郭亞楠，陳佳雯，蔣奕斌，溫珍珍，林泱泱，朱潘嬋，錢 晶，3△

(1.湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 湖州 313000；2.湖州學(xué)院，浙江 湖州 313000；3.浙江省媒介生物學(xué)與病原控制重點實驗室，浙江 湖州313000)

腎細胞癌(RCC)是起源于腎皮質(zhì)或腎小管上皮細胞的惡性腫瘤[1]，是癌癥死亡的重要原因之一[2]。根據(jù)組織學(xué)類型，RCC可分為腎透明細胞癌、乳頭狀RCC、腎嫌色細胞癌、未分類細胞癌和Bellini集合管癌等[3]?；旌闲园┮源嬖?種及以上類型的惡性細胞和多型性細胞為主要病理特點[4]，腎透明細胞癌是混合腫瘤組織學(xué)患者最常見的病理類型，其他原發(fā)性腫瘤有腎乳頭狀細胞癌和腎嫌色細胞癌[5]?；旌闲阅[瘤臨床較少見，混合性腎癌(KIPAN)更為罕見。由于診斷不及時，治療延誤，晚期惡性程度高，分期分級高、進展快、易轉(zhuǎn)移等特點，患者預(yù)后較差[6]。腎癌具有多重耐藥性[7]，國內(nèi)以根治性腎切除術(shù)為首選治療方式[8]。C型凝集素域家庭16成員A(CLEC16A)是最近通過全基因組關(guān)聯(lián)(GWASs)鑒定出的C型凝集素受體(CLRs)家族成員之一[9]，已有多項研究證實CLEC16A與多發(fā)性硬化癥、1型糖尿病等多種自身免疫性疾病有密切關(guān)系。目前，國內(nèi)外關(guān)于CLEC16A的研究較少，對其在疾病中起到的確切作用機制尚不清楚[10]，因此，探索發(fā)現(xiàn)CLEC16A在KIPAN發(fā)生、發(fā)展中的分子機制和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進而在分子水平上預(yù)防或阻斷關(guān)鍵過程，以達到臨床治療、改善預(yù)后顯得尤為重要。

本研究利用多個在線數(shù)據(jù)庫分析CLEC16A在KIPAN中的表達，分析CLEC16A在KIPAN中的作用及對KIPAN患者預(yù)后的影響，為進一步研究CLEC16A在KIPAN的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中的意義提供一定理論依據(jù)和參考，也為進一步試驗研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1資料 從UCSC數(shù)據(jù)庫(https://xenabrowser.net/)中下載經(jīng)統(tǒng)一標準化的泛癌數(shù)據(jù)集：TCGA Pan-Cancer(PANCAN，N=10535，G=60499)，從中提取ENSG00000038532(CLEC16A)基因在各個樣本中的表達數(shù)據(jù)。從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載KIPAN組織和癌旁組織CLEC16A的mRNA表達數(shù)據(jù)及KIPAN患者的臨床數(shù)據(jù)。

1.2方法

1.2.1基因差異分析 從UCSC數(shù)據(jù)庫獲得樣本數(shù)據(jù)，并進一步篩選來源為Solid Tissue Normal、Primary Blood Derived Cancer-Peripheral Blood、Primary Tumor的樣本，對每一個表達值進行了log2(X+0.001)變換。此外，剔除單個癌種中樣本個數(shù)小于3的癌種，最終獲得26個癌種的表達數(shù)據(jù)。使用R軟件(4.1.2版)計算了每個腫瘤中正常樣本和腫瘤樣本的表達差異，使用非配對的Wilcoxon Rank Sum和Signed Rank Tests進行差異顯著性分析。

1.2.2CLEC16A表達量與多種癌種預(yù)后的關(guān)系 從UCSC數(shù)據(jù)庫中下載經(jīng)統(tǒng)一標準化的泛癌數(shù)據(jù)集：TCGA TARGET GTEx，從中提取CLEC16A基因在各個樣本中的表達數(shù)據(jù)，另外從此前發(fā)表在《Cell》上的TCGA預(yù)后研究中獲得高質(zhì)量的TCGA預(yù)后數(shù)據(jù)集[11]，從UCSC的癌癥瀏覽器中獲取TARGET隨訪數(shù)據(jù)作為補充及隨訪時間短于30 d的樣本，對每個表達值進行了log2(X+0.001)變換，剔除單個癌種中樣本個數(shù)小于10的癌種，使用R軟件建立Cox proportional hazards regression mode，分析基因表達與每個腫瘤中的預(yù)后關(guān)系，使用Logrank test進行統(tǒng)計檢驗獲得預(yù)后顯著性。

1.2.3CLEC在不同組織中的表達及其臨床特征分析 從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載原始數(shù)據(jù)和臨床相關(guān)數(shù)據(jù)，選擇轉(zhuǎn)錄組分析及基因表達定量的數(shù)據(jù)，方案選擇TCGA-KIRC TCGA-KIRP TCGA-KICH(TCGA Project)，利用Perl腳本將count數(shù)據(jù)與人類基因組注釋文件進行合并，生成單基因樣本的mRNA矩陣，然后利于R軟件編寫的腳本進行散點差異分析和臨床特征相關(guān)分析。

1.2.4CLEC16A與KIPAN患者預(yù)后關(guān)系分析 在TCGA的Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA)數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)中設(shè)定檢索條件：(1)Single Gene Analysis選項，Enter gene name輸入基因名“CLEC16A”；(2)Dataset選擇KICH、KIRC、KIRP，其余默認；(3)在Survival欄中，選擇Overall Survival及Disease Free Survival(RFS)；(4)在Datesets Selection(Cancer name)欄中，選擇KICH、KIRC、KIRP，點擊Plot。

1.2.5與CLEC16A相關(guān)的蛋白及功能分析 String數(shù)據(jù)庫是專門用于生物體范圍蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的在線資源之一[12]，可作為分析生物學(xué)基因和蛋白質(zhì)相互作用的檢索工具，包含蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)的生物數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)絡(luò)資源，能生成有關(guān)基因功能的假設(shè)，分析基因列表并進行功能分析。本研究利用String數(shù)據(jù)庫初步探索CLEC16A信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以構(gòu)建相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.6基因富集分析(GSEA) 根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫中CLEC16A表達中位值將其分為低、高表達組，隨后應(yīng)用GSEA軟件(4.2.2版)對試驗組CLEC16A高低之間差異基因進行KEGG富集分析，置換檢驗設(shè)置為1000次，將FDR<0.02的基因集作為顯著富集基因集，對CLEC16A在KIPAN發(fā)展的機制進行初步探究。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用數(shù)據(jù)庫默認的統(tǒng)計學(xué)方法，使用R軟件進行統(tǒng)計分析與應(yīng)用，通過非配對的Wilcoxon Rank Sum和Signed Rank Tests進行差異顯著性分析，分析正常組織和癌癥組織中CLEC16A的表達。使用Logrank test進行統(tǒng)計檢驗以獲得預(yù)后顯著性。GEPIA數(shù)據(jù)庫的結(jié)果顯示為風(fēng)險比(HR)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CLEC16A基因在不同腫瘤類型中的表達情況 從UCSC數(shù)據(jù)庫獲得樣本數(shù)據(jù)，挖掘處理后最終獲得了26個癌種的表達數(shù)據(jù)。在12種腫瘤中觀察到了CLEC16A基因顯著上調(diào)，如宮頸鱗癌和腺癌(CESC)、乳腺浸潤癌(BRCA)、胃和食管癌(STES)、腎乳頭狀細胞癌(KIRP)、胃癌(STAD)、子宮內(nèi)膜癌(UCEC)、頭頸鱗狀細胞癌(HNSC)、肝細胞肝癌(LIHC)、甲狀腺癌(THCA)、膀胱尿路上皮癌(BLCA)、腎嫌色細胞癌(KICH)、膽管癌(CHOL)；在5種腫瘤中觀察到了顯著下調(diào)如多形成性膠質(zhì)細胞瘤(GBM)、肺腺癌(LUAD)、KIPAN、腎透明細胞癌(KIRC)、肺鱗癌(LUSC)，見圖1。

2.2CLEC16A表達預(yù)后分析 在TARGET-LAML(n=142，P=0.0028，HR=1.58)、TCGA-SKCM-M(n=347，P=0.01，HR=1.45)及TCGA-LAML(n=209，P=0.000 2，HR=1.42)3個腫瘤類型中高表達的預(yù)后差,在TCGA-GBMLGG(n=619，P=2.9×10-18，HR=0.49)和TCGA-KIPAN(n=855，P=0.000 59，HR=0.74)2個腫瘤類型中低表達的預(yù)后差，見表1?？偵嫫?OS)結(jié)果顯示，CLEC6A是GBMLGG和KIPAN患者的保護因子，也是SKCM和LAML患者的風(fēng)險因子。此外，用同樣的方法獲得包括KIPAN在內(nèi)的多個癌種表達數(shù)據(jù)及對應(yīng)樣本的Disease-specific survival數(shù)據(jù)，最終觀察到在1個腫瘤類型TCGA-SKCM-M(n=341，P=0.03，HR=1.41)中高表達的預(yù)后差,在TCGA-GBMLGG(n=598,P=1.4×10-16,HR=0.49)、TCGA-KIPAN(n=840，P=0.001 7，HR=0.71)、TCGA-HNSC(n=485，P=0.04，HR=0.73)和TCGA-SKCM-P(n=97，P=0.05，HR=0.40)4個腫瘤類型中低表達的預(yù)后差，見表2。DSS分析顯示，CLEC6A是GBMLGG、KIPAN、HNSC和SKCM患者的保護因子，也是SKCM患者的風(fēng)險因子。

表1 CLEC16A在TCGA泛癌中對OS的單變量COX回歸結(jié)果

續(xù)表1 CLEC16A在TCGA泛癌中對OS的單變量COX回歸結(jié)果

表2 CLEC16A在TCGA泛癌中DSS的單變量COX回歸結(jié)果

續(xù)表2 CLEC16A在TCGA泛癌中DSS的單變量COX回歸結(jié)果

2.3CLEC16A在正常和KIPAN癌組織的差異 在TCGA數(shù)據(jù)庫中對KIPAN組織(893例)及正常組織(128例)在mRNA水平上的表達情況進行比較，結(jié)果表明，CLEC16A在KIPAN組織中的表達水平顯著低于正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.4CLEC16A表達量與KIPAN患者臨床特征的關(guān)系 在TCGA中的851個KIPAN樣本的病理分級進行分析，結(jié)果顯示，CLEC16A在KIPAN中的表達隨著腫瘤分期的增加而增加，見圖3。

2.5CLEC16A不同表達量的KIPAN患者預(yù)后比較 在432例KIPAN患者中，CLEC16A高表達組的總生存率、無進展生存率均高于低表達組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CLEC16A表達與KIPAN患者總體生存率明顯相關(guān)，低表達組相對于高表達組具有更高的生存率，見圖4、圖5。

2.6構(gòu)建CLEC16A相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò) 通過String數(shù)據(jù)庫分析得到與CLEC16A相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)，見圖6。選取PPI相關(guān)且P為1.38×10-8的數(shù)個蛋白質(zhì)，使平均網(wǎng)絡(luò)局部聚類系數(shù)為0.639，得到TMF1、USP8、SH2B3、ERBB3、RNF41、PTPN22等31個蛋白質(zhì)，主要參與的生物學(xué)過程有肌動蛋白皮質(zhì)補丁定位、自噬體成熟負調(diào)控、線粒體自噬負調(diào)控，減數(shù)分裂重組中間體拆分等。

2.7基因富集分析 為了研究CLEC16A基因?qū)τ谀I癌可能的作用機制，將試驗組胃癌樣本CLEC16A表達量按中位值分為高表達和低表達組，將2組的表達數(shù)據(jù)進行GSEA。結(jié)果表明，CLEC16A高表達腫瘤樣本在溶酶體和氧化磷酸化等生物學(xué)過程或通路存在富集。而CLEC16A低表達組在抗原加工及呈遞、產(chǎn)生免疫球蛋白A(IgA)腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、白細胞跨內(nèi)皮遷移、NOD樣受體信號通路、自然殺傷細胞介導(dǎo)的細胞毒性等信號通路存在富集。

3 討 論

ASLAN等[13]的研究表明，早期RCC的5年生存率良好，但由于小的RCC通常無癥狀，故早期診斷較困難，等患者出現(xiàn)明顯臨床癥狀時多為晚期。其診斷效果差，導(dǎo)致患者療效不佳、預(yù)后不良。盡管診斷技術(shù)水平不斷提高，仍有1/3的患者在確診時已為晚期[14]。根治性切除術(shù)是局限性RCC患者的首選治療方式，但在根治術(shù)后仍有很大可能發(fā)生轉(zhuǎn)移。由于RCC對化療及放療均不敏感，晚期RCC術(shù)后往往還需要靶向治療或免疫治療的輔助。RCC的發(fā)生、發(fā)展與缺氧信號通路有密切關(guān)系，缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(HIF)是由調(diào)節(jié)型亞基α和組成型亞基β構(gòu)成的異源二聚體。HIF-α水平有明顯的氧依賴性，當氧濃度升高時，HIF-α可發(fā)生羥基化進而被泛素連接酶VHL識別而發(fā)生泛素化，從而導(dǎo)致HIF-α被蛋白酶體識別而降解。而當?shù)脱鯐r，HIF-α羥基化酶活性降低，HIF-α降解減少蛋白水平增加，VHL失活造成HIF-α持續(xù)保持在較高水平，導(dǎo)致RCC的發(fā)生[15]。同時，HIF可以調(diào)節(jié)Treg細胞、T輔助細胞等多種免疫細胞的功能進而影響腫瘤微環(huán)境調(diào)控腫瘤生長[16]。腫瘤抑制基因VHL是E3泛素連接酶復(fù)合物的重要組成部分，可靶向催化羥基化修飾的HIF-α亞基泛素化和蛋白酶體降解[17-19]。此外，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路參與蛋白質(zhì)翻譯、核糖體生物合成等過程，維持細胞生長、繁殖與凋亡平衡，是細胞代謝、增殖、生長和存活的中心調(diào)節(jié)分子[20]。在內(nèi)皮細胞中，存在與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)結(jié)合的受體酪氨酸激酶RTK，通過激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和PI3K/AKT/mTOR信號通路[21]，而解除該復(fù)合物對mTOR復(fù)合物1(mTORC1)抑制，活化的mTORC1通過調(diào)節(jié)代謝、翻譯、細胞自噬等多種過程來協(xié)調(diào)細胞生長，增加細胞適應(yīng)性。生理條件下，該通路受到嚴格控制，負調(diào)節(jié)喪失是多種癌癥發(fā)生的重要原因之一[22-23]。

位于染色體16p13的CLEC16A是C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族的一員，編碼1 053個氨基酸的大蛋白，包含數(shù)個假定的功能域，以及C型凝集素結(jié)構(gòu)域[9]，在多種代謝過程中發(fā)揮作用。CLEC16A具有E3泛素連接酶的性質(zhì)，已被證明在自噬和線粒體自噬過程中發(fā)揮作用，可與NRDP1和USP85形成泛素依賴型復(fù)合物。TAM等[24]將CLEC16A基因在小鼠中全身敲除后，發(fā)現(xiàn)多種線粒體相關(guān)的蛋白被上調(diào)或下調(diào)。HUA等[25]通過異位表達和siRNA沉默，發(fā)現(xiàn)CLEC16A可能通過激活mTOR通路來調(diào)節(jié)自噬，CLEC16A的過表達導(dǎo)致mTOR活性升高，進而降低LC3自噬活性。另一方面，CLEC16A缺乏會延遲mTOR活性，從而導(dǎo)致自噬反應(yīng)增強。CLEC16A可作用于TSC1/2下游，增強mTORC1的活性，表現(xiàn)為同時增強磷酸化多個直接靶標，包括ULK、4E-BP1和S6K[26]。mTOR抑制劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于腫瘤靶向治療、器官移植、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病的研究[27]，但臨床治療中癌癥對mTOR靶向抑制劑治療卻不敏感或沒有反應(yīng)[28]。因此，深入探索腎癌發(fā)病潛在的分子機制至關(guān)重要，找到新的潛在治療靶標具有關(guān)鍵的實際臨床意義。

USCS、TCGA、GTEx、String數(shù)據(jù)庫是目前較為全面的基因芯片數(shù)據(jù)平臺，從中可以獲取大量臨床樣本信息數(shù)據(jù)。由于目前尚缺乏CLEC16A與KIPAN的文獻報道，本研究中首先在上述數(shù)據(jù)庫中獲取了CLEC16A在各個癌癥組織中的表達數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，在大部分癌癥中CLEC16A高表達，但在包括KIPAN在內(nèi)的5種癌種中顯著低表達，表明CLEC16A是KIPAN的保護因子。對CLEC16A在KIPAN中的表達水平和預(yù)后進行深度挖掘和分析，CLEC16A在KIPAN中較正常組織低表達，且CLEC16A的表達量與預(yù)后呈負相關(guān)。進一步通過GEPIA數(shù)據(jù)庫驗證，結(jié)果一致，即CLEC16A高表達患者的OS較CLEC16A低表達患者明顯縮短。本研究觀察到，隨著KIPAN病理分級的增加，CLEC16A表達量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。GESA結(jié)果顯示，CLEC16A高表達組在溶酶體和氧化磷酸化等生物學(xué)過程或通路存在富集；而CLEC16A低表達組在抗原加工及呈遞、產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、白細胞跨內(nèi)皮遷移、NOD樣受體信號通路、自然殺傷細胞介導(dǎo)的細胞毒性等信號通路存在富集。CLEC16A很可能在KIPAN發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，成為靶向治療的新方向。

本研究與既往的利用體外實驗技術(shù)分析研究腫瘤生長模式不同，通過對多個數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)挖掘分析，減小由于樣本量不足與地理環(huán)境等差異導(dǎo)致的不可控變量影響，相關(guān)結(jié)果可作為臨床試驗的前瞻研究與重要補充，但CLEC16A是否在KIPAN的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用還需進一步試驗驗證。