冷 玥，張 濤,趙津璋,劉 洋，王柏欣△

(1.佳木斯大學(xué)，黑龍江佳木斯 154000；2.北京市石景山醫(yī)院腫瘤科，北京 100042)

結(jié)直腸癌是一種臨床常見惡性腫瘤，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率在近年來一直呈上升趨勢，給人民健康和生活質(zhì)量造成嚴(yán)重威脅[1]。已有研究報道表明結(jié)直腸癌的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移等過程是由多種因素共同造成的病理過程，多種基因、信號通路及蛋白質(zhì)在其中發(fā)揮重要的作用[2]。小腦鋅指結(jié)構(gòu)(zinc finger protein of the cerebellum，ZIC)家族包括ZIC1、ZIC2、ZIC3、ZIC4、ZIC5，各自編碼鋅指轉(zhuǎn)錄因子，組成5個Cys2His鋅指結(jié)構(gòu)域[3]。越來越多的研究顯示，ZIC5蛋白參與前列腺癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4-6]。Krüppel樣因子5(Krüppel like factor 5，KLF5)是人體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和遷移有密切關(guān)系[7]。既往有關(guān)結(jié)直腸癌組織ZIC5和KLF5蛋白表達(dá)的研究報道較少且研究結(jié)論不一致，本研究采用免疫組織化學(xué)法和Western blot檢測結(jié)直腸癌組織ZIC5和KLF5表達(dá)水平，分析其與患者病理特征相關(guān)性并初步探討其對預(yù)后的判斷價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年2月至2017年8月北京市石景山醫(yī)院收治的74例結(jié)直腸癌患者的血液標(biāo)本和結(jié)直腸癌組織、癌旁組織(距離腫瘤組織外緣>5 cm)作為研究材料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)手術(shù)切除組織病理學(xué)檢查診斷為結(jié)直腸癌；(2)術(shù)前未接受放療、化療、靶向治療或免疫治療；(3)臨床和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)既往有結(jié)直腸手術(shù)史者；(3)臨床資料不完整者；(4)失訪或因結(jié)直腸癌以外原因死亡者。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核，所有患者對本研究均知情同意。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學(xué)

本研究中所有的組織石蠟切片均由北京市石景山醫(yī)院病理科切片制備，厚度4 μm。研究采用S-P免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)直腸癌組織和癌旁組織ZIC5和KLF5蛋白的表達(dá)情況，實驗操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。陰性和陽性對照分別為磷酸鹽緩沖液和已知的ZIC5和KLF5陽性標(biāo)本。ZIC5主要定位于細(xì)胞質(zhì)，同時在細(xì)胞核中也有少量表達(dá)；KLF5主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，以特定部位出現(xiàn)淡黃色至棕褐色判斷為陽性。以染色強度和視野內(nèi)陽性細(xì)胞百分比綜合評判ZIC5和KLF5蛋白表達(dá)強度。(1)染色強度：0分，無著色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。(2)陽性細(xì)胞百分比：0分，未見陽性細(xì)胞；1分，陽性細(xì)胞百分比<10%；2分，陽性細(xì)胞百分比10%～<50%；3分，陽性細(xì)胞百分比50%～<75%；4分，陽性細(xì)胞百分比≥75%。染色強度和陽性細(xì)胞百分比評分乘積作為最后結(jié)果，其中0分為陰性，1～3分為低表達(dá)，>3分為高表達(dá)。本研究所使用的S-P免疫組織化學(xué)法試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，鼠抗人ZIC5抗體和鼠抗人KLF5抗體購自美國Abcam公司。

1.2.2Western blot

第1步，取石蠟切片脫水后稱取50 mg組織，冰浴研磨后超聲破碎，于4 ℃，18 000 r/min離心30 min，取上清液。第2步，采用BCA試劑盒測定總蛋白濃度。第3步，取50 μg蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。第4步，TBST緩沖液洗膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后加入一抗(ZIC5和KLF5一抗稀釋度均為1∶15 000)，4 ℃冰箱孵育過夜。第5步，TBST洗膜30 min，1∶1 000二抗孵育2 h后加入堿性磷酸酶底物，顯色液顯色。第6步，使用UPV掃描儀進(jìn)行掃描，ZIC5蛋白分子量為66×103，KLF5蛋白分子量為52×103，以β-actin為內(nèi)參。

1.2.3隨訪

對患者進(jìn)行隨訪，末次隨訪時間為2021年4月，記錄無病生存期(disease-free survival，DFS)和總生存期(overall survival，OS)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，不符合正態(tài)分布的計量資料以M(Q1,Q3)表示，比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，比較采用χ2檢驗；等級資料組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。采用Kaplan-Meier法制作生存曲線并進(jìn)行Log-Rank比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)結(jié)果

與癌旁組織比較，結(jié)直腸癌組織ZIC5和KLF5的陽性率及高表達(dá)率更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖1。

A.ZIC5在結(jié)直腸癌組織表達(dá)陽性；B.ZIC5在癌旁組織表達(dá)陰性；C.KLF5在結(jié)直腸癌組織表達(dá)陽性；D.KLF5在癌旁組織表達(dá)陰性。

表1 ZIC5和KLF5在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織的表達(dá)情況[n=74,n(%)]

2.2 Western blot結(jié)果

結(jié)直腸癌組織ZIC5和KLF5表達(dá)強度高于癌旁組織，見圖2。

圖2 Western blot檢測組織ZIC5和KLF5蛋白的表達(dá)水平

2.3 結(jié)直腸癌組織ZIC5和KLF5表達(dá)與病理特征關(guān)系

結(jié)直腸癌組織ZIC5的表達(dá)情況與腫瘤分化程度、Duke’s分期、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，KLF5表達(dá)情況與腫瘤分化程度、Duke’s分期和浸潤深度有相關(guān)性(P<0.05)，見表2。

表2 結(jié)直腸癌組織ZIC5和KLF5蛋白表達(dá)與病理特征關(guān)系(n)

2.4 結(jié)直腸癌組織ZIC5和KLF5表達(dá)水平與患者預(yù)后關(guān)系

ZIC5和KLF5蛋白陰性的結(jié)直腸癌患者的DFS、OS長于陽性患者(P<0.05)，見表3，圖3。

圖3 DFS和OS生存曲線比較

表3 ZIC5和KLF5表達(dá)與結(jié)直腸癌患者DFS、 OS關(guān)系分析[M(Q1,Q3)，月]

3 討 論

隨著世界醫(yī)療水平的不斷完善，人類的平均壽命得以延長，但惡性腫瘤的發(fā)病率卻隨之不斷攀升，其中結(jié)直腸癌已經(jīng)成為影響人類生命健康的重要疾病之一。我國結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率較高，這與我國居民健康和體檢篩查意識較弱及結(jié)直腸癌臨床癥狀不特異有關(guān)[8-9]，成為限制結(jié)直腸癌預(yù)后的因素。近年來，隨著腸鏡和分子生物學(xué)等技術(shù)的進(jìn)步和深入應(yīng)用，結(jié)直腸癌的檢出率明顯提高，然而大多數(shù)患者在確診時已經(jīng)為中晚期[10-11]。因此，有必要對結(jié)直腸癌的發(fā)病、進(jìn)展及預(yù)后影響因素和機制進(jìn)行深入研究，探索結(jié)直腸癌的診斷、預(yù)后評估新指標(biāo)，治療新靶點，為改善結(jié)直腸癌患者整體預(yù)后提供新的思路和方向。

當(dāng)前外周血血清中癌胚抗原、癌抗原(CA)125、CA199等腫瘤標(biāo)志物對結(jié)腸癌患者手術(shù)根治后隨訪和評估的價值已得到廣泛認(rèn)可[12-13]。然而，受限于上述血清標(biāo)志物的靈敏度及特異度較低[14]，仍然有部分結(jié)腸癌復(fù)發(fā)病例術(shù)后血清學(xué)未能檢測出上述標(biāo)志物的升高,從而延誤術(shù)后復(fù)查影響遠(yuǎn)期生存，急需新的預(yù)后標(biāo)志物早期識別術(shù)后復(fù)發(fā)高危人群以進(jìn)行術(shù)后分層管理。通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，目前已有大量研究發(fā)現(xiàn)ZIC5在前列腺癌、肺癌和膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)[15-16]，同時楊麗等[17]研究證實ZIC5在肝癌中的表達(dá)水平升高且與疾病進(jìn)展及肝硬化有相關(guān)性，但MA等[18]通過研究發(fā)現(xiàn)胃癌與ZIC1相關(guān)，但與ZIC5無關(guān)，這說明ZIC5的表達(dá)存在著組織特異性。目前已掌握的研究認(rèn)為ZIC5可能通過以下幾個機制在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展過程中發(fā)揮作用：(1)ZIC5通過血小板源性生長因子D(PDGFD)激活FAK和STAT3，從而促進(jìn)腫瘤增殖和侵襲[19]；(2)ZIC5能夠調(diào)節(jié)Wnt-β-catentin信號通路進(jìn)而促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲和遷移[20]；(3)ZIC5蛋白抑制CCNB1基因的表達(dá)并促進(jìn)Ki67基因表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[5]。在本次研究中，經(jīng)過研究人員對比分析結(jié)直腸癌組織ZIC5的陽性率和高表達(dá)率均明顯高于癌旁組織，ZIC5表達(dá)情況與腫瘤分化程度、Duke’s分期、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有明顯關(guān)系，ZIC5蛋白陰性表達(dá)的結(jié)直腸癌患者預(yù)后明顯優(yōu)于陽性表達(dá)患者。

KLF5能夠促進(jìn)細(xì)胞的正常生長與分化，目前對于KLF5在腫瘤中的功能已有廣泛研究，通過文獻(xiàn)調(diào)研顯示KLF5在不同腫瘤中的作用不同，如在乳腺癌中KLF5能夠促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和侵襲[21]，而在食管癌中KLF5則表現(xiàn)為抑癌基因的特點[22]。在本研究中，結(jié)直腸癌組織KLF5的陽性表達(dá)率和高表達(dá)率均明顯高于癌旁組織。KLF5的表達(dá)情況與腫瘤分化程度、Duke’s分期、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有明顯關(guān)系，KLF5蛋白陰性表達(dá)的結(jié)直腸癌患者的OS和DFS明顯長于陽性表達(dá)患者。王文韜等[23]研究中也發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌腫瘤組織KLF5蛋白呈高表達(dá)，且與腫瘤的浸潤深度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征有關(guān)，其還認(rèn)為KLF5蛋白可能通過調(diào)節(jié)金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)-2、MMP-9而促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織ZIC5和KLF5的表達(dá)增強，與腫瘤的分化程度、TNM分期、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理學(xué)特征相關(guān)，ZIC5和KLF5或可作為結(jié)直腸癌患者的預(yù)后標(biāo)志物及潛在的治療靶點，但具體機制有待深入研究。