周大標(biāo) 吳冰心 汪松林 吳 釩 李志鋼

(1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)， 湖北 武漢 430065； 2. 湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 骨科， 湖北 武漢 430015； 3. 南京中醫(yī)藥大學(xué) 附屬蘇州市中醫(yī)院 骨科， 江蘇 蘇州 215009)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis, PMOP)是女性最常見的骨骼疾病，以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)退化導(dǎo)致骨脆性增加為特點(diǎn)。由于絕經(jīng)后女性卵巢功能衰退導(dǎo)致雌激素分泌不足，后者對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用減弱，致使骨吸收大于骨形成，使骨骼出現(xiàn)骨丟失的病理變化[1]。PMOP在古代醫(yī)籍并無病名記載，中醫(yī)如今將其歸納為“骨痿”“骨枯”等范疇?！端貑枴ど瞎盘煺嬲摗吩唬号悠咂撸蚊}虛，天癸竭，地道不通，因此認(rèn)為“腎虛精虧”是女性PMOP發(fā)生的主要病機(jī)，腎主骨生髓，腎虛則精血化生無源，精枯髓減則導(dǎo)致骨骼脆性增加，痿弱難用，故而引發(fā)PMOP[2]。

PMOP與其他慢性疾病一樣，需要長(zhǎng)期個(gè)體化治療。服用抗骨質(zhì)疏松西藥需要聯(lián)合或序貫治療，存在副作用大、有藥物假期以及停藥后骨量會(huì)迅速下降等問題[1]。因此，亟待探索更有效的藥物及治療思路。近年研究表明，中醫(yī)中藥治療PMOP效果顯著，其價(jià)格適中、不良反應(yīng)小并且可整體調(diào)節(jié)[3]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可識(shí)別和篩選出有效活性成分及作用于疾病的潛在作用靶點(diǎn)，并構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)，為中醫(yī)藥治療疾病提供嶄新理念和研究途徑。牛膝、補(bǔ)骨脂具有補(bǔ)腎陽(yáng)、滋腎陰、填精髓功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，兩藥具有抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、抗氧化、抗炎、減少骨量丟失等多種藥理作用[4-5]。兩藥藥性溫和、不良反應(yīng)小，常用于肝腎虧虛型PMOP的治療。牛膝-補(bǔ)骨脂藥對(duì)成分復(fù)雜，其作用機(jī)理仍不完全清楚，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析牛膝-補(bǔ)骨脂的活性成分、作用靶點(diǎn)及其可能的作用機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)與統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP、TCMID及Swiss Target Prediction，人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org/)，基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Genecards，藥物靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)(therapeutic target database, TTD)，蛋白相互作用String數(shù)據(jù)庫(kù)。應(yīng)用的軟件包括Venny 2.1，Cytoscape 3.8.2，R 4.0.5軟件等[6]。

1.2 方法

1.2.1 “牛膝-補(bǔ)骨脂”藥對(duì)主要活性成分及靶點(diǎn)篩選

在TCMSP及TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索“牛膝，補(bǔ)骨脂”成分，口服利用度(oral bioavailability, OB)≥30% 和類藥性(drug like ness, DL)≥0.18 表示化合物能被較好吸收循環(huán)并具有更好的藥理特性，以此為篩選條件從TCMSP獲取有效成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。

1.2.2 PMOP相關(guān)靶點(diǎn)獲取

以“postmenopausal osteoporosis”為檢索詞，在GeneCards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索得到PMOP相關(guān)靶點(diǎn)，對(duì)搜集到的疾病靶點(diǎn)處理、去重后得到PMOP的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2.3 “牛膝-補(bǔ)骨脂”藥對(duì)與PMOP共同靶點(diǎn)的篩選

運(yùn)用Venny 2.1軟件將1.2.1獲得的“藥物-靶點(diǎn)”與1.2.2獲得的“疾病-靶點(diǎn)”進(jìn)行映射，繪制Venny圖并得到“牛膝-補(bǔ)骨脂”藥對(duì)治療PMOP的交集潛在作用靶點(diǎn)。

1.2.4 “中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

標(biāo)識(shí)1.2.3步驟獲取的靶點(diǎn)集導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建“藥材-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。使用Network Analyzer功能對(duì)牛膝、補(bǔ)骨脂的活性成分進(jìn)行分析，篩選出核心成分并對(duì)其進(jìn)行分析。

1.2.5 靶點(diǎn)蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

將1.2.4中獲取的藥物-疾病潛在化學(xué)成分的共同靶點(diǎn)蛋白上傳至在線STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，物種選擇“Homo sapiens”獲取蛋白互作信息，設(shè)置最低相互作用閾值0.4并構(gòu)建蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.6 GO生物功能與KEGG通路富集分析

基于R軟件獲取“牛膝-補(bǔ)骨脂”中藥治療PMOP的關(guān)鍵靶點(diǎn)，以Pvalue<0.05，Qvalue<0.05進(jìn)行GO(gene ontology)與KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析，探討“牛膝-補(bǔ)骨脂”藥對(duì)治療PMOP的相關(guān)生物過程及信號(hào)通路，并將結(jié)果以條形圖和氣泡圖形式呈現(xiàn)。

1.2.7 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)

將牛膝、補(bǔ)骨脂中篩選出來的關(guān)鍵活性成分作為配體，核心蛋白靶點(diǎn)作為受體進(jìn)行分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)并將其可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 “牛膝-補(bǔ)骨脂”藥對(duì)主要活性成分、靶點(diǎn)預(yù)測(cè)以及PMOP作用靶點(diǎn)

通過TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)獲取中藥牛膝、補(bǔ)骨脂化合物及靶點(diǎn)，并對(duì)牛膝、補(bǔ)骨脂的有效成分進(jìn)行篩選，共得到潛在活性成分53個(gè)(見表1)。

表1 中藥-成分-靶標(biāo)基本信息統(tǒng)計(jì)表

使用Swiss Target Prediction篩選出648個(gè)藥物靶點(diǎn)；以“postmenopausal osteoporosis”為關(guān)鍵詞，分別在OMIM、Genecards、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，對(duì)搜集到的PMOP靶點(diǎn)去重處理后共獲得靶點(diǎn)700個(gè)。

2.2 “牛膝-補(bǔ)骨脂”藥對(duì)與PMOP共同靶點(diǎn)的篩選

使用Venny 2.1軟件輸入篩選得到的648個(gè)藥物靶點(diǎn)和700個(gè)疾病靶點(diǎn)，繪制交集韋恩圖獲得藥物-疾病共同靶點(diǎn)135個(gè)(見圖1)。

圖1 牛膝-補(bǔ)骨脂與PMOP靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 構(gòu)建“藥物-活性成分-PMOP-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

將牛膝-補(bǔ)骨脂篩選出的53個(gè)潛在活性成分與135個(gè)藥物-疾病共同靶點(diǎn)輸入Cytoscape 3.8.2軟件中，繪制出“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)。使用Network Analyzer對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行核心成分拓?fù)浞治?，Degree值越大說明該成分越重要。Degree值靠前的活性成分，主要有脫皮甾酮、黃芩素、補(bǔ)骨脂查爾酮、山奈酚、槲皮素等。

注：橙色代表藥物，紫色代表牛膝-補(bǔ)骨脂中的52種活性成分(1個(gè)靶點(diǎn)無交集，予刪除)，綠色代表135個(gè)共同靶點(diǎn)，紅色代表疾?。籔MOP：絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥； Psoralea Corylifolia： 補(bǔ)骨脂； Achyranthes Bidentata：牛膝

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)分析

將135個(gè)交集靶點(diǎn)利用STRING軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3A)，鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目越多表示該基因在PPI中處于核心位置并起關(guān)鍵作用。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscap 3.8.2中，通過Network Analyzer進(jìn)行拓?fù)浞治觯Y選核心靶點(diǎn)，前30個(gè)靶點(diǎn)使用R 4.0.5繪制條形圖(見圖3B)。結(jié)果顯示，蛋白激酶(AKT)、腫瘤壞死因子(TNF)、雌激素受體(ER)、應(yīng)激活化蛋白激酶(JUN)等涉及代謝、增殖、細(xì)胞存活可能是“牛膝-補(bǔ)骨脂”藥對(duì)治療PMOP的核心靶點(diǎn)基因。

2.5 “牛膝-補(bǔ)骨脂”藥對(duì)治療PMOP的KEGG通路分析

經(jīng)R語(yǔ)言運(yùn)行135個(gè)共同靶點(diǎn)后得到143條KEGG通路，排列前20的結(jié)果以KEGG功能富集條形圖(見圖4)呈現(xiàn)。富集結(jié)果顯示，主要與化學(xué)致癌作用受體激活、糖尿病中的AGE-RAGE信號(hào)通路、癌癥中的蛋白多糖、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化等涉及代謝、炎癥、免疫、抗氧化的多個(gè)方面相關(guān)。

圖4 “牛膝-補(bǔ)骨脂”藥對(duì)治療PMOP的KEGG富集分析

2.6 “牛膝-補(bǔ)骨脂”藥對(duì)治療PMOP的GO富集分析

將135個(gè)共同靶點(diǎn)經(jīng)R語(yǔ)言運(yùn)行后GO分析選取生物學(xué)過程、細(xì)胞組分及分子功能3部分，具體結(jié)果見氣泡圖(見圖5)。氣泡大小、顏色分別代表基因個(gè)數(shù)與P值，氣泡越大基因個(gè)數(shù)越多，顏色越紅P值越小。GO結(jié)果顯示，富集的2 064條生物學(xué)過程通路中，主要涉及類固醇代謝、平滑肌細(xì)胞增殖、腺體發(fā)育、衰老及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)通路等；富集的46條細(xì)胞組分表達(dá)過程中，主要涉及膜區(qū)、脂筏、膜微區(qū)、質(zhì)膜外側(cè)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔體及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器復(fù)合體等；富集的120個(gè)與分子功能相關(guān)的過程中，主要涉及核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇集合及血色素結(jié)合等。

A：生物學(xué)過程富集氣泡圖； B：細(xì)胞組分富集氣泡圖; C：分子功能富集氣泡圖

2.7 關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證

采用AutoDock Vina軟件將牛膝、補(bǔ)骨脂主要成分與TNF、AKT1、ESR1、JUN進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)合能越小，成分與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合越好。TNF與山奈酚結(jié)合能為-34.3 kJ/mol(見圖6A)、AKT1與β-脫皮甾酮為-32.5 kJ/mol(見圖6B)、ESR1與黃芩素為-31.4 kJ/mol(見圖6C)，JUN與槲皮素為-22.7 kJ/mol(見圖6D)。

注：A：TNF與山奈酚；B：AKT1與β-脫皮甾酮；C：ESR1與黃芩素；D：JUN與槲皮素

3 討論

既往研究顯示，牛膝和補(bǔ)骨脂兩藥配合使用，增強(qiáng)藥效，可在多層面、多途徑及多靶點(diǎn)上發(fā)揮益精填髓、補(bǔ)腎強(qiáng)骨之功效[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可整體、系統(tǒng)地分析藥物治療疾病的機(jī)制。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，研究發(fā)現(xiàn)牛膝、補(bǔ)骨脂治療PMOP的活性成分有β-脫皮甾酮(beta-ecdysterone)、黃芩素(baicalein)、補(bǔ)骨脂查爾酮(bavachalcone)、山奈酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)。其中β-蛻皮甾酮具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、抗疲勞、促增殖、調(diào)節(jié)免疫的作用。β-蛻皮甾酮通過干擾破骨細(xì)胞的活性來抑制骨吸收，誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，減少其凋亡，并通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的信號(hào)通路減輕骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展[8]。黃芩素通過破壞Wnt/β-catenin通路，降低破骨細(xì)胞的骨吸收活性并抑制破骨細(xì)胞分化，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡和自由基清除作用[9]。山奈酚通過調(diào)節(jié)雌激素受體，抑制脂肪生成和氧化應(yīng)激，從而調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞自噬和成骨細(xì)胞凋亡[10]。槲皮素通過抗氧化、抗炎，抑制破骨細(xì)胞生成的同時(shí)促進(jìn)成骨[11]。補(bǔ)骨脂查爾酮具有延緩衰老的作用，通過干擾細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和AKt通路抑制前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化[12]。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以及拓?fù)浞治龊螅覀冋J(rèn)為AKT1、TNF、ESR1及JUN等可能是“牛膝-補(bǔ)骨脂”藥對(duì)治療PMOP的核心靶點(diǎn)基因。ERK調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化，活化PI3K磷酸化下游信號(hào)蛋白可減少破骨細(xì)胞自噬。腫瘤壞死因子的增加可促進(jìn)Rankl表達(dá)，影響骨質(zhì)流失并在骨骼重建中發(fā)揮重要作用[13]。雌激素受體是一種關(guān)鍵的調(diào)節(jié)激素。軟骨細(xì)胞中的雌二醇通過靶向激活ESR1，抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Erk2)的磷酸化活化，從而增加自噬通量并調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化，減少軟骨細(xì)胞凋亡[14]。應(yīng)激活化蛋白激酶直接與特定的靶DNA序列相互作用，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，通過激活c-Fos/c-Jun通路促進(jìn)Rankl介導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成和骨吸收，并誘導(dǎo)去卵巢小鼠的骨質(zhì)流失[15]。

GO與KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，本研究主要涉及化學(xué)致癌作用受體激活、糖尿病AGE-RAGE信號(hào)通路、癌癥蛋白多糖、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化等通路。化學(xué)致癌作用-受體激活通路主要發(fā)揮抗腫瘤活性、改善葡萄糖代謝、減少圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后潮熱，以及調(diào)節(jié)抗氧化作用[16]。糖尿病AGE-RAGE信號(hào)通路具有增加成骨的功能。AGEs不僅通過上調(diào)RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成，還可通過抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和下調(diào)分化來影響成骨細(xì)胞[17]。癌癥中的蛋白多糖存在于基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)中，充當(dāng)基質(zhì)支架、生長(zhǎng)因子庫(kù)和組織屏障[18]。脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化通路可誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子、腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-1的產(chǎn)生增加，加上衰老誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，更年期性激素產(chǎn)生減少，導(dǎo)致核因子κB配體受體激活劑水平增加，這可能參與骨質(zhì)流失和血管鈣化，導(dǎo)致鈣從骨骼轉(zhuǎn)移到血管壁[19]。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)牛膝-補(bǔ)骨脂治療PMOP的主要活性成分有脫皮甾酮、黃芩素、補(bǔ)骨脂查耳酮、山奈酚及槲皮素等。這些成分有可能是通過多種信號(hào)通路和多個(gè)途徑作用于蛋白激酶、腫瘤壞死因子、雌激素受體及應(yīng)激活化蛋白激酶等多個(gè)核心靶點(diǎn)基因，發(fā)揮抗炎、抗衰老及抗氧化的作用，同時(shí)抑制破骨細(xì)胞活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，從而達(dá)到骨代謝的動(dòng)態(tài)平衡。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，建立可視化網(wǎng)絡(luò)，從多角度分析“牛膝-補(bǔ)骨脂”治療PMOP的藥理機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供了更多的理論支撐。但本研究也顯示了很多未知的分子通路及作用機(jī)制，因此需要更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來探討牛膝-補(bǔ)骨脂治療PMOP的其它作用機(jī)制。