劉凱麗，劉艷之，王世暉，衛(wèi)春紅，王秀文，王穎莉，王艷#（.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西 晉中 03069；.山西振東安欣生物制藥有限公司，山西 晉中 030600）

西黃丸，又名犀黃丸，出自清代醫(yī)家王洪緒《外科證治全生集》[1]，由牛黃或體外培育牛黃、麝香（或人工麝香）、醋乳香、醋沒藥制成，具有清熱解毒、消腫散結(jié)之功效，主要用于治療熱毒壅結(jié)所致的癰疽疔毒、瘰疬、流注、癌腫[2]，以及腫瘤的長期輔助治療。麝香、乳香和沒藥含有較多的揮發(fā)性成分，如麝香酮、α-蒎烯、β-欖香烯等，其中麝香酮為麝香的主要成分，具有抗腫瘤、抗炎、保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)等作用[3]；乳香的有效成分α-蒎烯具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用[4]，乙酸辛酯具有止痛的作用[5]；沒藥的有效成分β-欖香烯具有抗腫瘤、抗炎等作用[6]。西黃丸現(xiàn)收載于2020年版《中國藥典》（一部），僅以豬去氧膽酸、游離膽紅素為指標進行質(zhì)量評價[2]?，F(xiàn)有文獻也僅對西黃丸中11-羰基-β-乳香酸進行含量測定[7]。由于中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，具有多成分、多靶點的特征[8]，現(xiàn)行質(zhì)量標準未對西黃丸中揮發(fā)性成分進行分析，且現(xiàn)有文獻中存在所測指標單一等問題。因此對單一成分進行檢測，無法評價西黃丸的整體質(zhì)量。

一測多評法（Quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）具有節(jié)約對照品、快速等優(yōu)點，適用于藥效成分復(fù)雜多樣的中藥及中藥制劑[8]。中藥指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別分析可用于評價中藥的內(nèi)在質(zhì)量，可以客觀、有效地控制中藥質(zhì)量，保證中藥產(chǎn)品質(zhì)量的一致性和穩(wěn)定性[9]?；诖?，本研究采用氣相色譜（GC）-QAMS法同時測定了西黃丸中揮發(fā)性成分α-蒎烯、乙酸辛酯、β-欖香烯、麝香酮的含量，建立了GC指紋圖譜并進行了化學(xué)模式識別分析，旨在為評價西黃丸的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有2010 Plus型GC儀（日本Shimadzu公司），7890A型GC儀（美國Agilent公司），ME104型萬分之一分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，DL-5-B型低速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 主要藥品與試劑

α-蒎烯對照品（批號G1083952，純度96.73%）購自上海泰坦科技股份有限公司；乙酸辛酯對照品（批號3879，純度97.9%）購自上海詩丹德標準技術(shù)服務(wù)有限公司；β-欖香烯對照品（批號100268-201903，純度99.4%）購自中國食品藥品檢定研究院；麝香酮對照品（批號wkq20030309，純度≥98%）購自四川省維克奇生物科技有限公司；乙酸乙酯為色譜純。乳香、沒藥藥材均于2021年9月5日購自北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室裴香萍教授鑒定，分別為橄欖科植物乳香樹Boswellia carteriiBirdw.及同屬植物B.bhaw-dajianaBirdw.樹皮滲出的樹脂、橄欖科植物地丁樹Commiphora myrrhaEngl.或哈地丁樹C.molmolEngl.的干燥樹脂。13批西黃丸（編號S1～S13）的樣品來源信息見表1。

表1 13批西黃丸樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 QAMS法測定揮發(fā)性成分含量

2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取α-蒎烯、乙酸辛酯、β-欖香烯、麝香酮對照品各適量，用乙酸乙酯溶解，制成上述各成分質(zhì)量濃度分別為274.56、636.48、344.80、337.20 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取西黃丸粉末（過三號篩）1.00 g，精密加入乙酸乙酯5 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率500 W，頻率40 kHz）提取30 min，放冷至室溫，再次稱定質(zhì)量，用乙酸乙酯補足減失的質(zhì)量，以4 000 r/min離心20 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 檢測器為火焰離子化檢測器；色譜柱為SE-54毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氮氣（純度為99.999%）；載氣流量為1.39 mL/min；空氣流量為400.0 mL/min；氫氣流量為40.0 mL/min；氮氣尾吹流量為30.0 mL/min；進樣量為1 μL；分流比為10∶1。升溫程序為初始柱溫50℃，保持3.5 min；以25℃/min升至143℃，保持10 min；以10℃/min升至193℃，保持9 min；以10℃/min升至230℃，保持5 min。氣化室和檢測器溫度均為250℃；總運行時間為36.42 min。

2.1.4 系統(tǒng)適用性試驗 取上述混合對照品溶液、供試品溶液以及空白對照溶液（乙酸乙酯）各適量，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖（圖1，空白對照溶液圖略）。結(jié)果顯示，空白對照溶液對測定無干擾，各待測成分色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5。

圖1 西黃丸定量分析的GC圖

2.1.5 線性關(guān)系考察 取“2.1.1”項下混合對照品溶液，用乙酸乙酯分別稀釋2、4、8、16、32、64倍，制得系列線性工作溶液。取系列線性工作溶液及“2.1.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，結(jié)果見表2。

表2 α-蒎烯等待測成分的回歸方程與線性范圍

2.1.6 精密度試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（編號S6），按“2.1.3”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，α-蒎烯、乙酸辛酯、β-欖香烯、麝香酮峰面積的RSD分別為1.80%、1.88%、1.76%、1.74%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗 精密稱取西黃丸樣品（編號S6），共6份，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算含量。結(jié)果顯示，α-蒎烯、乙酸辛酯、β-欖香烯、麝香酮含量的RSD分別為1.64%、1.74%、1.76%、1.78%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（編號S6），分別于室溫下放置0、2.5、5、7.5、10、15、24 h時，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，α-蒎烯、乙酸辛酯、β-欖香烯、麝香酮峰面積的RSD分別為1.27%、1.28%、1.43%、1.40%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 取已知含量的西黃丸樣品（編號S6）約0.50 g，共6份，精密稱定，分別精密加入相當于已知量100%的單一對照品溶液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結(jié)果顯示，α-蒎烯、乙酸辛酯、β-欖香烯、麝香酮的平均加樣回收率分別101.99%、102.28%、98.43%、99.17%，RSD均小于3.0%（n＝6），表明方法準確度良好。

2.1.10 相對校正因子的計算 取“2.1.1”項下混合對照品溶液及“2.1.5”項下系列線性工作溶液，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以麝香酮為內(nèi)參物（因麝香酮在不同批次西黃丸中含量較為穩(wěn)定），按下式計算麝香酮相對于其他成分的相對校正因子（fk/s），fk/s＝（Cs×Ak）/（Ck×As），式中Cs為內(nèi)參物質(zhì)量濃度，As為內(nèi)參物色譜峰峰面積，Ck為待測成分質(zhì)量濃度，Ak為待測成分色譜峰峰面積[10]。結(jié)果顯示，α-蒎烯、乙酸辛酯、β-欖香烯的平均fk/s分別為0.450、0.499、1.006，RSD分別為1.58%、1.98%、1.98%（n＝7）。

2.1.11 耐用性考察 取“2.1.5”項下系列線性工作溶液，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。分別考察不同GC儀（Agilent 7890A型、島津2010 Plus型）、色譜柱[Agilent SE-54、Agilent HP-5MS、RESTEK Rtx-5（規(guī)格均為 30 m×0.25 mm，0.25 μm）]對fk/s的影響。結(jié)果顯示，α-蒎烯、乙酸辛酯、β-欖香烯的平均fk/s分別為0.451、0.499、1.018，RSD均小于5%，表明本方法耐用性良好。

2.1.12 樣品含量測定 取13批西黃丸樣品，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，分別按外標法、QAMS法計算樣品含量，每樣品平行測定3次，取平均值，并按下式計算相對誤差：相對誤差＝（WQAMS法-W外標法）/WQAMS法，式中WQAMS法為QAMS法測得的含量，W外標法為外標法測得的含量。結(jié)果顯示，除編號S1～S2、S5、S9、S11、S13樣品中未檢出α-蒎烯外，兩種含量測定方法所得含量結(jié)果的相對誤差均小于4%，表明兩種方法的測定結(jié)果無顯著性差異。結(jié)果見表3。

表3 13批西黃丸中α-蒎烯等待測成分的含量測定結(jié)果（n＝3）

2.2 GC指紋圖譜的建立

2.2.1 精密度試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（編號S6），按“2.1.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。以麝香酮為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.2.2 重復(fù)性試驗 精密稱取西黃丸樣品（編號S6），共6份，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以麝香酮為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.2”項下供試品溶液（編號S6），分別于室溫下放置0、2.5、5、7.5、10、15、24 h時，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以麝香酮為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 指紋圖譜的建立 取13批西黃丸樣品，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》，以S6為參照圖譜（因S6樣品保留時間和峰面積適中），采用中位數(shù)法，時間窗寬度設(shè)置為0.1 min，多點校正后自動匹配，生成疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜（R）。結(jié)果顯示，13批西黃丸共識別出26個共有峰，通過與混合對照品（圖1A）進行比對，共指認了其中3個成分，分別為乙酸辛酯（峰2）、β-欖香烯（峰3）、麝香酮（峰15）。結(jié)果見圖2。

圖2 13批西黃丸的GC疊加指紋圖譜及對照指紋圖譜

2.2.5 共有峰歸屬分析 取沒藥、乳香藥材，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，以對照指紋圖譜為參照進行共有峰比對。結(jié)果顯示，峰2～7、9～10、16、20、22～24、26來源于沒藥，峰1～3、5、7～8、10、19～20、22～25來源于乳香。結(jié)果見圖3。

圖3 沒藥、乳香藥材的對照GC圖

2.2.6 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》對西黃丸指紋圖譜的相似度進行評價。結(jié)果顯示，13批樣品與對照指紋圖譜之間的相似度分別為 0.943、0.940、0.915、0.918、0.912、0.936、0.933、0.941、0.946、0.928、0.921、0.916、0.939，表明不同廠家生產(chǎn)的西黃丸化學(xué)成分種類差異較小。

2.3 聚類分析

以13批西黃丸樣品的26個共有峰峰面積為變量，選用組間連接法，以平方歐氏距離為度量，采用SPSS 25.0軟件進行聚類分析。結(jié)果顯示，當平方歐氏距離為20時，13批樣品分為2類，S1～S2、S6～S10、S13為一類，S3～S5、S11～S12為一類。結(jié)果見圖4。

圖4 13批西黃丸樣品的聚類分析樹狀圖

2.4 正交偏最小二乘法-判別分析

采用SIMCA 14.1軟件進行正交偏最小二乘法-判別分析。結(jié)果顯示，模型累計解釋率（R2X、R2Y）分別為0.978、0.990，模型預(yù)測參數(shù)（Q2）為0.877，其值越接近1表明模型的穩(wěn)定性和預(yù)測性越好[11]。13批樣品可分為兩類，S1～S2、S6～S10、S13為一類，S3～S5、S11～S12為一類。結(jié)果見圖5。

圖5 13批西黃丸樣品的正交偏最小二乘法-判別分析散點得分圖

以變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值大于1為標準[12]篩選影響樣品質(zhì)量的差異標志物。結(jié)果顯示，峰7、11、10、17、16的VIP值均大于1，表明這5個共有峰對應(yīng)的成分可能是影響樣品質(zhì)量的差異標志物。結(jié)果見圖6。

圖6 26個共有峰的VIP值

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的確定

本課題組前期參考相關(guān)文獻后發(fā)現(xiàn)，超臨界流體萃取法的揮發(fā)油得率及指標成分含量受萃取溫度、壓力、時間的影響較大[13]；水蒸氣蒸餾法在提取過程中易出現(xiàn)乳化、難分離、得率低等問題，從而影響含量測定的結(jié)果[14]；超聲提取法的揮發(fā)油得率受提取溫度、壓力的影響較小[14]，且操作簡便，各成分色譜峰響應(yīng)值高，提取效果好，色譜信息豐富，故選擇超聲提取法制備供試品溶液。

3.2 含量測定結(jié)果分析

α-蒎烯、乙酸辛酯分別為2020年版《中國藥典》（一部）中索馬里乳香和埃塞俄比亞乳香的標志成分，以α-蒎烯和乙酸辛酯為含量測定指標可以分析不同廠家西黃丸中乳香藥材的來源。含量測定結(jié)果顯示，S1～S2、S5、S9、S11、S13樣品中均未檢出α-蒎烯，表明這些批次的西黃丸所用乳香可能來源于埃塞俄比亞乳香[2]。不同批次西黃丸中α-蒎烯和乙酸辛酯含量差異較大，這可能與乳香藥材的來源不同有關(guān)。β-欖香烯和麝香酮在不同批次西黃丸中含量差異較小，表明這兩種成分在西黃丸的生產(chǎn)過程中較為穩(wěn)定。

3.3 指紋圖譜與化學(xué)模式識別結(jié)果分析

13批樣品指紋圖譜的相似度為0.912～0.946，表明不同廠家西黃丸化學(xué)成分種類差異較小。聚類分析結(jié)果顯示，當平方歐氏距離為20時，13批樣品可分為2類，S1～S2、S6～S10、S13為一類，S3～S5、S11～S12為一類，表明不同廠家西黃丸質(zhì)量存在差異，可能是由于不同廠家所用藥材來源和生產(chǎn)設(shè)備、工藝等不同所造成的。正交偏最小二乘法-判別分析結(jié)果顯示，峰7、11、10、17、16的VIP值均大于1，其中峰7、10在乳香和沒藥中均有檢出，峰16在沒藥中檢出，表明這5個共有峰對應(yīng)的成分可能是影響樣品質(zhì)量的差異標志物。雖然乙酸辛酯、β-欖香烯、麝香酮的VIP值均小于1，對西黃丸的質(zhì)量差異影響較小，但作為藥理活性的重要成分，仍有必要對其含量進行測定。在后續(xù)研究中，本課題組將采用質(zhì)譜手段對峰7等5個共有峰對應(yīng)的成分進行定性分析，同時結(jié)合藥效學(xué)研究進一步探討這些成分對西黃丸質(zhì)量的影響。

綜上所述，本研究成功建立了測定西黃丸中α-蒎烯等4個成分含量的方法，結(jié)合GC指紋圖譜和化學(xué)模式識別分析可用于評價西黃丸的質(zhì)量。峰7等5個共有峰對應(yīng)的成分可能是影響樣品質(zhì)量的差異標志物。