結(jié)扎，剪下卵巢，將子宮角送回腹腔，然后摘取對(duì)側(cè)卵巢，術(shù)后3 d肌注青霉素抗感染，常規(guī)飼養(yǎng)1個(gè)月后進(jìn)行交配試驗(yàn)，試驗(yàn)前48 h皮下注射苯甲酸雌二醇0.2 mg/只，4 h前皮下注射黃體酮0.4 mg/只。

1.6 給藥和分組 性成熟的雄性大鼠隨機(jī)分為空白組、龜鹿補(bǔ)腎片組[0.93 g生藥/(kg·bw)]、腎葉山螞蟥水提高劑量組[13 g生藥/(kg·bw)]、腎葉山螞蟥水提低劑量組[4.05 g生藥/(kg·bw)]、腎葉山螞蟥醇提組[13 g生藥/(kg·bw)]，共5個(gè)組。每組大鼠每天早晚各灌胃1次，連續(xù)28 d，灌胃容積均為1 mL/(100 g·bw)，每日飼料與水正常供給，每周按時(shí)稱量大鼠體重，保證其發(fā)育正常。

1.7 交配試驗(yàn) 試驗(yàn)于晚上7～11時(shí)進(jìn)行，將雄性大鼠單獨(dú)放入籠中5 min，使其適應(yīng)環(huán)境，然后每籠加入1只雌鼠，觀察記錄捕捉潛伏期(自雌鼠投入至雄鼠第1次捕捉雌鼠的時(shí)間)、20 min內(nèi)雄鼠捕捉雌鼠的次數(shù)、交配潛伏期(自雌鼠投入至雄鼠第1次與雌鼠交配的時(shí)間)、20 min內(nèi)交配次數(shù)。

1.8 性激素檢測(cè) 待測(cè)定行為學(xué)指標(biāo)結(jié)束后，雄性大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min，離心15 min后取上清液，-20 ℃分裝保存，按相應(yīng)試劑盒說明書測(cè)定血清睪酮、雌二醇含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)樣本進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，滿足條件者，多組間差異比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有顯著性意義，P<0.01表示差異有非常顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 腎葉山螞蝗對(duì)大鼠性行為的影響 由表1可知，與空白組比較，陽(yáng)性對(duì)照藥龜鹿補(bǔ)腎片能縮短雄性大鼠捕捉潛伏期(P<0.05)，增加捕捉次數(shù)(P<0.05)，縮短交配潛伏期(P<0.05)，明顯增加20 min內(nèi)交配次數(shù)(P<0.01)；腎葉山螞蝗水提高劑量組和醇提組均能縮短雄性大鼠捕捉潛伏期(P<0.05)，增加捕捉次數(shù)(P<0.05)，能明顯縮短交配潛伏期(P<0.05)，增加20 min內(nèi)交配次數(shù)(P<0.05)，水提低劑量組則與空白組大致相似，無顯著效果(P>0.05)。

表1 腎葉山螞蝗對(duì)大鼠性行為的影響Table 1 Effect of Desmodium renifolium (L.) Schindl. on sexual behavior in rats

2.2 腎葉山螞蝗對(duì)大鼠血清睪酮和雌二醇含量的影響 從表2可知，與空白組比較，陽(yáng)性對(duì)照藥龜鹿補(bǔ)腎片可以明顯升高大鼠血清睪酮水平(P<0.01)，降低血清雌二醇的含量(P<0.05)。腎葉山螞蝗醇提組與水提高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照藥有類似的效果，且醇提組對(duì)睪酮和雌二醇的影響差異具有非常顯著性意義(P<0.01)，而水提低劑量組對(duì)二者無顯著影響(P>0.05)。

表2 傣藥腎葉山螞蝗對(duì)雄性大鼠血清睪酮和雌二醇含量的影響Table 2 Effect of Desmodium renifolium (L.) Schindl. on the serum estradiol and testosterone levels in rats

3 討論

腎葉山螞蝗[Desmodiumrenifolium(L.) Schindl.]是豆科山螞蝗屬的矮灌木，主產(chǎn)于云南、海南和臺(tái)灣等地。云南西雙版納的少數(shù)民族長(zhǎng)期用腎葉山螞蝗泡酒服用，顯示出了良好的補(bǔ)腎壯陽(yáng)，改善性功能的功效[4]。研究報(bào)道，腎葉山螞蝗中主要活性成分是以異戊基查爾酮為主的黃酮類化合物，顯示出豐富的藥理活性[5]，但目前對(duì)于性功能方面相關(guān)的藥理研究報(bào)道甚少，基于良好的民間用藥基礎(chǔ)，有必要對(duì)腎葉山螞蝗補(bǔ)腎壯陽(yáng)的藥理作用進(jìn)行深入研究。本試驗(yàn)以雄性大鼠為研究對(duì)象，從性行為和性激素兩方面對(duì)腎葉山螞蝗的補(bǔ)腎壯陽(yáng)功效進(jìn)行初步研究，可以為民族藥廣泛運(yùn)用于臨床提供部分試驗(yàn)依據(jù)，也是研發(fā)補(bǔ)腎壯陽(yáng)藥的有效途徑之一。

性功能是衡量雄性動(dòng)物生殖強(qiáng)弱的主要指標(biāo)[6]。雄性性活動(dòng)受多種因素的影響，如神經(jīng)機(jī)制、體液因素、情緒、年齡、疾病等[7]。雄性大鼠性行為的發(fā)生依賴于雌性大鼠的性誘感，交配試驗(yàn)是觀察大鼠性能力的主要評(píng)價(jià)方法，試驗(yàn)選擇了捕捉潛伏期、捕捉次數(shù)、交配潛伏期和交配次數(shù)作為觀察指標(biāo)，可以反應(yīng)雄性的性反應(yīng)速度和性活動(dòng)能力情況[8]。結(jié)果表明，連續(xù)灌胃28 d后，腎葉山螞蝗能顯著縮短雄性大鼠捕捉潛伏期和交配潛伏期，增加捕捉次數(shù)和交配次數(shù)。雄性的性行為高度依賴于激素，其中包括最主要的睪酮，缺乏睪酮既會(huì)干擾雄性性行為的欲望階段，也會(huì)干擾行為階段[9]。雌二醇是雌激素的成分之一，主要由芳香化酶催化雄激素產(chǎn)生。研究證實(shí)，通過芳香化酶抑制劑的干預(yù)降低雌二醇水平，可以治療男性勃起障礙，而外源性的雌二醇升高會(huì)導(dǎo)致性功能障礙[10]。試驗(yàn)采用龜鹿補(bǔ)腎片作為陽(yáng)性對(duì)照藥，臨床和試驗(yàn)研究表明該藥具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、增強(qiáng)性功能的作用[11-12]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，腎葉山螞蝗可明顯增加正常雄性大鼠睪酮的水平，并明顯降低雌二醇的水平，和龜鹿補(bǔ)腎片具有類似的作用。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，腎葉山螞蝗對(duì)雄性大鼠具有提高性功能、改善性欲的藥理作用，且醇提物是其主要有效部位，這也解釋了當(dāng)?shù)厣贁?shù)民族泡酒服用的原因。試驗(yàn)結(jié)果為腎葉山螞蝗在補(bǔ)腎壯陽(yáng)方面的藥效學(xué)評(píng)價(jià)提供了理論依據(jù)，更深入的作用機(jī)制還需今后進(jìn)一步研究。