田 銳*， 高 闖， 黨珍珍， 孫雪花， 馬紅燕

(延安大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，延安市分析技術(shù)與檢測重點實驗室，陜西延安 716000)

SiO2納米粒子由于其良好的光學(xué)特性、穩(wěn)定性、生物相容性及易于功能化等特征在分析領(lǐng)域備受關(guān)注[1,2]?；跓晒釹iO2納米粒子的熒光分析法在分析檢測、生物成像等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[3 - 6]。苦味酸(2,4,6-三硝基苯酚)是一種有毒的硝基酚類化合物，該化合物在染料、炸藥、煙花、玻璃、醫(yī)藥殺菌劑、皮革工業(yè)以及農(nóng)業(yè)等方面有著廣泛應(yīng)用[7 - 9]。但排放于環(huán)境中的苦味酸會對環(huán)境造成污染，對人的皮膚、眼睛、呼吸道等產(chǎn)生毒害作用，還會損傷肝臟和腎臟、引起慢性中毒等[10,11]。因此，對環(huán)境中苦味酸的檢測具有十分重要的意義。目前已經(jīng)報道的檢測苦味酸的方法主要有：高效液相色譜法[12]、液-質(zhì)聯(lián)用法[13]、氣-質(zhì)聯(lián)用法[14]、拉曼光譜法[15]、電化學(xué)法[16]、熒光分析法[17]等。熒光檢測法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、分析速度快、實驗費用低等優(yōu)點，在分析檢測中得到廣泛應(yīng)用，研究檢測苦味酸的熒光探針也具有重要意義。

實驗發(fā)現(xiàn)，苦味酸對組裝于殼聚糖(CS)/SiO2納米粒子上的羅丹明B(RhB)的熒光有較強的猝滅作用。據(jù)此，實驗制備了RhB/CS/SiO2納米粒子，利用苦味酸對RhB/CS/SiO2納米粒子的熒光猝滅作用，建立了一種靈敏、簡便、經(jīng)濟的檢測苦味酸的熒光分析新方法，并將其用于水樣中苦味酸的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

熒光分光光度計(F-2700，日本日立科學(xué)儀器有限公司)；瞬態(tài)穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀(FLSP920，英國愛丁堡公司)；紫外-可見吸收光譜儀(8453，美國安捷倫公司)；離心機(H1850，湘儀離心機有限公司)；多點磁力攪拌器(RO10，德國IKA公司)；電子天平(BSA224S-CW，德國賽多利斯公司)。

苦味酸(PA)(分析純，西亞試劑有限公司)；羅丹明B(RhB)(分析純，西安化學(xué)試劑廠)；Triton X-100、正硅酸乙酯、殼聚糖(CS)(分析純，Sigma公司)。其他所用的常見試劑如正己醇、環(huán)已烷、丙酮等均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 納米粒子的制備

參考文獻方法[18]，采用反相微乳液法，以殼聚糖(Chitosan，CS)為模板，正硅酸乙酯為硅源制備納米粒子。具體步驟為：合成瓶中加入1.8 mL Triton X-100、1.8 mL正己醇和7.5 mL環(huán)己烷，混合均勻后，加入150 μL的超純水?dāng)嚢?0 min，然后加入100 μL CS溶液攪拌1 h，之后緩慢加入NaOH溶液調(diào)節(jié)體系pH值至中性，最后加入80 μL的正硅酸乙酯和60 μL氨水，室溫攪拌水解24 h。反應(yīng)完成后破乳、離心、洗滌，得產(chǎn)物CS/SiO2納米粒子。

將等體積的1.0×10-3mol/L RhB溶液與上述制備的CS/SiO2納米粒子分散液混合后，振蕩組裝30 min 后離心、洗滌得RhB/CS/SiO2納米粒子。

1.3 實驗方法

取0.20 mL RhB/CS/SiO2納米粒子分散液于比色管中，加入0.30 mL B-R緩沖溶液(pH=11.0)，再加入一定量的苦味酸溶液，最后用超純水稀釋至總體積為2.00 mL。反應(yīng)50 min后，在熒光分光光度計上測定樣品組(F)和對照組(F0)的熒光信號值，根據(jù)ΔF(ΔF=F0-F)與苦味酸濃度的關(guān)系定量測定苦味酸含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米粒子的表征

對制備的納米粒子進行了透射電子顯微鏡和傅里葉變換紅外光譜表征(圖1)。從圖1A中可以看出，CS/SiO2納米粒子為具有疏松多孔結(jié)構(gòu)、粒徑60 nm左右的球型；圖1B紅外光譜圖顯示，CS/SiO2納米粒子同時具有SiO2和CS的特征吸收峰，表明CS被復(fù)合進了納米粒子中。

圖1 Chitosan/SiO2納米粒子的透射電鏡(TEM)圖(A)和傅里葉變換紅外(FTIR)光譜圖(B)Fig.1 TEM image(A) and FTIR spectra(B) of Chitosan/SiO2 nanoparticles

2.2 光譜及傳感性質(zhì)

分別測定RhB、RhB/CS/SiO2及RhB/CS/SiO2-PA的熒光發(fā)射光譜(圖2)，圖中各曲線發(fā)射峰位置一致，說明CS/SiO2及苦味酸都不會影響RhB的發(fā)射性質(zhì)，但是通過比較加入苦味酸前后(曲線b、c)發(fā)射峰的強度，發(fā)現(xiàn)苦味酸加入后體系的熒光信號明顯降低，這是由于苦味酸對RhB的熒光產(chǎn)生了猝滅作用。

圖2 熒光光譜圖(a.羅丹明B；b.RhB/Chitosan/SiO2；c.RhB/Chitosan/SiO2-PA)Fig.2 Fluorescence spectra(a.RhB;b.RhB/Chitosan/SiO2;c.RhB/Chitosan/SiO2-PA)

為了考察RhB/CS/SiO2納米粒子的傳感性能，實驗比較了苦味酸對RhB、RhB/SiO2和RhB/CS/SiO2納米粒子的熒光猝滅情況，結(jié)果表明相同條件下苦味酸對RhB/CS/SiO2熒光納米粒子的熒光猝滅程度最大(圖3)。這可能是由于CS的制孔作用使CS/SiO2納米粒子具有孔結(jié)構(gòu)[19]，增大了CS/SiO2納米粒子的比表面積和RhB組裝量，同時也得使苦味酸更容易擴散進入納米粒子內(nèi)與RhB分子作用使其熒光猝滅，而由于納米粒子微環(huán)境中RhB分子彼此間距離較小，形成信號放大效應(yīng)[20]。實驗同時還對CS用量、RhB用量及組裝時間進行了考察。結(jié)果表明，在合成時加入100 μL 0.1%的CS所制備的CS/SiO2納米粒子對RhB的組裝和苦味酸的傳感性能最好，具體為CS/SiO2納米粒子分散液與等體積1.0×10-3mol/L RhB振蕩組裝30 min時，所得RhB/CS/SiO2納米粒子的傳感靈敏度最高。

圖3 羅丹明B、RhB/SiO2和RhB/Chitosan/SiO2的傳感性能比較Fig.3 Fluorescence sensing performance of RhB,RhB/SiO2 and RhB/Chitosan/SiO2

2.3 熒光壽命與吸收光譜

為了探討苦味酸對RhB/CS/SiO2納米粒子的熒光猝滅作用，實驗測定了加入苦味酸前后RhB/CS/SiO2熒光納米粒子的熒光壽命。實驗表明RhB/CS/SiO2熒光納米粒子的熒光壽命沒有發(fā)生變化(圖4)，說明苦味酸對RhB/CS/SiO2熒光納米粒子的猝滅為靜態(tài)猝滅[21]，這與紫外-可見吸收光譜(圖5)結(jié)果一致。

圖4 RhB/Chitosan/SiO2溶液加入PA前后的熒光壽命曲線Fig.4 Time -resolved fluorescence decay curve of RhB/Chitosan/SiO2 in the presence and absence of PA

圖5 苦味酸、RhB/Chitoasan/SiO2和RhB/Chitosan/SiO2-PA的UV-Vis吸收光譜Fig.5 UV-Vis absorption spectra of PA、RhB/Chitoasan/SiO2 and RhB/Chitosan/SiO2-PA

2.4 實驗條件的優(yōu)化

2.4.1 pH的影響在pH為2.0～12.0范圍內(nèi)(B-R緩沖溶液)，考察了pH對測定的影響。結(jié)果表明，當(dāng)體系pH為11.0時ΔF最大(圖6)。這可能是由于在堿性條件下苦味酸會被去質(zhì)子化，從而促進了它與RhB的結(jié)合，但是如果堿性太強，RhB也會產(chǎn)生去質(zhì)子化，導(dǎo)致其從納米粒子上脫落，故實驗確定pH為11.0。

圖6 pH對體系的影響Fig.6 Effect of pH on the system

2.4.2 緩沖液用量及反應(yīng)時間的影響實驗考察了B-R緩沖溶液用量對測定靈敏度的影響。結(jié)果表明，緩沖液用量為0.30 mL時ΔF值最大，故實驗確定緩沖液用量為0.30 mL。

室溫下，苦味酸和RhB/CS/SiO2熒光納米粒子作用時間的長短直接影響檢測靈敏度。因此，考察了作用時間對RhB/CS/SiO2熒光猝滅的影響。結(jié)果表明，RhB/CS/SiO2熒光納米粒子與苦味酸作用50 min后ΔF基本不變，因此實驗選擇時間為50 min。

圖7 有機化合物對體系熒光猝滅程度的影響Fig.7 Effect of organic compounds on fluorescence quenching efficiency of the system

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在優(yōu)化實驗條件下對苦味酸進行測定，結(jié)果表明，在5.0×10-6～6.0×10-4mol/L濃度范圍內(nèi)，體系的ΔF與苦味酸濃度呈良好線性，線性方程為：ΔF=3.41×106c+465.84，相關(guān)系數(shù)r=0.9990，檢出限為3.0×10-6mol/L。方法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.21%(cPA=1.0×10-5mol·L-1，n=11)。

2.6 樣品分析

向未檢出苦味酸的水樣中，加入一定量的苦味酸溶液測定回收率，檢測到的苦味酸濃度與加入濃度基本一致，表明方法可以用于水樣中苦味酸的檢測。

表1 樣品中苦味酸測定結(jié)果

3 結(jié)論

本文采用反相微乳液法，以殼聚糖(CS)為模板合成了CS/SiO2納米粒子，通過振蕩吸附將羅丹明B(RhB)組裝在其上得RhB/CS/SiO2納米粒子。利用苦味酸對RhB/CS/SiO2納米粒子的熒光猝滅作用，建立了測定苦味酸的熒光分析新方法。該方法具有很好的靈敏度和選擇性，可用于環(huán)境水體中苦味酸的分析檢測。