邱余楊, 雷雅婷, 趙 輝, 劉慶華, 劉 斌

[1.福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；3.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)；4.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002]

菌草(JUNCAO)已在國內(nèi)大面積種植及開發(fā)利用，其中巨菌草和‘綠洲一號’菌草是最為重要且應(yīng)用廣泛的菌草[1].巨菌草和‘綠洲一號’均是高大禾本科的多年生草本植物，片厚大，葉質(zhì)柔軟多汁，富含糖分、木質(zhì)素、粗蛋白和粗纖維，適口性好，易消化，成為畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖優(yōu)質(zhì)青飼料的最優(yōu)選擇[2-4].二者均具有生長速率快，產(chǎn)量高，抗逆性強(qiáng)，耐高溫、干旱、鹽堿等特點.‘綠洲一號’所具有的耐寒性對改變我國北方冬天牧草資源短缺現(xiàn)狀具有重要意義[5].

目前，已有的研究大多局限于傳統(tǒng)的菌草青貯飼料，而菌草青貯飼料發(fā)酵時間長且貯存期短，營養(yǎng)品質(zhì)不佳[6-8].生物發(fā)酵飼料是利用益生菌等微生物進(jìn)行發(fā)酵，其代謝產(chǎn)物可豐富營養(yǎng)成分，進(jìn)一步提高飼料的理化性質(zhì)及飼料營養(yǎng)和消化吸收率；調(diào)節(jié)動物腸道的微生態(tài)平衡，提高機(jī)體免疫力[9-10].生物發(fā)酵飼料還具有質(zhì)優(yōu)價廉、吸收利用率高、可替代抗生素、保護(hù)環(huán)境等功能，在生態(tài)畜牧業(yè)發(fā)展中有很好的應(yīng)用前景[11].因此，將營養(yǎng)豐富的菌草與微生物發(fā)酵技術(shù)相結(jié)合，生產(chǎn)新型菌草發(fā)酵飼料，具有很好的開發(fā)潛力.

目前，對微生物發(fā)酵菌草飼料的研究不多.因此，本研究通過探討不同菌群發(fā)酵對巨菌草和綠洲一號營養(yǎng)成分、品質(zhì)和抗氧化活性的影響，篩選出適合菌草發(fā)酵的菌群，以替代蛋白飼料，為菌草飼料的開發(fā)利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 菌草和菌種來源

‘綠洲一號’菌草和巨菌草均為高2.5 m左右2月齡的新鮮菌草，由國家菌草工程技術(shù)研究中心提供.將‘綠洲一號’和巨菌草粉碎后50 ℃下烘干，分別過20目篩，備用.玉米粉和麥麩購自河南麥德旺農(nóng)副產(chǎn)品公司.飼料發(fā)酵菌種：菌群A主要菌有乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌等；菌群B主要菌有乳酸菌、酵母菌、放線菌、嗜酸乳桿菌等；菌群C主要菌有乳酸菌屬、酵母菌、芽孢桿菌、糞腸球菌、梭菌等.3個菌群均由本實驗室篩選、保存.

1.2 試驗設(shè)計

試驗分為未滅菌巨菌草組(USJ)、滅菌巨菌草組(SJ)、未滅菌‘綠洲一號’組(USL)和滅菌‘綠洲一號’組(SL)4個大組，再向四大組中分別添加無菌蒸餾水或A、B、C菌群，其中加無菌蒸餾水參與發(fā)酵的組為對照CK，未參與發(fā)酵的組為對照CK0，共20個組，每組3個重復(fù)，共60個樣.稱取總量為250 g的發(fā)酵基料(巨菌草或‘綠洲一號’∶麥麩∶玉米粉=8∶1∶1).滅菌組樣品先經(jīng)121 ℃高壓滅菌30 min，冷卻至室溫后分別添加3種菌群(接種量為2.5%)，未滅菌組樣品也分別添加3種菌群，對照加等體積蒸餾水.混合均勻后，配置成50%含水量的發(fā)酵體系，轉(zhuǎn)移至1 L的發(fā)酵瓶中，排除空氣，壓實密封，于30 ℃培養(yǎng)箱靜置發(fā)酵12 d.

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 感官評定 發(fā)酵結(jié)束后，對飼料樣品進(jìn)行感官評定.參照農(nóng)業(yè)部的《青貯飼料質(zhì)量評定標(biāo)準(zhǔn)》[12]，觀察飼料的氣味、顏色、質(zhì)地.根據(jù)稻秸青貯飼料的氣味(15分)、色澤(15分)和質(zhì)地(10分)感官指標(biāo)進(jìn)行感官評定.其中，優(yōu)等為30～40分，良好為20～30分，一般為10～20分，差為10分以下.

1.3.2 營養(yǎng)成分測定及相對飼用價值計算 發(fā)酵結(jié)束后，取100 g樣品，65 ℃烘48 h后進(jìn)行指標(biāo)測定.干物質(zhì)(dry matter, DM)、粗蛋白(crude protein, CP)分別按照GB/T 6435—2014、GB/T 6432—2018[13-14]測定.中性洗滌纖維(neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber, ADF)、酸性洗滌木質(zhì)素(acid detergent lignin, ADL)和酸不溶灰分(acid insoluble ash, AIA)的測定，以及纖維素和半纖維素含量計算參考宋書紅[15]的方法，相對飼用價值(relative feeding quality, RFQ)計算參考文獻(xiàn)[16].

1.3.3 發(fā)酵品質(zhì)的測定 取25 g發(fā)酵飼料于三角瓶中，加入1∶9的蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍? ℃冰箱浸提24 h，再常溫水浴超聲30 min，過濾后離心(7 850 r·min-1) 10 min，取上清浸提液.部分浸提液用于測定pH值、有機(jī)酸和氨態(tài)氮(NH3-N)的含量，-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?另一部分浸提液經(jīng)旋蒸凍干后用于抗氧化測定.采用超高效液相色譜儀(Water型)測定乳酸(lactic acid, LA)、乙酸(acetic acid,AA)、丙酸(propionic acid, PA)和丁酸(butyric acid, BA)含量.色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18 1.7 μm，2.1 mm×100 mm Column, Ireland.二元梯度洗脫流動相：A為20 mmol·L-1NaH2PO4(pH為2.7)，B為甲醇；起始流動相為95%A+5%B，維持2 min；2.5 min后調(diào)為90%A+10%B，維持10 min.流速0.3 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長210 nm，進(jìn)樣量10 μL，參考文獻(xiàn)[17]進(jìn)行改良.NH3-N含量的測定采用苯酚—次氯酸鈉比色法[18].

1.3.4 體外抗氧化活性的測定 以VC為參照物，發(fā)酵產(chǎn)物水提物中-OH自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力的測定參考張雪嬌等[19]、李新[20]的方法，并作改良，計算自由基清除能力(IC50值).

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和繪圖，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計分析，采用LSD和Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析，數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌群發(fā)酵后菌草飼料的感官評定結(jié)果

依據(jù)各指標(biāo)對各試驗組進(jìn)行打分，再綜合評定發(fā)酵飼料的質(zhì)量等級(表1).各CK菌草飼料(滅菌巨菌草除外)的感官總評分均顯著高于CK0(P<0.05).與CK相比，添加菌群B和C的未滅菌巨菌草以及添加菌群C的未滅菌‘綠洲一號’飼料的感官總評分極顯著提高(P<0.01).這3組飼料等級皆為優(yōu)，其它組飼料等級皆為良好.表明菌群C改善了飼料的風(fēng)味、質(zhì)地和適口性(表1).

2.2 不同菌群發(fā)酵對菌草飼料營養(yǎng)成分的影響

由表2可知，各組別中CK菌草飼料與CK0相比，部分指標(biāo)有所改善，但無明顯差異(P>0.05).

表2 不同菌群發(fā)酵后菌草飼料中的營養(yǎng)成分1)

USJ組別中，與CK相比，添加菌群C的NDF和AIA含量分別顯著降低了2.08%和13.34%(P<0.05)，CP和RFQ含量分別極顯著提高了8.25%和5.14%(P<0.01)；添加菌群B的CP和RFQ含量分別顯著提高了4.12%和3.55%(P<0.05)，AIA和纖維素含量分別極顯著降低了13.34%和24.90%(P<0.01)；各組的DM、ADF、ADL和半纖維素的含量差異雖不顯著，但ADF和ADL含量均出現(xiàn)不同程度的下降.

USL組別中，與CK組相比，添加菌群A、B和C的ADF含量分別極顯著下降了5.25%、3.86%和4.67%(P<0.01)，而CP含量均分別極顯著提高了3.20%、4.14%和4.80%(P<0.01)；添加菌群B的半纖維素含量顯著提高了8.06%(P<0.05)；添加菌群A和B的RFQ含量分別顯著提高了6.14%和7.02%(P<0.05)；各組的DM、NDF、ADL、AIA和纖維素的含量差異不顯著.

USJ組別和SJ組別相比，SJ組別中DM、NDF、ADF、ADL、半纖維素和纖維素的含量明顯高于USJ組，而USJ組別中AIA、CP及RFQ含量高于SJ組.

USL組別與SL組別相比，USL組別中CP及RFQ含量均高于SL組，SL組其余各指標(biāo)均高于USL組.

2.3 不同菌群發(fā)酵對菌草飼料品質(zhì)的影響

由表3可知，USJ組別中，與CK0相比，各組的pH值極顯著減小(P<0.01)，其余指標(biāo)均顯著增加(P<0.05).與CK相比，添加菌群C的pH值、BA含量分別極顯著下降了2.41%、41.88%(P<0.01)，NH3-N/TN值顯著下降了10.53%(P<0.05)，LA/AA值極顯著提高了25.53%(P<0.01).

表3 不同菌群發(fā)酵后菌草飼料的品質(zhì)1)

SJ組別中，與CK相比，添加菌群A的pH值、NH3-N/TN值和AA含量均極顯著下降(P<0.01)，LA/AA值極顯著提高了18.60%(P<0.01).

USL組別中，與CK0相比，CK的pH值極顯著減小(P<0.01)，其余指標(biāo)含量均顯著增加(P<0.05).與CK相比，添加菌群A、C的pH值均極顯著減小(P<0.01)、LA/AA值極顯著提高了16.28%(P<0.01)；但添加菌群A的BA值極顯著提高了55.40%(P<0.01)，添加菌群C的BA值極顯著下降了31.22%(P<0.01).

SL組別中，與CK相比，添加菌群C的pH值極顯著減小，BA值極顯著下降(P<0.01)，LA、AA含量分別提高了65.80%、30.39%(P<0.05)，LA/AA值極顯著提高了26.67%(P<0.01).

綜合來看，添加菌群C的未滅菌巨菌草和‘綠洲一號’組能有效降低菌草發(fā)酵飼料的pH、NH3-N/TN值，提高LA/AA值，因此能明顯改善菌草飼料的品質(zhì).

2.4 不同菌群發(fā)酵對菌草飼料抗氧化性活性的影響

由圖1可以看出，分別與CK相比，USJ組中添加菌群C，SJ組中添加菌群B、C以及SL組中添加菌群A、B、C的DPPH的IC50值顯著降低(P<0.05)；SJ組中添加菌群C的-OH的IC50值顯著降低(P<0.05)；USJ組添加菌群A、B的ABTS的IC50值顯著降低(P<0.05)；其余各組的DPPH、-OH、ABTS的IC50值沒有明顯差異.

3 討論

研究[21]表明，雙孢菇菌糠經(jīng)混菌發(fā)酵后CP含量明顯提高.范恩帝等[22]研究表明，混合發(fā)酵白酒酒糟飼料明顯提高了CP含量(1.56%，35.21%)，降低了粗纖維的含量(33.11%，12.73%).李成艦等[23]研究表明，混菌發(fā)酵后的飼料中CP含量顯著提高，NDF和ADF含量顯著降低，從而提高了飼料營養(yǎng)價值.本試驗發(fā)現(xiàn)，相比發(fā)酵前后的空白對照(CK0和CK)，添加不同菌群發(fā)酵的飼料營養(yǎng)均有所改善.‘綠洲一號’和巨菌草均屬新型牧草，‘綠洲一號’莖稈更粗硬，其自身纖維和粗蛋白含量均高于巨菌草[24-25]，因而‘綠洲一號’飼料中的CP、NDF和ADF含量要高于巨菌草飼料.乳酸菌屬和糞腸球菌屬有助于將纖維物質(zhì)降解為更易吸收的小分子糖類，為微生物菌群提供糖原，促使其快速生長繁殖，加快菌體蛋白的形成，進(jìn)而提高飼料中的CP含量[26-27]，這與本研究一致.本研究結(jié)果表明添加菌群C發(fā)酵的未滅菌巨菌草和‘綠洲一號’飼料的NDF和ADF含量均下降，從而相對飼用價值提高，營養(yǎng)增強(qiáng).

飼料發(fā)酵初期，酵母菌、枯草芽孢桿菌等好氧菌進(jìn)行有氧呼吸，可降解飼料中的大分子物質(zhì)，并通過自身繁殖來提高飼料中營養(yǎng)物質(zhì)含量[28].當(dāng)體系中氧氣耗盡，則各類乳酸菌等厭氧菌快速生長，乳酸菌可消耗飼料中的可溶性糖，產(chǎn)生大量LA和AA，有效降低飼料pH值，抑制大腸桿菌、霉菌和梭菌等有害菌的增殖[29].飼料中丙酸菌會利用LA產(chǎn)生的AA和PA，二者可抑制酵母菌和霉菌繁殖，而且AA可提高飼料有氧穩(wěn)定性，縮短飼料發(fā)酵期[26,30].BA是梭菌等腐敗菌分解蛋白質(zhì)、葡萄糖和LA的產(chǎn)物，BA含量越高，發(fā)酵飼料品質(zhì)越低[31-32].NH3-N/TN值越大，蛋白質(zhì)和氨基酸被分解越多，可被動物利用的蛋白質(zhì)越少，飼料品質(zhì)越差[30,33].本研究中，滅菌巨菌草和‘綠洲一號’的pH、LA和AA的含量顯著低于未滅菌組，表明未滅菌菌草飼料品質(zhì)更優(yōu).這可能歸因于經(jīng)未滅菌的巨菌草和‘綠洲一號’中的有益好氧菌和添加菌群的協(xié)同作用，迅速耗盡發(fā)酵罐中氧氣而進(jìn)行厭氧發(fā)酵，有助于LA和AA的產(chǎn)生，縮短發(fā)酵時間.因此，未滅菌的菌草更適合作為飼料發(fā)酵原料.

飼料中若具有較高含量的抗氧化活性物質(zhì)則可有效減弱飼養(yǎng)動物的氧化應(yīng)激，增強(qiáng)動物機(jī)體的免疫功能[34-35].DPPH·、-OH·和ABTS·被廣泛用于天然活性物質(zhì)的抗氧化研究.體外抗氧化結(jié)果顯示，4個組別中添加菌群C的發(fā)酵飼料對DPPH·、-OH·、ABTS·的清除能力(IC50值)均小于1.0 mg·mL-1，ABTS·的IC50值小于0.25 mg·mL-1，表明添加菌群C后發(fā)酵飼料的提取物具有更強(qiáng)的抗氧化能力.

4 小結(jié)

本研究結(jié)果表明：添加菌群C的未滅菌巨菌草和‘綠洲一號’兩種飼料的感官評價皆為優(yōu)，可極顯著提高未滅菌巨菌草和‘綠洲一號’兩種飼料的粗蛋白含量、乳酸/丙酸值，以及未滅菌巨菌草的相對飼用價值；顯著降低pH、丁酸含量和NH3-N/TN值.未滅菌菌草更適合作為飼料發(fā)酵原料，菌群C發(fā)酵菌草飼料的營養(yǎng)品質(zhì)和體外抗氧化活性最佳.