趙 樂，李 濤

陜西省榆林市第二醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西榆林 719000

人腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率占全部顱內(nèi)腫瘤的35%～60%，全球每年約有19萬新發(fā)病患者，但僅有5%的患者生存時(shí)間超過5年，具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、病死率高以及治愈率低的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅患者生命健康[1]。目前，臨床診斷人腦膠質(zhì)瘤主要依靠影像學(xué)檢查及術(shù)后病理診斷，雖能幫助大部分患者確診，但在臨床鑒別和分級(jí)中仍存在一定局限性，影響其診斷價(jià)值[2]。隨著分子病理診斷學(xué)的發(fā)展，生物標(biāo)志物檢查被逐漸應(yīng)用于臨床診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。同源異形框基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄調(diào)控因子，具有特異性調(diào)節(jié)基因的表達(dá)作用，其中Six1在細(xì)胞增殖、分化、黏附等細(xì)胞生理功能中發(fā)揮重要作用，據(jù)臨床研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌[3]、肝癌[4]等諸多惡性腫瘤患者中存在Six1的異常高表達(dá)。胰島素樣生長因子-2(IGF2)為胚胎生長因子，近年來有研究證實(shí)IGF2的表達(dá)與腫瘤的良惡性相關(guān)，且在結(jié)直腸癌[5]、非小細(xì)胞肺癌[6]等腫瘤組織中呈高表達(dá)。本研究通過探討人腦膠質(zhì)瘤組織Six1、IGF2蛋白表達(dá)與臨床病理特征、細(xì)胞增殖和預(yù)后的關(guān)系，以期為臨床診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2018年1月在本院接受診治的人腦膠質(zhì)瘤患者切除的瘤組織80例設(shè)為觀察組，另選取同期本院收治的非腦瘤患者手術(shù)切除的腦組織40例設(shè)為對(duì)照組。對(duì)照組患者年齡15～75歲，平均(53.34±7.12)歲；男22例，女18例。觀察組患者年齡12～72歲，平均(52.63±6.75)歲；男44例，女36例。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)根據(jù)臨床癥狀、體征檢查確診為人腦膠質(zhì)瘤[7]，并行手術(shù)切除治療患者；(2)術(shù)前未進(jìn)行放療、化療治療者；(3)臨床病歷資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重心、肝、腎功能不全者；(2)合并其他惡性腫瘤者；(3)既往有精神疾病者；(4)合并有活動(dòng)性感染、血液系統(tǒng)疾病者。

1.2主要試劑 兔抗人IGF2、Six1單克隆抗體均購自美國Abcam公司，熒光定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和免疫組化試劑盒均購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3方法 采用SP免疫組化法檢測Six1、IGF2蛋白免疫反應(yīng)性。使用10%甲醇溶液固定標(biāo)本，采用石蠟包埋，將標(biāo)本切成5 μm薄片后進(jìn)行脫水處理、EDTA抗原修復(fù)液高壓修復(fù)之后，使用3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶30 min，加入1∶500濃度的兔抗人一抗4 ℃過夜。過夜取出后室溫恢復(fù)，采用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，加入兔抗人二抗37 ℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒顯色后蘇木精復(fù)染，隨后封片，整個(gè)SP免疫組化過程嚴(yán)格按照說明書操作步驟進(jìn)行。試驗(yàn)過程中，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4結(jié)果判定 Six1、IGF2蛋白陽性信號(hào)均定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，陽性細(xì)胞為呈棕黃色或棕褐色顆粒。(1)根據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行結(jié)果判定：0分為染色強(qiáng)度無色；1分為淡黃色(弱陽性)；2分為棕黃色(中等強(qiáng)度)；3分為棕褐色(強(qiáng)陽性)。(2)根據(jù)陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行結(jié)果判定：0分為陽性細(xì)胞占比0%；1分為陽性細(xì)胞占比<0%～10%；2分為陽性細(xì)胞占>10%～49%；3分為陽性細(xì)胞占>49%～75%；4分為陽性細(xì)胞占比>75%。(3)染色指數(shù)=陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分×陽性細(xì)胞百分比評(píng)分：染色指數(shù)0分為陰性表達(dá)(-)；染色指數(shù)1～2分為低陽性表達(dá)(+)；染色指數(shù)3～5分為中陽性表達(dá)(++)；染色指數(shù)>6分為高陽性表達(dá)(+++)[8]。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)與Ki-67陽性信號(hào)均位于細(xì)胞核中。PCNA、Ki-67標(biāo)記指數(shù)(LI)判斷標(biāo)準(zhǔn)：隨機(jī)選擇10個(gè)400倍視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，一共計(jì)數(shù)>1 000個(gè)細(xì)胞的基礎(chǔ)上計(jì)算LI(計(jì)數(shù)時(shí)不包括血管內(nèi)皮陽性細(xì)胞)。LI(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/總計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)×100%[9]。

1.5隨訪 采用電話聯(lián)系或者門診復(fù)查的方式對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行36個(gè)月的隨訪，隨訪時(shí)間至2021年1月。將患者第1次手術(shù)時(shí)間至死亡日期或隨訪截止日期視為總生存時(shí)間(OS)。

2 結(jié) 果

2.1兩組Six1、IGF2蛋白陽性表達(dá)情況比較 觀察組Six1、IGF2蛋白陽性表達(dá)率均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見表1、表2。

表1 兩組Six1蛋白陽性表達(dá)情況比較[n(%)]

表2 兩組IGF2蛋白陽性表達(dá)情況比較[n(%)]

2.2人腦膠質(zhì)瘤組織Six1、IGF2蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 Six1、IGF2蛋白陽性表達(dá)在人腦膠質(zhì)瘤患者不同病理類型、腫瘤最大徑、腫瘤病理分級(jí)、年齡、性別之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Six1、IGF2蛋白陽性表達(dá)率在人腦膠質(zhì)瘤患者不同腫瘤分化程度間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且腫瘤分化程度越低，Six1、IGF2蛋白陽性表達(dá)率越高(P<0.05)，見表3。

表3 Six1、IGF2蛋白表達(dá)與人腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3人腦膠質(zhì)瘤組織Six1、IGF2蛋白表達(dá)與Ki-67 LI、PCNA LI的關(guān)系 Six1蛋白陽性表達(dá)患者的Ki-67 LI、PCNA LI均明顯高于Six1蛋白陰性表達(dá)患者(P<0.05)，且隨著Six1蛋白陽性表達(dá)程度的增加，Ki-67、PCNA LI隨之升高(P<0.05)，見表4。

表4 人腦膠質(zhì)瘤組織Six1、IGF2蛋白表達(dá)與Ki-67 LI、PCNA LI的關(guān)系

2.4Six1與IGF2蛋白在人腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)水平的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Six1與IGF2蛋白在人腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.399，P<0.05)。

2.5人腦膠質(zhì)瘤組織Six1、IGF2蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 3年的隨訪結(jié)束后共獲訪76例，失訪4例，76例患者中死亡41例，生存35例。Six1蛋白陰性表達(dá)患者的生存率為62.96%(17/27)，高于Six1蛋白陽性表達(dá)患者的36.73%(18/49)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=4.029，P=0.045)；IGF2蛋白陰性表達(dá)患者的生存率為57.50%(23/40)，高于IGF2蛋白陽性表達(dá)患者的33.33%(12/36)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankχ2=4.903，P=0.027)。

2.6COX回歸分析人腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響因素 建立COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型(逐步后退法，α保留=0.05，α剔除=0.10)，以人腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后狀況為應(yīng)變量，賦值1=死亡，0=生存，t=生存期。自變量為腫瘤分化程度、IGF2蛋白表達(dá)情況、Six1蛋白表達(dá)情況，賦值見表5?；貧w結(jié)果顯示，低腫瘤分化程度、IGF2陽性表達(dá)、Six1陽性表達(dá)均是影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表6。

表5 COX回歸自變量賦值情況

表6 人腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響因素分析

3 討 論

人腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見惡性腫瘤，發(fā)病率占成人顱內(nèi)腫瘤的40%，其以浸潤性方式生長，導(dǎo)致手術(shù)治療難以完全切除瘤體，治療效果差，患者具有較高的病死率[10-11]。隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，研究者逐漸開始從腫瘤組織蛋白質(zhì)分子表達(dá)等角度進(jìn)一步了解膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制，為臨床進(jìn)行生物靶點(diǎn)治療或判斷膠質(zhì)瘤患者預(yù)后提供參考。Six是一類特殊的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與調(diào)控特異性基因表達(dá)，Six1作為Six家族的重要成員，在乳腺癌中可通過HBO1和AIB1組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)糖酵解，促進(jìn)體外和體內(nèi)的Warburg效應(yīng)和腫瘤生長[12]。胰島素樣生長因子(IGF)是一類功能細(xì)胞調(diào)控因子，其分泌細(xì)胞廣泛分布在人體肝、腎、肺、腦等組織中，IGF2是肝臟和許多其他組織產(chǎn)生的一種相對(duì)分子質(zhì)量為7.5×103的肽，具有家族一系列典型生物學(xué)特性，對(duì)細(xì)胞的增殖分化發(fā)揮一定作用[13]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人腦膠質(zhì)瘤患者Six1、IGF2蛋白陽性表達(dá)率均明顯高于同期非腦瘤患者，呈高水平表達(dá)；低分化人腦膠質(zhì)瘤患者Six1、IGF2蛋白陽性表達(dá)率明顯高于中、高分化人腦膠質(zhì)瘤患者。提示人腦膠質(zhì)瘤分化程度越低，Six1、IGF2蛋白陽性表達(dá)率越高，進(jìn)一步提示Six1、IGF2蛋白表達(dá)與人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。這可能與兩者在細(xì)胞的增殖、分化、遷移、黏附、凋亡中發(fā)揮重要作用有關(guān)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，過度表達(dá)的Six1能夠逆轉(zhuǎn)由過度表達(dá)的微小RNA(miR)-155-3p誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡所引起的細(xì)胞周期分布、增殖，而miR-155-3p可通過調(diào)節(jié)Six1的表達(dá)，促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的進(jìn)展[14]。王文斐等[15]的研究表明，IGF2在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的作用，且其表達(dá)隨著病理分級(jí)的增加而升高。

腫瘤細(xì)胞增殖是反映腫瘤惡性程度的重要指標(biāo)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，細(xì)胞的惡性增殖是腫瘤的重要特征。PCNA、Ki-67均為增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，能夠有效反映細(xì)胞增殖的活躍程度[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Six1、IGF2蛋白陽性表達(dá)患者Ki-67 LI、PCNA LI均明顯高于其陰性表達(dá)患者，且隨著Six1、IGF2蛋白陽性表達(dá)程度增加，Ki-67 LI、PCNA LI隨之升高。提示Six1、IGF2蛋白表達(dá)與人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活躍程度密切相關(guān)，在腫瘤細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用。Six1基因主要定位于人染色體14q23上，產(chǎn)物蛋白由同源異型結(jié)構(gòu)域N-末端與Six結(jié)構(gòu)域組成，與DNA特定結(jié)合后調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)[17]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Six1是轉(zhuǎn)錄因子E2F1的轉(zhuǎn)錄靶基因，將轉(zhuǎn)錄活性維持在有絲分裂早期，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化等方面起重要的作用，Six1蛋白在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，活化細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤，從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[18]。IGF2基因?yàn)閮?nèi)源性印記基因，據(jù)研究證實(shí)，IGF2基因的印跡丟失易引起IGF2蛋白過度表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化[19]。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，Six1、IGF2蛋白陽性表達(dá)患者隨訪3年的生存率明顯低于Six1蛋白陰性表達(dá)患者(P<0.05)。COX回歸分析結(jié)果顯示，低腫瘤分化程度、IGF2陽性表達(dá)、Six1陽性表達(dá)均是影響人腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。提示Six1、IGF2蛋白可作為評(píng)估患者預(yù)后的有效指標(biāo)，對(duì)患者預(yù)后有顯著影響，Six1、IGF2蛋白陽性表達(dá)患者的預(yù)后較差。LI等[12]也證實(shí)了Six1可以通過調(diào)節(jié)糖酵解促進(jìn)腫瘤生長。IGF2蛋白通過與受體結(jié)合介導(dǎo)RELA/p65、MAPK/ERK/Raf/Ras等通路，經(jīng)甲硫氨酸腦啡肽信號(hào)傳導(dǎo)上調(diào)腫瘤細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子水平，對(duì)調(diào)節(jié)腫瘤組織血管生成起到關(guān)鍵作用，從而促進(jìn)腫瘤的生長、浸潤，患者往往預(yù)后不良[20]。本研究Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，Six1與IGF2蛋白在人腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.05)。提示Six1、IGF2蛋白兩者在人腦膠質(zhì)瘤患者組織的表達(dá)情況可作為判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物，二者聯(lián)合檢測可能成為人腦膠質(zhì)瘤生物標(biāo)記的新指標(biāo)，亦可能成為人腦膠質(zhì)瘤基因治療的潛在靶點(diǎn)，為臨床制訂更為合理和有效的治療方案提供依據(jù)。

綜上所述，Six1、IGF2蛋白在人腦膠質(zhì)瘤患者組織中呈高表達(dá)，且腫瘤分化程度越低，腫瘤細(xì)胞增殖越活躍，Six1、IGF2蛋白陽性表達(dá)率越高。Six1、IGF2蛋白陽性表達(dá)患者的生存期較短，預(yù)后較差。