殷美琴，王永霞△，秦智娟，李美琴，馬宗麗，沈曉健，薛衛(wèi)紅，沙紅蘭

(如皋市人民醫(yī)院：1.婦產(chǎn)科；2.病理科，江蘇南通 226500)

卵巢癌對女性健康的威脅日趨嚴(yán)重，病死率是婦科腫瘤之首[1-2]。這與現(xiàn)今依然缺乏早期篩查手段及有效的治療措施密切相關(guān)。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)卵巢癌的生存率與腫瘤分期密切相關(guān)，分期越高，生存率越低[3]。因此，卵巢癌的早期診斷尤為重要。

炎癥在腫瘤中的作用被廣泛關(guān)注[4]。白細(xì)胞介素(IL)-17A是一種重要的炎癥介質(zhì)[5]，一方面可以誘導(dǎo)IL-6、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)等表達(dá)，另一方面又能同腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等協(xié)同作用，放大其致炎效應(yīng)。但目前只發(fā)現(xiàn)IL-17A在炎性反應(yīng)、自身免疫性疾病、部分腫瘤中發(fā)揮重要作用，與卵巢癌相關(guān)的研究較少。IL-6則是機(jī)體免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)的雙重調(diào)節(jié)因子，參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。干擾素(IFN)具有廣泛的生物學(xué)功能，可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、參與抗腫瘤等，IFN-γ能夠抑制腫瘤血管生成和腫瘤生長。目前關(guān)于細(xì)胞因子和卵巢癌的研究集中在對卵巢癌患者血清相關(guān)因子的測定，對卵巢癌組織中細(xì)胞因子表達(dá)水平的研究較少，且尚未發(fā)現(xiàn)IL-17A、IL-6、IFN-γ三者在卵巢癌中關(guān)系的研究。因此，本研究采用免疫組織化學(xué)分析檢測對照組織、卵巢良性上皮性腫瘤、卵巢癌組織中IL-17A、IL-6、IFN-γ蛋白的表達(dá)情況，通過ELISA檢測血清IL-17A、IL-6、IFN-γ蛋白的表達(dá)水平，最后分析IL-17A、IL-6、IFN-γ蛋白三者間的相關(guān)性，以期為卵巢癌的早期診斷及抗卵巢癌的藥物靶點(diǎn)提供新思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年5月至2020年5月如皋市人民醫(yī)院就診的50例患者為研究對象，其中30例上皮性卵巢癌患者作為卵巢癌組，20例卵巢上皮性良性腫瘤患者作為良性腫瘤組，另選取同期因子宮肌瘤行全子宮+附件切除術(shù)且卵巢正常的20例患者作為對照組。卵巢癌患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)30～70歲；(2)所有病例均符合卵巢癌病理分類標(biāo)準(zhǔn)和2014年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期標(biāo)準(zhǔn)診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)手術(shù)均按2015年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)卵巢癌指南規(guī)范的卵巢癌分期手術(shù)或卵巢癌減瘤術(shù)；(4)手術(shù)前均未行化療、放療及免疫治療。卵巢癌患者排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)腫瘤非卵巢原發(fā)；(2)正在服用免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑及糖皮質(zhì)激素者；(3)存在惡性腫瘤、自身免疫性疾病等其他疾病者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1主要試劑

DAB顯色試劑盒(AR1002)、聚合辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗小鼠IgG(SV0001)、聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG(SV0002)購自武漢博士德生物工程有限公司；抗IL-17A抗體(ab79056)、抗IL-6抗體(ab9324)、抗IFN-γ抗體(IFNG/466，ab218426)、人IL-17A ELISA Kit (ab216167)、人IL-6 ELISA Kit (ab178013)、人IFN-γ ELISA Kit (ab46025)購自英國Abcam公司。

1.2.2石蠟切片

將組織常規(guī)方法制作石蠟切片，切片厚度4 μm。

1.2.3蘇木素-伊紅(HE)染色

常規(guī)程序脫蠟染色，其中蘇木素液染色約10 min，水洗藍(lán)化20 min，伊紅液染1 s。

1.2.4免疫組織化學(xué)染色

切片脫蠟至水。過氧化氫(H2O2)孵育10 min，ddH2O洗滌5 min。枸櫞酸鹽抗原微波爐熱修復(fù)。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗凈5 min。5%BSA室溫孵育20 min。滴加一抗(IL-17A抗體1∶200稀釋，IL-6抗體1∶1 000稀釋，IFN-γ抗體1∶500稀釋)，4 ℃孵育過夜。PBS洗3次，每次3 min，二抗37 ℃孵育30 min。PBS洗3次，每次3 min，DAB顯色液。避光顯色，蒸餾水終止顯色。蘇木素染色10 min。純水藍(lán)化20 min。50%、70%、80%、95%和無水乙醇梯度脫水，每道2 min。二甲苯透明，中性樹脂封片，晾干，拍照。

1.2.5結(jié)果判斷

切片于低倍鏡下觀察，選擇卵巢癌較密處就進(jìn)一步觀察。高倍鏡下，觀察5個(gè)視野，陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色。用Image.pro plus 6.0處理圖片，獲得吸光度(A)值。

1.2.6ELISA檢測血清IL-17A、IL-6、IFN-γ水平

每孔加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，再加50 μL抗體Cocktail，室溫孵育2 h。洗滌10 s×3次。加入100 μL TMB Development Solution避光孵育10 min。加入100 μL Stop Solution，1 min后在A450 nm處讀數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同卵巢組織的形態(tài)觀察

對照組卵巢組織無明顯異常，良性腫瘤組卵巢有部分炎性細(xì)胞浸潤，卵巢癌組腫瘤細(xì)胞大小不均，形態(tài)各異，且排列雜亂無序，癌細(xì)胞核大且多呈卵圓形，核仁較為明顯，核分裂相較多，可見少量核固縮，細(xì)胞分化程度偏低，見圖1。

A、B：對照組；C、D：良性腫瘤組；E、F：卵巢癌組。

2.2 IL-17A在不同卵巢組織表達(dá)情況

IL-17A在對照組呈弱陽性，表達(dá)強(qiáng)度為0.147±0.025；在良性腫瘤組亦呈弱陽性，表達(dá)強(qiáng)度為0.159±0.028；在卵巢癌組呈強(qiáng)陽性，表達(dá)強(qiáng)度為0.386±0.024，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 ELISA檢測血清IL-17A表達(dá)水平

對照組血清IL-17A表達(dá)水平為(31.99±5.69)pg/mL，良性腫瘤組為(33.99±7.12)pg/mL，卵巢癌組為(63.72±8.28)pg/mL，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與良性腫瘤組比較。

2.4 IL-6在不同卵巢組織中的表達(dá)情況

IL-6在對照組呈弱陽性，表達(dá)強(qiáng)度為0.148±0.033；在良性腫瘤組呈中等陽性，表達(dá)強(qiáng)度為0.257±0.026；在卵巢癌組呈強(qiáng)陽性，表達(dá)強(qiáng)度為0.410±0.033，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

2.5 ELISA檢測血清IL-6表達(dá)水平

對照組血清IL-6表達(dá)水平為(27.08±8.54)pg/mL，良性腫瘤組為(55.53±9.22)pg/mL，卵巢癌組為(153.45±17.5)pg/mL，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與良性腫瘤組比較。

2.6 IFN-γ在不同卵巢組織中的表達(dá)情況

IFN-γ在對照組呈強(qiáng)陽性，表達(dá)強(qiáng)度為0.398±0.025；在良性腫瘤組亦呈強(qiáng)陽性，但弱于對照組，表達(dá)強(qiáng)度為0.301±0.035；在卵巢癌組呈弱陽性，表達(dá)強(qiáng)度為0.144±0.036，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

A、B：對照組；C、D：良性腫瘤組；E、F：卵巢癌組。

2.7 ELISA檢測血清IFN-γ的表達(dá)水平

對照組血清IFN-γ的表達(dá)水平為(142.97±20.79)pg/mL，良性腫瘤組為(111.89±17.40)pg/mL，卵巢癌組為(78.47±16.03)pg/mL，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖7。

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與良性腫瘤組比較。

2.8 IL-17A、IL-6、IFN-γ的相關(guān)性分析

IL-17A和IL-6呈強(qiáng)正相關(guān)關(guān)系(r=0.991 8)，IL-17A和IFN-γ呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.977 4)。

3 討 論

現(xiàn)今，卵巢癌的早期診斷和治療效果還不盡人意，雖然手術(shù)方式有所改進(jìn)且化療藥物不斷更新，但晚期卵巢癌患者的5年生存率并無明顯提高。同時(shí)，卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制仍不甚清楚，還需深入研究影響卵巢癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和分化的相關(guān)因素及分子機(jī)制，為臨床的早期診斷和治療提供新的思路。

許多上皮性腫瘤均有一個(gè)重要標(biāo)志，即潛在的慢性感染伴隨持續(xù)的固有免疫細(xì)胞活化，該過程的發(fā)生常常早于疾病的發(fā)生并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6]。而固有免疫細(xì)胞則是引起感染及炎癥相關(guān)性腫瘤基質(zhì)中的重要組分。而當(dāng)前慢性持續(xù)性的炎癥已成為惡性腫瘤新的熱門標(biāo)記性特征。因此，研究卵巢癌患者腫瘤微環(huán)境中的免疫和炎性反應(yīng)是了解卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵所在。

IL-17A是由CD4+T細(xì)胞中的輔助型T細(xì)胞(Th)17細(xì)胞亞群分泌的一種細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)某些細(xì)胞中TNF-α、IL-1、IL-6等促炎因子的表達(dá)，進(jìn)而參與炎性反應(yīng)、抗感染反應(yīng)等。IL-17A的表達(dá)水平也被一系列因素調(diào)節(jié)，如被抗原呈遞細(xì)胞分泌的IL-6和IL-1調(diào)節(jié)。另外，IFN-γ在IL-17A的調(diào)節(jié)中也起到重要作用，DMBA/TPA通過誘導(dǎo)IFN-γ的表達(dá)刺激IL-17A的分泌從而促進(jìn)乳頭瘤的進(jìn)展。但在IFN-/-的小鼠中，B16黑色素瘤的生長較野生型小鼠明顯增強(qiáng)，且IL-17A有更高的表達(dá)。由此推斷IFN-γ可能在不同腫瘤類型中對IL-17A的表達(dá)起不同調(diào)節(jié)作用?，F(xiàn)有研究表明IL-17A在多種腫瘤中表達(dá)升高，如乳腺癌[7]、膽囊癌[8]、非小細(xì)胞肺癌[9]等，且促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在本研究中，IL-17A在對照組、良性腫瘤組表達(dá)水平較低，且兩組間無差異；而在卵巢癌組表達(dá)水平升高，這與IL-17A在多種腫瘤中的表達(dá)趨勢一致。

IL-6來源廣泛，單核巨噬細(xì)胞、活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞等都可以產(chǎn)生IL-6。IL-6是機(jī)體免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，其在機(jī)體內(nèi)的生物學(xué)作用與其表達(dá)水平間具有兩面性。當(dāng)IL-6處于低水平時(shí)，有利于機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)；而當(dāng)其處于高水平時(shí)，就會嚴(yán)重影響細(xì)胞因子間正常的協(xié)同作用，從而引起細(xì)胞因子功能紊亂，進(jìn)而引發(fā)各種疾病。IL-6的過度產(chǎn)生在多種癌癥細(xì)胞中普遍存在，同時(shí)在癌癥患者中伴隨著血清IL-6水平的明顯上升。近些年國際國內(nèi)研究表明，IL-6介導(dǎo)的信號通路與乳腺癌[10]、肝癌[11]、胃癌[12]等常見腫瘤的發(fā)生、發(fā)展均密切相關(guān)，且參與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后及復(fù)發(fā)[13]。此外，IL-6還可增加卵巢癌細(xì)胞的黏附性、趨化性和化學(xué)促進(jìn)性及總的侵襲力[14]。本研究3組IL-6在卵巢組織和血清均有所表達(dá)，且隨惡性程度加重呈遞增趨勢。這與IL-6處于低水平時(shí)，有利于機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，而在腫瘤中常常過度表達(dá)一致。

IFN-γ是多功能細(xì)胞因子，參與抗感染、抗腫瘤等多種生物學(xué)事件。IFN-γ一方面可以增強(qiáng)自然殺傷(NK)細(xì)胞和T細(xì)胞的活性，從而促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子的分泌，這有利于激活抗腫瘤免疫途徑；另一方面高濃度IFN-γ或持續(xù)性低劑量的IFN-γ又有利于形成腫瘤細(xì)胞免疫逃逸微環(huán)境，說明IFN-γ對腫瘤的調(diào)控存在多面性?，F(xiàn)研究一般認(rèn)為當(dāng)Th1功能較強(qiáng)時(shí)，機(jī)體的細(xì)胞免疫可有效抑制腫瘤細(xì)胞的活力[15]，反之亦然。本研究中，IFN-γ在對照組呈強(qiáng)陽性，在良性腫瘤組亦呈強(qiáng)陽性，但弱于對照組，而在卵巢癌組呈弱陽性，說明在卵巢癌中Th1功能較弱，腫瘤細(xì)胞活力較強(qiáng)。

綜上所述，IL-17A、IL-6和IFN-γ參與了卵巢癌的發(fā)生，且三者間有一定的關(guān)聯(lián)，有成為卵巢癌早期檢測和分子靶向的可能，但三者間具體的作用機(jī)制，以及如何促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生還有待深入研究。