雷晶晶, 康業(yè)斌, 苗 圃, 馬君紅, 石秋環(huán)

(1.河南科技大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院；2.河南省煙草公司洛陽(yáng)市公司，河南 洛陽(yáng) 471023)

由煙草疫霉(Phytophthoraparasitica)引起的煙草黑脛病是目前煙草生產(chǎn)上危害最為嚴(yán)重的土傳真菌病害之一，該病菌在土壤中存活周期長(zhǎng)，傳播途徑廣，能侵染煙株根、莖、葉，在煙株整個(gè)生長(zhǎng)期均可發(fā)生.微生物制劑因?qū)ι鷳B(tài)環(huán)境無(wú)污染、不傷害天敵、不易產(chǎn)生抗藥性而被廣泛用于防治該病害[1-2].據(jù)報(bào)道，生物防治中對(duì)煙草疫霉具有較強(qiáng)拮抗作用的細(xì)菌主要隸屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞屬(Pseudomonas)和農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)[3-5].其中，芽孢桿菌屬抗逆性強(qiáng)，在離體環(huán)境下能夠產(chǎn)生脂肽類抗生素[6]，如伊枯草菌素[7]、生物表面活性素、豐原素和蛋白類抗菌物質(zhì)[8]，從而抑制多種病原菌生長(zhǎng).在實(shí)際生產(chǎn)中多在煙草移栽時(shí)通過(guò)穴施枯草芽孢桿菌(B.subtilis)等微生物菌劑預(yù)防煙草黑脛病的發(fā)生[9-11].微生物菌劑對(duì)病害的抑制效果和對(duì)煙株生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，很大程度上取決于其在煙株根圍土壤中及煙株體內(nèi)的定殖能力[12].學(xué)者們研究了枯草芽孢桿菌標(biāo)記菌株在番茄[13]、黃瓜[14]和煙草[15]等植物體內(nèi)的定殖能力，證實(shí)標(biāo)記菌株可以在植物體內(nèi)遷移，且定殖能力是枯草芽孢桿菌發(fā)揮生防功能的重要因素.而有關(guān)枯草芽孢桿菌標(biāo)記菌株在煙株根圍土壤中的定殖、擴(kuò)散和生存競(jìng)爭(zhēng)能力鮮有報(bào)道.

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是一種新型的標(biāo)記基因，具有熒光穩(wěn)定性，且沒(méi)有組織化學(xué)染色的擴(kuò)散效應(yīng)，已被廣泛用于細(xì)菌等物種標(biāo)記、基因表達(dá)、分子定位、蛋白質(zhì)折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)等的研究[16-17].本試驗(yàn)將GFP基因?qū)雽?duì)煙草疫霉具有較強(qiáng)拮抗作用的枯草芽孢桿菌B2菌株中構(gòu)建工程菌株B2-GFP，并對(duì)該菌株在煙株根際、根圍土壤中的定殖動(dòng)態(tài)進(jìn)行測(cè)定，為進(jìn)一步研究其抑菌機(jī)理及實(shí)際應(yīng)用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌B2菌株和煙草疫霉由河南科技大學(xué)煙草病蟲(chóng)害綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α由河南科技大學(xué)動(dòng)物科技實(shí)驗(yàn)室提供；烤煙品種LY1306種子由河南省煙草公司洛陽(yáng)市公司提供；芽孢桿菌與大腸桿菌穿梭載體pGFP4412購(gòu)自湖南豐暉生物有限公司.

試劑：十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate， SDS)，工作濃度60和70 μg·mL-1；柱式質(zhì)粒提取試劑盒、質(zhì)?；厥赵噭┖?、細(xì)菌基因組提取試劑盒均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司.

抗生素：氨芐青霉素(ampicillin， Amp)，工作濃度50 μg·mL-1；卡那霉素(kanamycin, Km)，工作濃度10 μg·mL-1.

1.2 質(zhì)粒的消除及驗(yàn)證

質(zhì)粒消除采用高溫SDS法[18-19].第1步：將接種于LB培養(yǎng)液的野生型B2菌株在37 ℃、200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)18 h.第2步：取100 μL菌液接種于含60 μg·mL-1SDS的LB培養(yǎng)液中，置于45 ℃水浴18 h，取100 μL菌液接種于盛有20 mL LB 培養(yǎng)液的50 mL三角瓶中，在37 ℃、200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)24 h.第3步：重復(fù)第2步.使用柱式質(zhì)粒提取試劑盒提取野生型菌株B2及經(jīng)SDS處理菌株的質(zhì)粒，所得產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，明確菌株質(zhì)粒的消除程度.選取質(zhì)粒條帶消失的菌株用70 μg·mL-1SDS再消除一次后，涂布于LB固體培養(yǎng)基上，待出現(xiàn)完整菌落后保存菌樣，備用.

1.3 B2-GFP工程菌株的構(gòu)建

質(zhì)粒的擴(kuò)增：在LB固體平板上活化大腸桿菌DH5α，挑取生長(zhǎng)良好的菌落劃線培養(yǎng)出多個(gè)單菌落.將大腸桿菌單菌落培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，用氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài).用熱擊法將pGFP4412導(dǎo)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌體中，接種于含有Amp、X-gal和IPTG試劑的LB固體平板上進(jìn)行擴(kuò)增，培養(yǎng)3 d后含有質(zhì)粒的菌落會(huì)與底物試劑產(chǎn)生顏色反應(yīng)，根據(jù)細(xì)菌的藍(lán)、白斑，挑選擴(kuò)增成功的白斑菌落DH5α-GFP[20]，回收其質(zhì)粒.

質(zhì)粒的導(dǎo)入：在LB固體平板上活化枯草芽孢桿菌B2菌株，挑取生長(zhǎng)良好的B2菌落劃線培養(yǎng)出多個(gè)單菌落.將B2單菌落用SDS消解后接種于B2培養(yǎng)基中培養(yǎng)至D600 nm=1.00.用氯化鈣法制備消解后的B2菌株感受態(tài)，用熱擊法將pGFP4412導(dǎo)入B2菌株的感受態(tài)菌體中，接種于含有Km、X-gal和IPTG試劑的LB固體平板上，培養(yǎng)3 d后根據(jù)細(xì)菌的藍(lán)、白斑，挑選出導(dǎo)入成功的白斑菌落B2-GFP.

工程菌株B2-GFP的分子檢驗(yàn)：將通過(guò)藍(lán)、白斑篩選的單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，在熒光顯微鏡(Leica DM 2500)下觀察菌落及菌體的熒光表征.將純化后的發(fā)光單菌落用LB液體培養(yǎng)基于37 ℃、150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)24 h，用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取其DNA作為模板，分別以GFP基因序列的3對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物信息見(jiàn)表1.PCR反應(yīng)體系：Taq PCR Master Mix 25 μL，DNA模板1 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，ddH2O 20 μL.PCR循環(huán)體系：94 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃修復(fù)延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)，保存.PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳(150 V，100 mA，20 min)檢測(cè).

表1 本研究所用引物

1.4 工程菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

在熒光顯微鏡下挑選綠色熒光的工程菌單菌落，將其轉(zhuǎn)接到含有Km(50 μg·mL-1)的LB液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液用無(wú)菌水稀釋至濃度為2×108CFU·mL-1，備用.將1 mL菌液加入100 mL含有Km(50 μg·mL-1)的LB液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng).以B2菌株為對(duì)照，每隔1 h測(cè)定工程菌株和B2菌株的D600 nm值，繪制生長(zhǎng)曲線.

1.5 工程菌株對(duì)煙草疫霉拮抗作用的測(cè)定

將煙草疫霉接種于PDA平板上，待菌落直徑至5 cm以上時(shí)，用滅菌的直徑5 mm的打孔器在菌落邊緣處取菌餅，將菌餅轉(zhuǎn)接至空的PDA平板中央，然后將工程菌株B2-GFP和野生型菌株B2分別接種于距離菌餅邊緣2.5 cm等距的4個(gè)點(diǎn)上對(duì)峙培養(yǎng).以不接細(xì)菌只接病原菌的培養(yǎng)皿為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)5次.將各培養(yǎng)皿放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～5 d，計(jì)算抑菌率.抑菌率/%=(對(duì)照病原菌半徑-對(duì)峙病原菌半徑)/對(duì)照病原菌半徑×100.

1.6 工程菌株穩(wěn)定性的測(cè)定

將工程菌株B2-GFP轉(zhuǎn)接到不含Km的LB液體培養(yǎng)基中，每隔24 h取出10 μL，涂布在含Km(10 μg·mL-1)的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔24 h挑取單菌落轉(zhuǎn)接到不含Km的LB固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，在不含Km的LB固體培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)10代后檢驗(yàn)單菌落及菌體的熒光表征[21].

1.7 工程菌株在煙株根際、根圍土壤中定殖能力的測(cè)定

1.7.1 育苗與灌根處理 將烤煙LY1306種子催芽后播種到含有營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的黑色塑料穴盤(pán)(規(guī)格：72孔)中進(jìn)行溫室培育，待煙苗長(zhǎng)至4～6片真葉時(shí)進(jìn)行間苗，每穴留1株健壯煙苗備用.將取自河南科技大學(xué)校內(nèi)試驗(yàn)田的黃壤土與蔬菜育苗基質(zhì)(總有機(jī)質(zhì)≥50%，山東莘縣益農(nóng)育苗基質(zhì)有限公司生產(chǎn))以2∶1混合，混合后土樣的pH值為7.35，一部分土樣經(jīng)121 ℃滅菌2 h制成滅菌土，另一部分不滅菌土樣為自然土.將滅菌土和自然土分別裝入花盆(規(guī)格：26 cm×20 cm)中，移栽6～8葉期的煙苗，置于塑料大棚內(nèi)培養(yǎng)，正常栽培管理.將工程菌株單菌落接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)12 h后其D600 nm=2.00，含菌量6.42×105CFU·mL-1，將菌液澆灌于移栽7 d后的煙株根部，每株澆50 mL[22].

1.7.2 土壤樣品的采集與處理 于灌根7、14、28、42、56和70 d后，取煙株根圍土和根際土進(jìn)行測(cè)定.根圍土的采集：距煙株莖基5 cm處插入直徑1.30 cm的取樣器，推出圓柱形土柱，然后收集土柱表面向下5～10 cm的土樣.根際土的采集：將煙株帶根移出花盆，抖落根部附著的大土塊后，用毛刷輕輕刷落并收集距根系表面2 mm的土樣.將采集的土樣置于室內(nèi)陰涼處風(fēng)干，剔除殘根、石塊等雜物，研磨后過(guò)10目篩(孔徑為2 mm)，用四分法收集土壤樣品，保存?zhèn)溆?

1.7.3 土壤細(xì)菌活菌數(shù)測(cè)定 通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)弱確定土壤中B2-GFP的數(shù)量可能會(huì)受到土壤中其他自發(fā)熒光微生物的影響；通過(guò)對(duì)GFP以及菌株B2序列設(shè)計(jì)多對(duì)特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)效果不理想.因此，采用稀釋平板法測(cè)定土壤細(xì)菌活菌數(shù)[23].稱取1 g土加入9 mL的試管中，然后用無(wú)菌水分別稀釋10、102、103、104、105、106倍，將各濃度的菌懸液吸取100 μL涂布于含Km(10 μg·mL-1)的LB平板上，重復(fù)5次，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，分別選擇無(wú)污染、菌落分散相對(duì)均勻的平板，觀察并標(biāo)記符合枯草芽孢桿菌形態(tài)特征的菌落后，在紫外熒光燈激發(fā)波長(zhǎng)488 nm照射下對(duì)綠色熒光菌落進(jìn)行計(jì)數(shù).計(jì)算菌落的平均數(shù)，再換算出每克干土中的細(xì)菌活菌數(shù).細(xì)菌活菌數(shù)/(CFU·g-1)=(菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×10)/干土克數(shù)[22].

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒消除菌株的驗(yàn)證

試驗(yàn)結(jié)果表明，60和70 μg·mL-1的SDS對(duì)B2菌株質(zhì)粒反復(fù)消除后致死率為98%，對(duì)B2質(zhì)粒消除效果較好.經(jīng)質(zhì)粒電泳驗(yàn)證，確認(rèn)最后一次消除菌株為質(zhì)粒消除菌株.質(zhì)粒消除菌株與野生型菌株B2相比，菌落透明，邊緣不規(guī)則(圖1).

A.野生型菌株B2菌落特征；B.質(zhì)粒消除的B2菌株菌落特征；C.質(zhì)粒凝膠電泳圖(M為Marker；1為質(zhì)粒消除菌株；2和3為野生型菌株B2).

2.2 工程菌株B2-GFP的構(gòu)建及檢測(cè)

從大腸桿菌中抽提的質(zhì)粒pGFP4412片段大小為7 000 bp，左右割膠回收產(chǎn)物熱擊導(dǎo)入質(zhì)粒消除后的枯草芽孢桿菌菌株，在含Amp及顯色底物的LB平板上培養(yǎng)后，在熒光顯微鏡下觀察到發(fā)出綠色熒光的菌落和菌體(圖2).抽提發(fā)光菌落DNA為模板，以GFP的3對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)核酸染料染色后，在紫外凝膠成像儀(BIO-RAD Gel Doc XR+)下檢測(cè)到只有引物GFP3可以擴(kuò)增出清晰的符合條件的條帶；再將野生型菌株B2與工程菌株的DNA用引物GFP3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，B2菌株沒(méi)有擴(kuò)增出相應(yīng)片段，6個(gè)工程菌株均擴(kuò)增出相應(yīng)的片段(圖3).這表明野生型菌株B2無(wú)GFP基因，且質(zhì)粒pGFP4412已經(jīng)成功導(dǎo)入野生型菌株B2中并構(gòu)建出工程菌株B2-GFP.

A.明場(chǎng)下工程菌株菌體；B.暗場(chǎng)下工程菌株菌落；C.暗場(chǎng)下工程菌株菌體；D.pGFP4412質(zhì)粒電泳(M為Marker；1～6為工程菌株B2-GFP質(zhì)粒).

A.3對(duì)GFP引物擴(kuò)增結(jié)果(M為Marker；1～3引物為GFP1；4～6引物為GFP2；7～9引物為GFP3)；B.以GFP3為引物擴(kuò)增B2與工程菌株電泳圖(M為Marker；B2為野生型枯草芽孢桿菌菌株；1～6為工程菌株).

2.3 工程菌株B2-GFP的生長(zhǎng)曲線

工程菌株B2-GFP比野生型菌株B2提前1 h進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，在培養(yǎng)11 h后同時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期(圖4).這說(shuō)明工程菌株中GFP的高效表達(dá)可能對(duì)菌株的代謝造成了一定影響，從而使其生長(zhǎng)曲線與野生型菌株略有不同.

圖4 菌株B2和B2-GFP的生長(zhǎng)曲線

2.4 工程菌株B2-GFP對(duì)煙草疫霉的拮抗作用

野生型菌株B2對(duì)煙草疫霉的抑菌率為51.00%，工程菌株B2-GFP對(duì)煙草疫霉的抑菌率為48.30%(表2).因此，外源質(zhì)粒的導(dǎo)入并未對(duì)野生型菌株B2對(duì)煙草疫霉的拮抗性產(chǎn)生顯著影響.

表2 菌株B2和B2-GFP對(duì)煙草疫霉的拮抗作用

2.5 工程菌株B2-GFP的穩(wěn)定性

工程菌株B2-GFP繼代培養(yǎng)10代后，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)其菌落及菌體仍具有較強(qiáng)熒光.

2.6 工程菌株在土壤中的定殖能力

工程菌株B2-GFP接種于滅菌土第14天，煙株根際土壤的活菌數(shù)達(dá)1.61×107CFU·g-1，之后急速下降，第28天后數(shù)值趨于穩(wěn)定；煙株根圍土壤的活菌數(shù)增長(zhǎng)平緩，第42天為3.92×106CFU·g-1，之后開(kāi)始平緩下降；接種第42天時(shí)根際和根圍的活菌數(shù)接近一致，接種第70天工程菌株B2-GFP仍保持熒光表型(圖5).

圖5 滅菌土壤中工程菌株的定殖曲線

工程菌株B2-GFP接種于自然土后，煙株根際土中的活菌數(shù)先上升后下降，在第42天達(dá)到最大值(1.46×107CFU·g-1)，且在整個(gè)取樣周期中均高于根圍土中的活菌數(shù)；根圍土中活菌數(shù)增長(zhǎng)較為平緩，無(wú)明顯的峰值，整體呈下降趨勢(shì)，并且接種第70天依舊可從土壤中檢測(cè)出熒光菌落(圖6).

3 討論與結(jié)論

生防菌的定殖能力及其動(dòng)態(tài)規(guī)律已經(jīng)成為篩選、研發(fā)生防微生物的重要參考指標(biāo)[24-25].劉郵洲等[26]通過(guò)抗生素平板回收結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡觀測(cè)標(biāo)記菌株P(guān)TS-GFP在番茄根圍的定殖數(shù)量，結(jié)果表明，標(biāo)記菌株與原始菌株P(guān)TS-394的生長(zhǎng)無(wú)明顯差異，標(biāo)記菌株在番茄根圍土壤接種30 d后，存活數(shù)量為20 CFU·g-1.本試驗(yàn)通過(guò)SDS對(duì)枯草芽孢桿菌B2菌株原生質(zhì)粒進(jìn)行消除處理，從而成功地運(yùn)用pGFP4412對(duì)B2菌株進(jìn)行了GFP標(biāo)記，且質(zhì)粒消除與外源質(zhì)粒導(dǎo)入對(duì)枯草芽孢桿菌的增殖和拮抗煙草疫霉的作用無(wú)顯著影響；同時(shí)，通過(guò)抗生素平板回收結(jié)合熒光顯微鏡觀測(cè)工程菌株B2-GFP在煙草土壤中的定殖能力.結(jié)果表明：工程菌株B2-GFP接種于滅菌土70 d后，根圍土和根際土中的活菌數(shù)分別為1.62×106和2.16×106CFU·g-1；接種于自然土70 d后，根圍土和根際土中的活菌數(shù)分別為0.83×106和2.71×106CFU·g-1.該數(shù)值大于菌株P(guān)TS-GFP在番茄根圍土壤中的定殖數(shù)量[26]，可能是由于不同作物根系分泌物的種類和含量不同而影響菌株在土壤中的定殖能力.董麗紅等[27]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌NCD-2在海島棉Pima90上的定殖能力最強(qiáng)，施用NCD-2第35天棉上的菌落數(shù)達(dá)到7.63×105CFU·g-1；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，棉花根系分泌物中的葡聚糖和脯氨酸對(duì)NCD-2生物膜形成起主要促進(jìn)作用.本試驗(yàn)構(gòu)建的工程菌株B2-GFP在煙株根際土壤中的定殖規(guī)律表現(xiàn)為先升后降再趨于穩(wěn)定，且在整個(gè)采樣期內(nèi)根際土壤細(xì)菌數(shù)量大于根圍土壤細(xì)菌數(shù)量，這是否與煙株根系分泌物有關(guān)有待進(jìn)一步研究.

綜上所述，工程菌株B2-GFP對(duì)煙草疫霉的抑菌率為48.30%；在LB液體培養(yǎng)基中較野生型菌株B2提前1 h進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，培養(yǎng)11 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期.在滅菌土壤中接種工程菌株B2-GFP第14天，煙株根際土壤活菌數(shù)達(dá)1.61×107CFU·g-1，第70天活菌數(shù)為2.16×106CFU·g-1；在自然土壤中接種該菌第42天，根際土壤活菌數(shù)為1.46×107CFU·g-1，第70天活菌數(shù)為2.71×106CFU·g-1；工程菌株在滅菌土壤和自然土壤中存活70 d仍能保持綠色熒光表型.