姜樂(lè)，王曉兵，賀爾姝，鄭曉燁，龔志婷

(大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖教研室，云南 大理 671000)

突觸可塑性是神經(jīng)元突觸連接長(zhǎng)時(shí)間改變的能力[1]。DNA甲基化是指DNA的胞嘧啶被甲基化修飾，從而影響其轉(zhuǎn)錄，改變下游靶基因表達(dá)情況。DNA胞嘧啶甲基化通過(guò)協(xié)調(diào)適應(yīng)性基因表達(dá)和神經(jīng)元可塑性，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的早期發(fā)育階段發(fā)揮關(guān)鍵作用，并在基因印跡及轉(zhuǎn)錄調(diào)控，神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)元可塑性，學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知、抑郁癥等情況中都有重要作用[2-6]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)在有絲分裂后的神經(jīng)元中大量存在[7]。研究[8-9]表明，DNMTs與突觸可塑性、認(rèn)知應(yīng)激行為調(diào)控有相關(guān)性，且前腦缺失DNMT1具有抗焦慮和抗抑郁的作用。

RG108 是一種非核苷類(lèi)小分子藥物，DNMTs抑制劑可以通過(guò)直接結(jié)合并抑制甲基轉(zhuǎn)移酶的活性位點(diǎn)，而瞬時(shí)阻斷DNMTs活性，重新激活表觀沉默基因[10]。RG108主要與DNMT1結(jié)合，也可能與DNMT3a結(jié)合[11]。研究表明，RG108可以緩解噪音引起的神經(jīng)損傷[12]，且DNMT1缺失具有抗抑郁、焦慮作用[9]，提示RG108在神經(jīng)損傷相關(guān)疾病和抑郁/焦慮相關(guān)疾病中可能有潛在的治療價(jià)值，所以RG108在神經(jīng)細(xì)胞中的作用值得進(jìn)一步研究。目前對(duì)DNMTs抑制劑藥理作用的研究主要集中在抗腫瘤等方面，對(duì)其在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用機(jī)制研究甚少。本實(shí)驗(yàn)探究RG108對(duì)小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22生長(zhǎng)及突觸可塑性相關(guān)基因的影響，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)RG108在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 HT22 細(xì)胞

小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系 HT22。

1.1.2 藥物與試劑

RG108(N-Phthalyl-L-tryptophan)(美國(guó)Sigma-Aldrich，商品號(hào)R8279，批號(hào) #00000743370)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司，商品號(hào) C1195500BT，批號(hào) 8121437)；胎牛血清(FBS，商品號(hào) 10270—106，批號(hào) 42H9852K)；CCK-8(碧云天，商品號(hào) C0042，批號(hào) 031521211214)；胰蛋白酶(中國(guó)上海源培生物科技股份有限公司，商品號(hào) S320KJ，批號(hào) G120901)；細(xì)胞凍存液(NCM Biotech，商品號(hào) NOc40100，批號(hào)20210529)；RNA提取試劑盒(購(gòu)自生工生物，商品號(hào) B511361—0020，批號(hào) G825KA6755)；cDNA合成試劑盒(購(gòu)自生工生物，商品號(hào) B532435—0010，批號(hào) H416KA9631)； 兩步法RT-qPCR檢測(cè)試劑盒(promega GoTaq?qPCR Master Mix，商品號(hào) A600A，批號(hào) 0000463011)。

1.1.3 主要儀器

酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào) 19152)；RT-qPCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào) IMark Microplate Reader)；倒置相差顯微鏡(日本 Nikon公司)；恒溫 CO2培養(yǎng)箱(德國(guó) BINDER 公司，型號(hào) 12-12299)；902超低溫冰箱(美國(guó)Thermo Fisher公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取凍存的HT22細(xì)胞于37 ℃水浴中復(fù)蘇，加入9 mL含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，5 h后換液；待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按1︰2傳代，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞用藥的配制

將10 mg RG108溶于2 mL DMSO中配成5 mg/mL的儲(chǔ)存液，并通過(guò)0.22 μm濾過(guò)膜過(guò)濾，使用前用DMEM高糖完全培養(yǎng)基配成0.5、5、50 μmol/L的工作液，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

CCK-8實(shí)驗(yàn)將HT22海馬神經(jīng)元細(xì)胞分為空白對(duì)照組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，將細(xì)胞混懸液調(diào)整至2×103個(gè)/mL的密度接種至三個(gè)96孔板中，空白對(duì)照組(無(wú)細(xì)胞)、對(duì)照組(細(xì)胞，未加藥物組)、實(shí)驗(yàn)組(細(xì)胞，0.5 μmol/L、5 μmol/L、50 μmol/L梯度加藥組)。

RT-qPCR實(shí)驗(yàn)將HT22海馬神經(jīng)元細(xì)胞分為空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，將細(xì)胞混懸液調(diào)整至1×106個(gè)/mL的密度接種至6孔板中，空白對(duì)照組(細(xì)胞，完全培養(yǎng)基)、溶劑對(duì)照組(細(xì)胞，DMSO為總體積的0.01%、完全培養(yǎng)基)、實(shí)驗(yàn)組(細(xì)胞，培養(yǎng)基、50 μmol/L RG108)。藥物作用24 h后提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后行RT-qPCR(根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作)。

1.2.4 CCK-8 法檢測(cè) HT22 細(xì)胞增殖(根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作)

待細(xì)胞長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，0.25%胰酶消化細(xì)胞，2×103個(gè)/孔的密度均勻接種于96孔板，置于培養(yǎng)箱中24 h。實(shí)驗(yàn)分組與1.2.3中CCK-8分組相同；培養(yǎng)24、48、72 h，相應(yīng)作用時(shí)間結(jié)束，棄去各組培養(yǎng)基，每孔加100 μL檢測(cè)液(90 μL培養(yǎng)基+10 μL CCK-8試劑)，避光放于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，反應(yīng)2.5 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè) 450 nm 處的吸光度。細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組吸光度均值-空白組吸光度均值)/(對(duì)照組吸光度均值-空白組吸光度均值)×100%。選擇最適的作用時(shí)間和抑制劑濃度為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的抑制劑作用條件。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)基因表達(dá)量

培養(yǎng)HT22 海馬神經(jīng)元，傳至第3 代細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后加入 RG108 50 μmol/L作用24 h，提取RNA。引物采用oligo 7設(shè)計(jì)，反應(yīng)條件按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，檢測(cè)RNA濃度后，使用1 μg RNA 樣品逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR Green 熒光法進(jìn)行 RT-qPCR，觀察突觸可塑性相關(guān)性基因的表達(dá)情況。

表2 RT-qPCR的反應(yīng)體系

表3 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)方案

1.2.6 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 RG108對(duì)HT22細(xì)胞增殖率的影響

CCK-8結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，經(jīng)RG108作用48 h后，5 μmol/L組和50 μmol/L組的 HT22 細(xì)胞活力顯著增加(P<0.05)，且呈濃度梯度依賴(lài)性；RG108處理72 h后50 μmol/L組HT22細(xì)胞活力增加(P<0.05)，0.5 μmol/L組和5 μmol/L組HT22細(xì)胞活力無(wú)明顯增加，證明50 μmol/L RG108在48 h、72 h均能促進(jìn)神經(jīng)元增殖，見(jiàn)圖1—2，表4。

圖1 RG108處理后細(xì)胞形態(tài)圖(10×)

圖2 RG108對(duì)HT22細(xì)胞增殖的影響

2.2 RG108對(duì)HT22細(xì)胞突觸可塑性相關(guān)基因表達(dá)的影響

50 μmol/L RG108處理24 h后，使用RT-qPCR方法對(duì)突觸可塑性相關(guān)的幾個(gè)基因(nr2b、nr2c、nr2d、nr1、bdnf、reln)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，nr2c和nr2d有表達(dá)量上升的趨勢(shì)但不顯著，而nr1和reln顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表5，圖3。

圖3 50 μmol/L RG108處理24 h對(duì)基因nr2b、nr2c、nr2d、nr1、bdnf、reln表達(dá)的影響

3 討論

表觀遺傳學(xué)是在不改變DNA序列的情況下，因環(huán)境不同而改變基因的表達(dá)修飾，從而改變遺傳性狀[13]。DNA甲基化是一種關(guān)鍵的表觀遺傳學(xué)機(jī)制，一般情況下涉及5甲基胞嘧啶的DNA甲基化被稱(chēng)為DNMTs的共價(jià)修飾，其可以通過(guò)阻止RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，誘導(dǎo)基因長(zhǎng)期表達(dá)變化(通常沉默，但偶爾激活，取決于作用的區(qū)域)[14]。DNA胞嘧啶被甲基化修飾，使基因組遺傳信息更加豐富多彩且具有可塑性。DNA甲基化在體內(nèi)還是一種負(fù)反饋機(jī)制，當(dāng)機(jī)體異常時(shí)會(huì)打破這種平衡，使沉默的DNA及激活的DNA表達(dá)異常[2]。研究[15-18]已經(jīng)證明，DNMTs在記憶形成中的重要性。本研究為進(jìn)一步了解DNA甲基化在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用、開(kāi)發(fā)DNA甲基化相關(guān)的精神疾病治療方案提供了理論依據(jù)。

DNMT1和DNMT3a對(duì)于海馬神經(jīng)元的增殖有調(diào)控作用[19]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示，DNMTs抑制劑RG108對(duì)HT22細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，且呈濃度依賴(lài)遞增，50 μmol/L RG108在48 h、72 h均對(duì)HT22細(xì)胞有促進(jìn)增殖作用。促進(jìn)神經(jīng)元的增殖可以在一定程度上保持海馬神經(jīng)元的數(shù)目，進(jìn)而促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的學(xué)習(xí)記憶能力[2,7]。

本實(shí)驗(yàn)還證明了RG108抑制DNA甲基化后可使突觸可塑性相關(guān)基因reln、nr1低表達(dá)，這一結(jié)果和Dong等[20]在精神分裂癥模型鼠中得到的結(jié)果一致。由于抑制DNMTs通常預(yù)期的結(jié)果應(yīng)該是增強(qiáng)基因的表達(dá)，但是RG108卻對(duì)reln、nr1造成了抑制，考慮可能是因?yàn)镽G108抑制DNA甲基化后中間還有其他靶點(diǎn)調(diào)控使reln和nr1基因低表達(dá)。由于reln在軸突生長(zhǎng)和學(xué)習(xí)記憶中的重要作用，所以RG108可能對(duì)學(xué)習(xí)記憶造成影響。

一些研究表明，RG108通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié) “改善”了認(rèn)知，如Dong 等[20]證明了RG108側(cè)腦室給藥可以糾正甲基化富集，突觸可塑性相關(guān)基因與DNMTs結(jié)合增加，突觸可塑性相關(guān)基因表達(dá)降低，改善小鼠的精神分裂樣行為缺陷。RG108急性給藥可以改善抑郁行為，RG108直接靶向DNMTs觸發(fā)抗抑郁作用，從而抑制應(yīng)激誘導(dǎo)的DNA甲基化，降低突觸可塑性相關(guān)基因的甲基化水平，促進(jìn)了快速抗抑郁作用[6]。RG108急性給藥在物體模式分離(object pattern separation，OPS)具有短暫的促進(jìn)認(rèn)知作用，靶向促進(jìn)bdnf1增加[21]。RG108可以改善強(qiáng)迫癥行為，可以導(dǎo)致至少1周的明顯癥狀改變和蛋白磷酸酶活性異常變化的完全逆轉(zhuǎn)[14]。本研究表明，RG108可能是通過(guò)影響神經(jīng)元的增殖和突觸可塑性相關(guān)基因(reln、nr1)達(dá)到對(duì)小鼠行為的改善作用。

總之，DNMTs抑制劑RG108能促進(jìn)海馬神經(jīng)元的增殖。并且可以通過(guò)抑制DNA甲基化調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)突觸可塑性相關(guān)基因的DNA甲基化水平降低及其轉(zhuǎn)錄水平后續(xù)增加，故RG108可能在精神疾病治療中有重要的藥物開(kāi)發(fā)價(jià)值。