司 璐，吳 彤，甄錦程，于洪佳，劉 瑤，楊 驍，徐利劍

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

真菌是世界上分布最廣泛的物種之一，也是生態(tài)環(huán)境中重要的分解者，森林凋落物中有大量真菌存在。真菌資源已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)和醫(yī)藥等與人類生活息息相關(guān)的多個(gè)重要領(lǐng)域[1-3]。真菌物種多樣性豐富，能夠產(chǎn)生活性多樣、結(jié)構(gòu)新穎的次生代謝產(chǎn)物，是天然產(chǎn)物的重要來源[4]。目前已從真菌的代謝產(chǎn)物中提取出多種具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等功能的活性物質(zhì)[5-9]。

森林中大量的林下凋落物，需要微生物降解利用，凋落物真菌在其中發(fā)揮著重要的作用[10]。大興安嶺森林處于高緯度寒區(qū)，是中國森林面積最大的森林之一，其中包含許多未被利用的真菌資源[11-15]。例如，劉博洋等[12]在大興安嶺森林凋落物中發(fā)現(xiàn)的未開發(fā)真菌中，2株表現(xiàn)出抗細(xì)菌活性，2株表現(xiàn)出抗氧化活性。張哲棟等[13]在18株未被開發(fā)真菌中，發(fā)現(xiàn)5株真菌對(duì)青枯勞爾氏菌有抗菌活性。邱天藝等[14]在21株未被開發(fā)真菌中，發(fā)現(xiàn)有17株真菌表現(xiàn)出了抗菌活性。孟建宇等[15]分離得到2株具有高纖維素酶活的常溫纖維素降解菌。近年來，在真菌中發(fā)現(xiàn)了許多新的生物堿類、聚酮類、萜類、苯丙素類、甾體類等次生代謝產(chǎn)物，在抗菌、抗蟲、抗氧化、抗癌等方面發(fā)揮著重要作用[16-19]。大興安嶺森林凋落物中真菌資源豐富，有望發(fā)現(xiàn)未被開發(fā)利用的真菌，為真菌次生代謝產(chǎn)物研究提供備選菌株。

本研究以大興安嶺凋落物為材料，從中分離出可培養(yǎng)真菌并對(duì)其進(jìn)行鑒定，對(duì)它們次生代謝物進(jìn)行抗菌、抗氧化活性測試，為進(jìn)一步開發(fā)利用大興安嶺真菌資源提供備選菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集 凋落物樣品于2019年9月采自大興安嶺地區(qū)。該地區(qū)主要的植物為興安落葉松(Larix gmelinii)，白樺(Betula platyphylla)與蒙古櫟(Quercus mongolica)等。凋落物樣品的采集以每層約10 cm的深度共采集三層。將采集好的樣品分別裝在滅菌的信封里，自然風(fēng)干保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)用于真菌純化及形態(tài)學(xué)觀察，每升配方如下：葡萄糖20 g、馬鈴薯200 g、瓊脂20 g。1/4馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(1/4 PDA)用于真菌分離：馬鈴薯50 g、葡萄糖5 g、瓊脂20 g。

以下培養(yǎng)基用于發(fā)酵。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g。馬鈴薯葡萄糖加煙酰胺培養(yǎng)基(PD+Nic)：煙酰胺濃度為100 μg/mL的PD培養(yǎng)基。大米培養(yǎng)基(Rice)：甘油2 g，酵母浸粉2 g，酒石酸鈉10 g，磷酸二氫鉀1 g，七水硫酸鎂1 g，七水硫酸亞鐵0.05 g溶解于1 L水中，獲得配方溶液；50 mL三角瓶中需稱取8.4 g大米和14 mL配方溶液。酵母提取物蔗糖培養(yǎng)基(YES)：酵母浸粉20 g、蔗糖100 g、硫酸鎂1 g、加入適量蛭石。超級(jí)麥芽培養(yǎng)基(SM)：麥芽浸粉50 g、酵母浸粉10 g、七水硫酸亞鐵20 mg、七水硫酸鋅7 mg。

細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基(LBA)用于抗細(xì)菌活性測定：胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化鈉10 g、瓊脂20 g。PDA用于抗真菌活性測定。

1.1.3 供試微生物 丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)，青枯勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)，立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)和大斑病凸臍蠕孢菌(Exserohilum turcicum)用于抗菌活性測試。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 真菌的分離 采用顆粒涂布平板法[20]進(jìn)行真菌分離。首先將凋落物研磨至顆粒狀，然后將凋落物顆粒懸浮液涂布于1/4 PDA平板上，放置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每12 h觀察一次，在體式顯微鏡下，挑出萌發(fā)的真菌至60 mm的PDA培養(yǎng)基上，進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.2 真菌的鑒定 利用CTAB法[21]提取分離得到的真菌總DNA，然后用引物ITS1和ITS4[22]擴(kuò)增其內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer，ITS)，其中PCR擴(kuò)增的體系和條件參見Liang等[20]的方法。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后，得到的序列與NCBI網(wǎng)站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)進(jìn)行序列分析，初步確定該凋落物真菌的分類學(xué)地位。對(duì)活性較好的菌株與其相關(guān)的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析，利用MEGA 7測試出其最優(yōu)模型后，利用最大似然法(Maximum Likelihood，ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。形態(tài)學(xué)觀察方面，觀察在不同培養(yǎng)基上的菌落特征，例如菌落顏色、質(zhì)地和分泌物等特征；觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子的形狀、大小等特征。

1.2.3 菌株的發(fā)酵及其粗提物的制備 將菌塊接種于PD培養(yǎng)基中，在180 r/min，25℃條件下振蕩培養(yǎng)3～4天，然后吸取200μL上述菌液，分別接種到20 mL體系的PD、PD+Nic、YES、SM、Rice以及PDA中進(jìn)行發(fā)酵。固體發(fā)酵21天，液體發(fā)酵在180 r/min，25℃條件下培養(yǎng)14天。將發(fā)酵完成后的培養(yǎng)基中放入等量的乙酸乙酯，靜置24 h，獲得有機(jī)相，將其進(jìn)行濃縮后稱重，加入1 mL的10%的二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，配置成真菌提取液。

1.2.4 抗菌活性測定 采用打孔藥劑擴(kuò)散法[23]進(jìn)行抗菌活性的篩選?？辜?xì)菌：取10 mL測試細(xì)菌液加入到溫度在50℃的LBA中倒平板，用無菌打孔器均勻的打7個(gè)孔?？字屑尤?0 μL真菌提取液或100 mg/L金霉素（陽性對(duì)照），培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈?？拐婢簩⒔z狀真菌接種至PDA的正中央，在其周圍均勻地打7個(gè)孔，孔中加入10 μL真菌提取液或100 mg/L兩性霉素b（陽性對(duì)照），將其放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5天后，測量抑菌圈。

1.2.5 抗氧化活性測定 采用TLC-DPPH法[24]進(jìn)行抗氧化活性的篩選。稱取0.2 g的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，溶解在100 mL的甲醇中。將粗提物配制成5 mg/mL的甲醇溶液。用毛細(xì)管吸取等量的樣品，點(diǎn)樣后噴灑DPPH溶液，觀察褪色圈。將活性較好菌株的粗提物進(jìn)行進(jìn)一步分析。用毛細(xì)管取等量的樣品點(diǎn)樣于層析板下部，利用甲醇二氯甲烷1:10的展開劑展開，然后噴灑DPPH溶液，計(jì)算活性組分的遷移率(Rf)值。

2 結(jié)果分析

2.1 菌株鑒定分離結(jié)果

從大興安嶺凋落物中共分離得到65株真菌，通過ITS序列與已鑒定的真菌進(jìn)行比對(duì)分析的結(jié)果詳見表1。這65株真菌隸屬于2個(gè)門，6個(gè)綱，28個(gè)科，47個(gè)屬54個(gè)分類單元，去除重復(fù)分離得到的菌種，其中有16株真菌ITS的相似性≤98%。

表1 疑似新種的ITS序列相似性分析

2.2 抗菌活性測定結(jié)果

對(duì)這16株相似性≤98%的菌株的乙酸乙酯粗提物進(jìn)行抗菌活性測定。其中有8株真菌的粗提物具有抗細(xì)菌的活性見表2，其中SL723和SL098的對(duì)青桔勞爾氏菌的活性較好，只有SL098有抗丁香假單胞菌的活性。

表2 真菌提取物的抗細(xì)菌活性

有10株真菌的粗提物有抗病原真菌的活性，測定結(jié)果詳見表3。其中有7株菌有抗立枯絲核菌的活性，有6株菌的粗提物有抗大斑病凸臍蠕孢菌的活性。其中SL098、SL503、SL710和SL723這4株菌的粗提物對(duì)這2種病原真菌都有活性。

表3 真菌提取物的抗真菌活性

2.3 抗氧化活性測定結(jié)果

通過TLC-DPPH法進(jìn)行了抗氧化活性測定（圖1a）。其中具有抗氧化活性的菌株共有6株，SL098、SL503和SL723的抗氧化活性較強(qiáng)，詳細(xì)結(jié)果詳見表4。

表4 真菌提取物的抗氧化活性

將SL098的YES和大米培養(yǎng)基粗提物（圖1b），SL503的PD和PDA粗提物（圖1c），SL723的PD和大米培養(yǎng)基粗提物（圖1d）進(jìn)行了TLC分析。SL098的YES和大米培養(yǎng)基粗提物中有兩條明亮的帶，Rf值分別為0.73與0.80。SL503的PD和PDA粗提物有兩條明亮的帶，Rf值分別為0.71與0.78。SL723的PD和Rice粗提物有一條帶，Rf值為0.84。對(duì)于這3株菌來說，相同菌株不同培養(yǎng)基的抗氧化化合物的數(shù)量與種類基本一致，但不同菌株可以產(chǎn)生不同的抗氧化化合物。

2.4 活性菌株的鑒定

菌株SL098在PDA上培養(yǎng)14天后的生長直徑為46 mm（圖2a）；菌落正面中間淺棕色，邊緣灰綠色，菌落背面中間紅棕色，邊緣灰綠色；氣生菌絲短絨毛狀，菌落的表面有橙色分泌物。菌株SL503在PDA上培養(yǎng)14天后的生長直徑為13 mm（圖2b）；菌落的正面為白色，背面為乳白色；氣生菌絲不發(fā)達(dá)，絨毛狀，表面濕潤。菌株SL723在PDA上培養(yǎng)14天后的生長直徑為14 mm（圖2c）；菌落正面白色，有放射狀溝紋，邊緣紅棕色、嚙蝕狀，背面紅棕色；氣生菌絲短絨毛狀。將這3株菌與其相關(guān)菌屬進(jìn)行ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育分析（圖3），SL098、SL503和 SL723這 3株菌分別與Phaeosphaeria、Cephalosporium和Ophiobolus這3個(gè)屬最為相近，見圖3。

圖2 3株菌的菌落圖片（a為SL098，b為SL503，c為SL723）

圖3 3株菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

3 討論與結(jié)論

本研究從大興安嶺森林凋落物中分離得到65株真菌，共有47個(gè)屬54個(gè)分類單元，其中有16株真菌的相似性≤98%，其中8株真菌有抗細(xì)菌活性，10株真菌有抗真菌活性，6株真菌同時(shí)具有抗細(xì)菌、抗真菌的活性。有6株真菌的粗提物有抗氧化活性。其中SL098、SL503、SL723這3株菌的粗提物對(duì)抗真菌、抗細(xì)菌和抗氧化方面都表現(xiàn)出來良好的活性。李澤宇[25]等曾在凍土中發(fā)現(xiàn)2株凋落物真菌同時(shí)具有抗真菌、細(xì)菌與抗氧化活性，本研究發(fā)現(xiàn)的這3株菌與其分類學(xué)地位不同。劉博洋等[12]在凋落物中分離得到2株抗菌活性較好的菌株，最相近菌屬為Pyrenochaetopsis microspora和Helicoma monilipes和這3株菌隸屬于不同的科，有明顯的差異。分離2株抗氧化活性較好的菌株為LB0012和LB0022，分別隸屬于Helotiaceae和Phaeosphaeriaceae這2個(gè)科，其中LB0022和SL098、SL723為同一個(gè)科的不同屬。

SL098最相近菌為Phaeosphaeria屬真菌，該屬的P.nodorum、P.spartinae、P.rousseliana和P.avenaria等菌曾被報(bào)道過具有抗稻瘟病(Pyricularia oryzae)，水稻紋枯病，小麥銹病(Puccinia recondita)，黃瓜灰霉病(Botrytis cinerea)和馬鈴薯晚疫病(Phytophthora infestans)的活性，對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等陽性細(xì)菌有較好的活性，分離過聚酮類、異香豆素、苝醌類、萜類等10多種抗菌活性的化合物[26]；本研究首次發(fā)現(xiàn)該屬真菌還具有抗大斑病凸臍蠕孢菌及抗革蘭氏陰性菌（丁香假單胞與青枯勞爾氏菌）的活性。SL503最相近菌為頭孢菌(Cephalosporium)屬真菌，該屬真菌曾被報(bào)道過具有抗氧化活性及抗菌活性，可以產(chǎn)生頭孢菌素等抗菌化合物[27-29]，不排除SL503也可以產(chǎn)生同類抗菌化合物，但SL503與其最相近菌株的ITS相似性為92.03%，可能為新物種。SL723最相近菌屬為Ophiobolus屬，該屬的O.vermisporis曾被報(bào)道過對(duì)擬桿菌屬(Bacteroides)細(xì)菌有較好的活性，該屬的其他菌也曾報(bào)道過對(duì)胡麻葉斑病(Cochliobolus miyabeanus)的抗菌活性，分離得到過Vermisporin和Ophiobolide等抗菌化合物[30-31]，未曾報(bào)道過抗氧化活性。

綜上所述，大興安嶺凋落物真菌中還存在著多種抗菌與抗氧化資源，本研究發(fā)現(xiàn)了3株凋落物真菌同時(shí)具有抗菌及抗氧化活性，為凋落物真菌資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了參考與備選菌株。