屈相玲，駱紅梅，熊成歡，劉明，馮果#（.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，貴陽 55000；.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 55005）

過敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）即變應(yīng)性鼻炎，是鼻炎中最常見的類型，臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的鼻癢、鼻塞、打噴嚏及頭痛等[1]。流行病學(xué)研究表明，AR已經(jīng)對20%～30%的成人和多達40%的兒童的生活質(zhì)量產(chǎn)生了顯著的負面影響，如AR會干擾睡眠，導(dǎo)致患者工作和學(xué)習(xí)表現(xiàn)不佳等[2]。盡管目前已有諸多治療AR的藥物，如鼻用糖皮質(zhì)激素類藥物及抗組胺藥物等，但這些藥物不僅治療效果有限，而且還會導(dǎo)致患者鼻出血、體質(zhì)量增加或心臟毒性等不良反應(yīng)[3-4]。因此，尋找新的安全、可靠、療效佳的治療藥物迫在眉睫。有研究指出，AR主要由外界的過敏性抗原進入鼻黏膜并與相應(yīng)的免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）結(jié)合而引起[5]，其嚴(yán)重程度與IgE水平呈正相關(guān)[6]。研究證實，當(dāng)敏感機體鼻黏膜接觸到過敏原后，B淋巴細胞會迅速合成IgE，在IgE的介導(dǎo)下，肥大細胞脫顆粒釋放出炎癥介質(zhì)，從而誘發(fā)過敏反應(yīng)，因此IgE是AR發(fā)病的關(guān)鍵因素[7]。同時，外周血1型輔助性T細胞（type 1 helper T cells，Th1）和2型輔助性T細胞（type 2 helper T cells，Th2）間的免疫失衡也是AR發(fā)病的原因之一，即Th1和Th2細胞分泌的多種細胞因子相互作用使得Th1/Th2平衡被打破，T淋巴細胞分化失衡，進而導(dǎo)致大量炎癥介質(zhì)（如組胺）被釋放，引發(fā)AR的各類癥狀[8-9]。

復(fù)方魚鵝滴鼻劑是貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院研發(fā)的新型醫(yī)院制劑，主要由魚腥草、鵝不食草、冰片等藥物組成，具有清熱解毒、除濕祛濁、芳香通竅等功效。前期藥理學(xué)研究顯示，復(fù)方魚鵝滴鼻劑具有抗炎、抑菌、解熱鎮(zhèn)痛及抗過敏等藥理作用[10-12]；臨床研究表明，復(fù)方魚鵝滴鼻劑對AR、急慢性鼻炎、鼻竇炎均具有顯著療效[13-14]。因此，本研究以復(fù)方魚鵝滴鼻劑為干預(yù)藥物，以卵清蛋白復(fù)制的AR模型大鼠為研究對象，觀察模型大鼠鼻黏膜組織病理學(xué)改變，并檢測血清中IgE、白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）、IL-13、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平及鼻黏膜組織中TNF-α、IL-2、IL-13蛋白表達水平，從Th1/Th2平衡的角度探討該藥對AR模型大鼠的改善作用，以期為厘清復(fù)方魚鵝滴鼻劑治療AR的作用機制和進一步研究開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有HSZ-HS3型顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠），VG3S025型振蕩器[艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司]，JY200C型電泳儀、JY-SCZ4+型垂直電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），TGL-20M型離心機（長沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司），MK3型全功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

復(fù)方魚鵝滴鼻劑（批號20190712，規(guī)格10 mL/瓶）由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部提供；曲安奈德鼻噴霧劑（陽性對照藥，批號20190825，規(guī)格6 mL/瓶）購自昆明源瑞制藥有限公司；卵清蛋白（批號A8040）及IgE、IL-2、IL-13、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號分別為SEKRT-0132、SEKRT-0216、SEKRT-0365、SEKRT-0402）均購自北京索萊寶科技有限公司；兔源TNF-α、IL-2、IL-13、β-actin抗體（批號分別為13265S、12227S、06274S、4967S）均購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）抗體（批號ZB-2512）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；增強型BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號P0013S）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；磷酸鋁凝膠購自韓國保寧制藥株式會社。

1.3 動物

SPF級健康合格的SD大鼠72只，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2014-0011。

2 方法

2.1 模型的建立

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機取12只作為空白對照組，其余大鼠參照文獻[15-16]采用卵清蛋白致敏法復(fù)制AR模型：將卵清蛋白（0.4 mg/mL）與同體積磷酸鋁凝膠（4 mg/mL）混勻后，每只大鼠腹腔注射1 mL（即每只大鼠腹腔注射0.2 mg卵清蛋白及2 mg磷酸鋁凝膠）致敏，間隔1 d致敏1次，連續(xù)7次。從首次致敏后第15天開始，以2%卵清蛋白溶液雙側(cè)滴鼻激發(fā)過敏反應(yīng)，每鼻孔50 μL，每日1次，連續(xù)7 d?？瞻讓φ战M大鼠予以等量無菌生理鹽水處理。第22天末次鼻腔激發(fā)過敏后30 min內(nèi)采用“量化疊加記分法”對大鼠鼻部癥狀進行評分。按照表1的評分標(biāo)準(zhǔn)，綜合評分≥6分為成功造模。

表1 AR大鼠鼻部癥狀評分標(biāo)準(zhǔn)

2.2 分組及給藥

將造模成功的大鼠隨機分為模型組、曲安奈德組（陽性對照，0.026 mg/kg）和復(fù)方魚鵝滴鼻劑高、中、低劑量組（134.4、67.2、33.6 mg/kg），另設(shè)空白對照組，每組12只，雌雄各半。以上6組大鼠均滴鼻給藥（用移液槍取藥液），給藥劑量為0.1 μL/g，每天2次，連續(xù)給藥14 d；并于每天第2次給藥后1 h，以2%卵清蛋白溶液雙側(cè)滴鼻，每鼻孔20 μL，每天1次，連續(xù)14 d，維持過敏狀態(tài)，空白對照組和模型組大鼠滴鼻等量的無菌生理鹽水，且空白對照組大鼠不用維持過敏狀態(tài)。各給藥組大鼠的給藥劑量依據(jù)如下：成人（體質(zhì)量60 kg）曲安奈德鼻噴霧劑臨床用藥劑量為每天220 μg，換算成大鼠等效劑量約為0.026 mg/kg；成人（體質(zhì)量60 kg）復(fù)方魚鵝滴鼻劑臨床用藥劑量為9.6 mg/kg（以生藥量計），根據(jù)大鼠與人體表面積等效比計算出等效劑量，大鼠高、中、低劑量分別相當(dāng)于人臨床等效劑量的2、1、0.5倍。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 大鼠鼻部癥狀評分 在實驗第36天，于2%卵清蛋白溶液滴鼻后1 h，按照表1的評分標(biāo)準(zhǔn)在30 min內(nèi)對大鼠的擦鼻次數(shù)、噴嚏個數(shù)、鼻腔分泌物和鼻腔炎癥情況進行評分。

2.3.2 大鼠血清中IgE和炎癥因子水平檢測 采用ELISA法進行檢測。評分結(jié)束后，大鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉溶液（10 mL/kg）進行麻醉，取腹主動脈血，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，按照各ELISA試劑盒說明書進行IgE、IL-2、IL-13、TNF-α水平檢測。

2.3.3 大鼠鼻黏膜病理學(xué)觀察 采用HE染色法進行觀察。大鼠處死后，每組隨機取6只，分離鼻黏膜組織，用多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，透明、浸蠟、包埋、切片、染色、脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察鼻黏膜病理情況。

2.3.4 大鼠鼻黏膜組織中各炎癥因子蛋白表達水平檢測 采用蛋白質(zhì)印跡法進行檢測。取“2.3.3”項下每組剩余6只大鼠，分離鼻黏膜組織，用液氮迅速冷凍，-80℃冰箱保存。檢測時取出，在研缽中搗碎，加入細胞裂解液，低溫勻漿，以12 000 r/min離心10 min后，采用BCA法測定蛋白表達水平。將上述蛋白樣品變性后，取30 μg變性蛋白樣品，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，分別加入TNF-α、IL-2、IL-13和β-actin一抗，4 ℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗，室溫孵育1 h，顯影，用全自動凝膠成像儀成像。采用Quantity One分析軟件分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值表示各目標(biāo)蛋白的表達水平。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以±s表示，符合正態(tài)分布時，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；不符合正態(tài)分布時，采用非參數(shù)檢驗中的Mann-WhitneyU檢驗。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方魚鵝滴鼻劑對AR模型大鼠鼻部癥狀評分的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠鼻部癥狀明顯，擦鼻、噴嚏、鼻腔分泌物、鼻腔炎癥評分均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組（除復(fù)方魚鵝滴鼻劑中劑量組鼻腔炎癥評分、低劑量組擦鼻和鼻腔炎癥評分外）大鼠鼻部各項癥狀評分均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 復(fù)方魚鵝滴鼻劑對AR模型大鼠鼻部癥狀評分的影響（±s，n＝12，分）

表2 復(fù)方魚鵝滴鼻劑對AR模型大鼠鼻部癥狀評分的影響（±s，n＝12，分）

a：與空白對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01

鼻腔炎癥0 1.60±0.84a 0.60±0.79c 0.70±0.67c 1.00±0.94 1.40±0.84組別空白對照組模型組曲安奈德組復(fù)方魚鵝滴鼻劑高劑量組復(fù)方魚鵝滴鼻劑中劑量組復(fù)方魚鵝滴鼻劑低劑量組擦鼻0 1.90±0.86a 1.20±0.42b 1.20±0.36b 1.20±0.63b 1.50±1.20噴嚏0 1.60±0.52a 1.00±0.47c 1.10±0.32c 0.90±0.32c 1.10±0.32c鼻腔分泌物0 1.70±0.67a 0.70±0.48c 0.30±0.48c 0.60±0.35c 0.90±0.57c

3.2 復(fù)方魚鵝滴鼻劑對AR模型大鼠血清中IgE和炎癥因子水平的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠血清中IgE、IL-2、IL-13、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠血清中IgE、IL-2、IL-13、TNF-α水平均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表3。

表3 復(fù)方魚鵝滴鼻劑對AR模型大鼠血清中IgE和炎癥因子水平的影響（±s，n＝12）

表3 復(fù)方魚鵝滴鼻劑對AR模型大鼠血清中IgE和炎癥因子水平的影響（±s，n＝12）

a：與空白對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05

TNF-α/（pg/mL）106.67±31.39 298.75±48.05a 228.54±57.31b 216.67±62.69b 252.33±63.04c 252.17±74.39c組別空白對照組模型組曲安奈德組復(fù)方魚鵝滴鼻劑高劑量組復(fù)方魚鵝滴鼻劑中劑量組復(fù)方魚鵝滴鼻劑低劑量組IgE/（ng/mL）11.92±3.61 72.42±12.51a 40.67±9.22b 36.68±9.86b 58.00±19.75c 42.08±9.32b IL-2/（pg/mL）5.33±1.87 18.75±3.84a 12.25±4.92b 12.53±5.37b 11.25±4.94b 14.33±5.23c IL-13/（pg/mL）4.75±2.01 28.25±7.76a 21.92±5.59c 21.83±4.57c 22.42±5.29c 20.17±4.59b

3.3 復(fù)方魚鵝滴鼻劑對AR模型大鼠鼻黏膜病理情況的影響

空白對照組大鼠鼻黏膜組織形態(tài)正常；模型組大鼠鼻腔上皮層脫屑、變性，固有層出現(xiàn)嗜酸性粒細胞浸潤及水腫，血管擴張、充血；各給藥組大鼠鼻腔上皮層病理損傷較模型組均有所減輕，表現(xiàn)為鼻腔上皮層輕度變性、固有層輕度水腫、嗜酸性粒細胞少量浸潤。結(jié)果見圖1。

圖1 復(fù)方魚鵝滴鼻劑對AR模型大鼠鼻黏膜病理情況影響的顯微圖（×200）

3.4 復(fù)方魚鵝滴鼻劑對AR模型大鼠鼻黏膜組織中炎癥因子蛋白表達水平的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠鼻黏膜組織中TNF-α、IL-2、IL-13蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠鼻黏膜組織中TNF-α、IL-2、IL-13蛋白表達水平均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表4、圖2。

圖2 各組大鼠鼻黏膜組織炎癥因子蛋白表達電泳圖

表4 復(fù)方魚鵝滴鼻劑對AR模型大鼠鼻黏膜組織炎癥因子蛋白表達水平的影響（±s，n＝6）

表4 復(fù)方魚鵝滴鼻劑對AR模型大鼠鼻黏膜組織炎癥因子蛋白表達水平的影響（±s，n＝6）

a：與空白對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05

IL-13/β-actin 0.192±0.038 0.552±0.103a 0.258±0.054b 0.332±0.057b 0.392±0.065b 0.438±0.061c組別空白對照組模型組曲安奈德組復(fù)方魚鵝滴鼻劑高劑量組復(fù)方魚鵝滴鼻劑中劑量組復(fù)方魚鵝滴鼻劑低劑量組TNF-α/β-actin 0.284±0.069 0.782±0.112a 0.532±0.097b 0.352±0.046b 0.388±0.074b 0.628±0.147c IL-2/β-actin 0.338±0.096 0.605±0.119a 0.335±0.112b 0.322±0.074b 0.437±0.096c 0.268±0.049b

4 討論

AR是發(fā)生在鼻黏膜的一種變態(tài)反應(yīng)性疾病，屬中醫(yī)學(xué)“鼻鼽”范疇。中醫(yī)學(xué)認為，AR是由于衛(wèi)表不固，風(fēng)寒之邪乘虛而入，犯及鼻竅，津液停聚，最終導(dǎo)致壅塞鼻竅；治法宜以祛風(fēng)、通竅、化痰為主[17]。復(fù)方魚鵝滴鼻劑具有清熱解毒、除濕祛濁、芳香通竅的功能，臨床用于治療急/慢性鼻炎、鼻竇炎和AR，可以明顯改善患者癥狀。

AR常由環(huán)境抗原（塵螨、植物花粉和動物蛋白等）刺激導(dǎo)致，是一種以Th2細胞因子優(yōu)勢表達、IgE過度合成、嗜酸性粒細胞選擇性浸潤為特征的疾病。目前已知Th1/Th2的免疫失衡是AR發(fā)病的重要機制[18]。Th1通過激活巨噬細胞分泌γ干擾素、IL-2等Th1細胞因子來清除體內(nèi)的各種致病因素，能增強宿主對眾多病原體感染的免疫防御能力；Th2主要通過促進抗體的產(chǎn)生、合成并分泌IL等因子、激活嗜酸性粒細胞等途徑產(chǎn)生免疫反應(yīng)，Th2細胞與Th1細胞通過其產(chǎn)生的細胞因子而相互抑制、相互協(xié)調(diào)對方的功能而達到平衡[19]。有研究表明，過敏性疾病主要是Th2型過敏反應(yīng)[19-20]。在AR的病理過程中，過敏原會誘導(dǎo)Th2細胞的增殖，使IL-4、IL-5、IL-10、IL-13的分泌增加，進而促進IgE產(chǎn)生、嗜酸性粒細胞浸潤和肥大細胞脫顆粒，最終加劇AR的發(fā)生和發(fā)展。

在本研究中，與空白對照組比較，模型組大鼠出現(xiàn)明顯的擦鼻、打噴嚏、流鼻涕和鼻腔紅腫出血等癥狀，鼻部癥狀評分顯著升高，血清中IgE、IL-2、IL-13、TNF-α水平均顯著升高，鼻黏膜組織病理損傷明顯，鼻黏膜組織中TNF-α、IL-2、IL-13蛋白表達水平均顯著升高，表明模型組大鼠體內(nèi)Th1/Th2處于非動態(tài)平衡的狀態(tài)。與模型組比較，復(fù)方魚鵝滴鼻劑能明顯改善模型大鼠擦鼻、打噴嚏、流鼻涕和鼻腔紅腫出血等癥狀，降低模型大鼠鼻部癥狀評分及血清中IgE、IL-2、IL-13、TNF-α水平，改善模型大鼠鼻黏膜組織病理損傷，抑制鼻黏膜組織中TNF-α、IL-2、IL-13蛋白表達。這表明復(fù)方魚鵝滴鼻劑可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，對由炎癥因子和免疫細胞參與的變態(tài)反應(yīng)性AR產(chǎn)生抑制作用。

綜上所述，復(fù)方魚鵝滴鼻劑能夠降低卵清蛋白誘導(dǎo)的AR模型大鼠血清中IgE、IL-2、IL-13、TNF-α水平，抑制鼻黏膜組織中IL-2、IL-13、TNF-α的蛋白表達，減少鼻黏膜組織中嗜酸性粒細胞的浸潤，改善AR的癥狀，即通過調(diào)節(jié)Th1/Th2相關(guān)因子的平衡，緩解鼻部變應(yīng)性炎癥反應(yīng)，從而達到改善AR的目的。但由于影響Th1/Th2平衡的相關(guān)因子較多，后期可通過深入研究其他相關(guān)因子，為復(fù)方魚鵝滴鼻劑治療AR的作用機制提供佐證。