鄒媛遠，黃 洋，周連幫

(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科，合肥 230601)

胃腺癌是一種起源于胃黏膜的惡性腫瘤,其最常見的轉(zhuǎn)移方式是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與胃腺癌患者的治療反應(yīng)、局部復(fù)發(fā)和長期生存直接相關(guān)，不僅能夠評價患者的預(yù)后，而且對于治療模式的選擇也是至關(guān)重要的[1]。單細胞RNA測序是一種在單細胞水平上對整個轉(zhuǎn)錄組進行擴增和測序的新技術(shù)。一些基于單細胞測序?qū)ξ赴┑难芯恳呀?jīng)發(fā)表，但較少涉及與淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)細胞學(xué)的研究[2-4]。本研究收集淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性及陰性的胃腺癌組織及癌旁組織標(biāo)本，采用單細胞測序技術(shù)進行分析，利用實時定量PCR(real time quantitative PCR，RT-qPCR)技術(shù)對相關(guān)分子表達水平進行驗證，旨在發(fā)現(xiàn)與胃癌淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)的細胞學(xué)特征及分子改變，為胃癌的臨床診斷和治療提供了新的見解，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2019年9-12月本院接受胃切除手術(shù)的13例胃腺癌患者術(shù)中切除的腫瘤組織及癌旁組織，標(biāo)本經(jīng)病理檢查確診?；颊咝g(shù)前未進行過放化療,且對本研究均知情同意。單細胞RNA文庫試劑盒均由南京新格元生物有限公司提供；SYBR?Green PCR(PowerTrackTMSYBR Green Master Mix)試劑盒、Trizol試劑購自美國Thermo Scientific有限公司。

1.2 方法

1.2.1分組

單細胞RNA測序：胃癌組織及癌旁組織根據(jù)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，分為4種類型，即N1、T1(無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌旁及腫瘤組織)，N2、T2(有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌旁及腫瘤組織)。RT-qPCR：胃癌標(biāo)本13例依據(jù)術(shù)后病理結(jié)果分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組。

1.2.2單細胞RNA測序

按照試劑盒說明進行單細胞分離。利用Seurat程序進行細胞類型鑒定和聚類分析，將FindClusters函數(shù)的參數(shù)分辨率設(shè)置為0.6用于集群分析。使用功能FindMarkers對不同標(biāo)本或連續(xù)聚類之間的差異表達基因進行鑒定。

1.2.3RT-qPCR檢測XIST和CXCL5表達水平

提取胃癌組織按照試劑盒說明進行PCR，相對表達水平用2-ΔΔCt法計算。以GAPDH為內(nèi)參，XIST上游引物5′-TGG ATA GAG GAC CCA AGC GA-3′，下游引物5′-CAA GAC TGG CCC AGG CAT AA-3′；CXCL5上游引物5′-CAA GTT CCC TCC CCA CTC AC-3′，下游引物5′-TGC TAA AAA CCC GAC AGG CA-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-CAA CGA ATT TGG CTA CAG CA-3′，下游引物5′-AGG GGT CTA CAT GGC AAC TG-3′。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 胃腺癌中單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜和不同細胞類型

分別從淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性和陽性組的胃腺癌組織中獲得1 461和2 951個單細胞轉(zhuǎn)錄本進行分析，共鑒定出10種主要細胞類型。與淋巴轉(zhuǎn)移陰性組比較，淋巴轉(zhuǎn)移陽性組的主細胞占比明顯升高，見圖1。

圖1 胃腺癌中不同細胞類型占比

2.2 與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的一種主細胞亞型

根據(jù)主細胞的轉(zhuǎn)錄譜自動聚類，主細胞亞聚類顯示4簇，分別為主細胞1、主細胞2、主細胞3和主細胞4。采用擬時序分析法進行了轉(zhuǎn)錄軌跡分析，發(fā)現(xiàn)存在主細胞2、主細胞3、主細胞1向癌細胞的轉(zhuǎn)錄過渡狀態(tài)。主細胞3在淋巴轉(zhuǎn)移陽性患者的胃癌組織標(biāo)本中明顯富集，見圖2。

A：主細胞亞聚類的比例；B：從主細胞到癌細胞的轉(zhuǎn)化過程。

2.3 與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的一種窩狀黏液細胞亞型

窩狀黏液細胞亞聚類為3簇，窩狀黏液細胞1和窩狀黏液細胞2主要存在于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組的標(biāo)本中，與腫瘤組織(T1)比較，在正常組織(N1)中含量略有增加。窩狀黏液細胞3主要富集于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組的標(biāo)本中。使用受體-配體相互作用實現(xiàn)了細胞通信網(wǎng)絡(luò)。在這個網(wǎng)絡(luò)中，窩狀黏液細胞3與癌細胞之間的相互作用最為明顯。窩狀黏液細胞3標(biāo)記基因CXCL5在窩狀黏液細胞3中特異性表達，見圖3。

A：不同亞簇的窩狀黏液細胞在標(biāo)本中的比例；B：細胞通信網(wǎng)絡(luò)；C：CXCL5在不同細胞類型中的表達情況；D：CXCL5在3個窩狀黏液細胞亞簇中的表達情況。

2.4 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽/陰性組胃癌組織XIST、CXCL5表達水平比較

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組的胃癌組織中XIST、CXCL5表達水平均高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組(P<0.05)，見表1。

表1 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽/陰性組胃癌組織XIST、CXCL5表達水平比較

3 討 論

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)的最重要危險因素之一，淋巴結(jié)清掃已被證明可以提高胃癌的生存率[5]。單細胞RNA測序可以更好地揭示細胞之間的異質(zhì)性，識別不同的細胞亞群，剖析細胞分化過程和細胞作用關(guān)系，目前，單細胞RNA測序在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的研究鮮有報道。因此，將單細胞RNA測序技術(shù)應(yīng)用于胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移探尋有關(guān)的細胞學(xué)特征和相關(guān)分子標(biāo)志物等十分有必要。

本研究中發(fā)現(xiàn)了一種新的主細胞亞聚類——主細胞3，可能是胃腺癌轉(zhuǎn)移的潛在標(biāo)志。上皮化生是胃癌發(fā)生、發(fā)展的一個重要過程，主細胞的異常分化被認(rèn)為是導(dǎo)致上皮化生的主要原因[6-7]。解痙多肽表達化生(spasmolytic polypeptide expressing metaplasia,SPEM)作為胃癌癌前病變，有報道稱，發(fā)生化生時，主細胞會直接轉(zhuǎn)化為SPEM細胞，而當(dāng)化生消退時，SPEM細胞則會重新分化為主細胞[8]。本研究通過擬時序分析發(fā)現(xiàn)了在假的時間軸上，存在主細胞2、主細胞3、主細胞1向癌細胞的轉(zhuǎn)化。本研究發(fā)現(xiàn)，主細胞2與正常主細胞標(biāo)記基因類似，均高表達LIPF，而主細胞1和SPEM細胞相似，均高表達MUC6、SOX9[3]。作為正常的主細胞和SPEM細胞之間的中間狀態(tài)，主細胞3僅在淋巴轉(zhuǎn)移陽性患者的標(biāo)本中明顯富集，提示主細胞3可能是主細胞的一種新亞型，可以作為轉(zhuǎn)移的標(biāo)志。有了這個實驗基礎(chǔ)，繼續(xù)對主細胞3的差異富集基因XIST進行RT-qPCR實驗。XIST基因是哺乳動物中X基因失活的主調(diào)控因子，據(jù)報道，XIST在多種惡性腫瘤中過表達，并與更具有侵襲性的表型相關(guān)[9]。越來越多的研究表明，XIST異常上調(diào)與多種實體腫瘤的晚期腫瘤分期、分化差和生存期縮短直接相關(guān)[10]。整理文獻發(fā)現(xiàn)，對XIST在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的研究鮮有報道。本課題組對XIST進行RT-qPCR，發(fā)現(xiàn)XIST在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組的胃癌組織中表達水平更高，提示XIST過表達能夠促進胃癌腫瘤細胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，從而提高腫瘤的惡性程度。

本研究發(fā)現(xiàn)窩狀黏液細胞3主要存在于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組的標(biāo)本中，且在胃癌組織中明顯富集，通過細胞互作分析發(fā)現(xiàn)其與癌細胞相互作用強烈。同時GO分析顯示窩狀黏液細胞3差異基因富集的信號通路很多與細胞分離、細胞遷移相關(guān)，如細胞骨架蛋白綁定、有絲分裂細胞周期、細胞分裂等[11-12]。對其差異基因進行分析，發(fā)現(xiàn)CXCL5為其標(biāo)記基因。CXCL5是實體瘤中腫瘤微環(huán)境中重要的趨化因子之一，研究發(fā)現(xiàn)其來源可能與腫瘤微環(huán)境中的腫瘤自分泌和旁分泌有關(guān)[13]。根據(jù)以往的研究，與相應(yīng)癌旁組織及正常組織比較，CXCL5在鼻咽癌、胃癌、結(jié)直腸癌等癌組織中表達水平明顯升高[14-16]。本課題組對CXCL5進行RT-qPCR實驗，發(fā)現(xiàn)CXCL5在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組的胃癌組織中表達水平更高，提示CXCL5過表達能對胃癌腫瘤細胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有促進作用。

綜上所述，本研究將單細胞RNA測序應(yīng)用于胃癌淋巴轉(zhuǎn)移，確定了兩種可能對淋巴轉(zhuǎn)移有促進作用的細胞類型——主細胞3和窩狀黏液細胞3，并對這兩種細胞類型進行差異基因鑒定，發(fā)現(xiàn)其標(biāo)記基因XIST、CXCL5在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者的胃癌組織中明顯高表達，提示主細胞3、窩狀黏液細胞3及其標(biāo)記基因XIST、CXCL5有望成為預(yù)測胃癌淋巴轉(zhuǎn)移和治療的分子生物標(biāo)志物。