徐芳琴，郭超，王婧雯（空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，西安 710032）

腦缺血/再灌注（cerebral ischemia/reperfusion，CI/R）損傷是指大腦缺血缺氧一定時間后，恢復(fù)血液供應(yīng)時造成的嚴(yán)重腦機(jī)能障礙[1]。目前，CI/R損傷引起的嚴(yán)重腦損傷和功能障礙是臨床治療中一個具有挑戰(zhàn)性的問題，其發(fā)病機(jī)制可能與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等生物過程有關(guān)，且尚未開發(fā)出可用于治療CI/R損傷的安全可靠的靶向藥物。山柰酚（kaempferol，KAE）主要來源于姜科植物山柰的根莖，屬于黃酮類化合物，亦廣泛存在于茶葉、蔬菜及水果中。藥理研究表明，KAE具有抗炎[2]、抗氧化[3]、抗癌[4－6]、改善脂質(zhì)代謝[7]、保護(hù)大腦[8]等作用。然而，KAE治療CI/R損傷的蛋白靶標(biāo)與生物過程仍不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究和分子對接可以同時研究多種化學(xué)物質(zhì)和作用靶點(diǎn)，從而為中藥提供可能的研究途徑[9－10]?；诖?，本研究首先利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究篩選KAE治療CI/R損傷的作用靶點(diǎn)，分析其治療CI/R損傷的可能作用機(jī)制，然后利用分子對接技術(shù)明確KAE與核心靶點(diǎn)的結(jié)合位點(diǎn)，最后利用體內(nèi)外實驗驗證KAE發(fā)揮腦保護(hù)作用的可能機(jī)制，為KAE治療CI/R損傷提供實驗研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Multiskan Sky型酶標(biāo)儀、371型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司），YQX-Ⅱ型厭氧培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司），CKX53型生物顯微鏡（日本Olympus公司），BSC-1100ⅡA2-X型生物安全柜（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司），TD4型臺式離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），BSA124S型分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]，QL-901型渦旋儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），Mini-TBC型轉(zhuǎn)移槽、Mini-TBC型轉(zhuǎn)移芯（北京凱元信瑞儀器有限公司），Mini chemi 500型凝膠成像系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑包括KAE對照品（上海源葉生物科技有限公司，高效液相色譜法測得其含量≥98%），BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液（陜西中暉赫彩生物醫(yī)藥科技有限公司，批號分別為PQ003、BBO222），蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、Src、磷酸化 Src（p-Src）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號分別為 180947、175108、LS194236、AC2102017D、GB11002），磷酸鹽緩沖液（PBS）、DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Corning公司），DMEM無糖培養(yǎng)基（大連美侖生物技術(shù)有限公司），聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美國Merck Millipore公司，批號IPVH00010），HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（美國Abbkine公司），ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，批號32106）等。

1.3 細(xì)胞和動物

小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞系由空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院新藥研發(fā)中心培養(yǎng)和保存。實驗用動物為清潔級雄性SD大鼠，共18只，體質(zhì)量200～220 g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（陜）-2019-001。大鼠在動物房內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行后續(xù)實驗。

2 方法

2.1 KAE-靶點(diǎn)-CI/R網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.1.1 KAE靶點(diǎn)的預(yù)測 從TCMSP數(shù)據(jù)庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）獲得KAE分子結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)式的“canonical smiles”格式信息；從PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得KAE分子結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)式的“sdf”格式信息。選擇物種為“Homo sapiens”，通過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）預(yù)測靶點(diǎn)；利用UniProtKB數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）使靶點(diǎn)名稱標(biāo)準(zhǔn)化，并刪除重復(fù)數(shù)據(jù)。

2.1.2 CI/R靶點(diǎn)的收集 在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）和 NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）中檢索，關(guān)鍵詞為“cerebral ischemia/reperfusion”；在 Drugbank數(shù)據(jù)庫（https：//go.drugbank.com/）中檢索，關(guān)鍵詞為“cerebral ischemic stroke”。收集3個數(shù)據(jù)庫的CI/R靶點(diǎn)檢索結(jié)果，刪除重復(fù)數(shù)據(jù)。

2.1.3 共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將KAE、CI/R的靶點(diǎn)輸入Venny在線繪圖工具（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），篩選KAE與CI/R的共同靶點(diǎn)，并利用Cytoscape 3.7.1軟件（http：//www.cytoscape.org）構(gòu)建共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

2.2 核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.2.1 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)可闡明預(yù)測目標(biāo)與其他蛋白質(zhì)之間的關(guān)系。STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）可提供蛋白質(zhì)間相互作用的信息，通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建CI/R與KAE共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape 3.7.1軟件實現(xiàn)PPI網(wǎng)絡(luò)的可視化展示。

2.2.2 核心靶點(diǎn)預(yù)測 對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，利用Cytoscape 3.7.1軟件中的CytoHubba插件篩選出結(jié)構(gòu)親和力排名前10位的核心靶點(diǎn)。節(jié)點(diǎn)顏色越趨近紅色表示其連接的靶點(diǎn)越多，在CI/R損傷發(fā)生、發(fā)展中的作用越重要。

2.3 分子對接

分子對接是研究藥物分子作用機(jī)制的一種方法。從RSCB PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）下載蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并使用PyMOL軟件去除每個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的結(jié)晶水和其他小分子，然后將其保存為“PDB”格式。將結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入AutoDock Vina軟件中的Autodock Tool 1.5.6程序，在化合物結(jié)構(gòu)上添加原子電荷及氫，保存為“pdbq”格式。將化合物KAE的“mol2”格式文件導(dǎo)入Autodock Tool 1.5.6程序，在化合物結(jié)構(gòu)上添加原子電荷，保存為“pdbqt”格式，作為對接配體。采用AutoDock Vina軟件模擬分子對接，確定核心靶點(diǎn)與KAE的結(jié)合親和力。以KAE與核心靶點(diǎn)的對接結(jié)合能來評價結(jié)合親和力，若分子對接的結(jié)合能＜－7 kcal/mol（1 kcal＝4.186 kJ），說明具有親和力，且結(jié)合能的數(shù)值越低，說明結(jié)合親和力越低，結(jié)合越穩(wěn)定[11]。

2.4 細(xì)胞體外實驗驗證

2.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HT22細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基（即完全培養(yǎng)基）中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天更換1次培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度為90%左右時，用0.25%胰酶消化并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。本研究選用第7代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

2.4.2 氧糖剝奪/再灌注細(xì)胞損傷模型的制備、分組與給藥 實驗分為對照組、氧糖剝奪/再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）組和KAE低、中、高劑量組。對照組細(xì)胞用完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24 h。OGD/R組細(xì)胞用DMEM無糖培養(yǎng)基在37℃恒溫、厭氧培養(yǎng)箱（95%N2、5% CO2）中培養(yǎng)3 h，再用完全培養(yǎng)基代替DMEM無糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24 h，構(gòu)建OGD/R細(xì)胞損傷模型。KAE低、中、高劑量組細(xì)胞先參照OGD/R組厭氧培養(yǎng)3 h后，再分別加入含8、16、32 μmol/L KAE的DMEM無糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)24 h。KAE給藥劑量參考文獻(xiàn)[12]和課題組前期預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置。

2.4.3 細(xì)胞活力檢測 采用CCK-8法進(jìn)行檢測。將HT22細(xì)胞以5×104個/孔接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按“2.4.2”項下分組處理（每組設(shè)置3個復(fù)孔），同時設(shè)置不含細(xì)胞和藥物的空白對照組。培養(yǎng)結(jié)束后，更換為含CCK-8的培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測各孔的光密度（OD），并計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）＝（實驗組OD－空白對照組OD）/（對照組OD－空白對照組OD）×100%。實驗重復(fù)3次。

2.4.4 HT22 細(xì)胞中 Akt、p-Akt、Src、p-Src蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法檢測Akt、p-Akt、Src、p-Src蛋白的表達(dá)，驗證KAE對HT22細(xì)胞中上述蛋白的調(diào)控作用。將HT22細(xì)胞以2×106個/孔接種于25 cm2細(xì)胞瓶中，待細(xì)胞貼壁后，按“2.4.2”項下分組處理，用含1%蛋白酶抑制劑的4℃預(yù)冷的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，細(xì)胞裂解液在12 000×g、4℃下離心10 min，收集上清液，保存待用。以BCA法測定總蛋白濃度，將蛋白高溫變性后，取等量蛋白質(zhì)（20 μg）上樣電泳，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶于室溫下封閉2 h，并在4℃下與Akt、p-Akt、Src、p-Src、GAPDH一抗（稀釋度均為1∶1 000）孵育過夜，再將膜與HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋度為1∶5 000）在37℃下孵育2 h。用ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒進(jìn)行顯影，采用凝膠成像系統(tǒng)Lane 1D軟件對條帶進(jìn)行掃描以分析條帶灰度值，以Akt、p-Akt、Src、p-Src與內(nèi)參蛋白（GAPDH）條帶灰色值的比值表示蛋白的表達(dá)水平，以磷酸化蛋白與對應(yīng)未磷酸化蛋白的灰度值比值反映該蛋白的磷酸化水平，并以對照組為參照。實驗重復(fù)3次。

2.5 動物體內(nèi)實驗驗證

2.5.1 大鼠大腦中動脈阻塞模型的制備、分組與給藥 采用隨機(jī)數(shù)字表法將18只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）組、KAE組（劑量20 mg/kg），每組6只。除Sham組不造模外，其余2組均造模。采用線栓法建立大鼠MCAO模型：首先大鼠腹腔注射4%戊巴比妥鈉麻醉，仰臥固定，常規(guī)消毒，于頸部正中縱切口，分離出右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈，動脈夾暫時夾畢頸總動脈和頸內(nèi)動脈；在頸外動脈結(jié)扎處遠(yuǎn)心端剪一斜口，經(jīng)此斜口插入頂端賴氨酸包被的線栓（直徑0.18 mm），經(jīng)頸內(nèi)動脈進(jìn)入大腦前動脈的起始部位，遇輕微阻力即停止；栓塞2 h后，拔出線栓，再灌注24 h，構(gòu)建MCAO模型以模擬急性腦梗死[13]。Sham組僅鈍性分離大鼠頸部正中切口。于再灌注同時，Sham組及MCAO組腹腔注射生理鹽水，KAE組腹腔注射20 mg/kg KAE。KAE給藥劑量參考文獻(xiàn)[14]和課題組前期預(yù)實驗結(jié)果設(shè)置。

2.5.2 大鼠神經(jīng)功能評價 參照改良的Longa評分法對大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評分，按照0～4分進(jìn)行評價。0分：無明顯神經(jīng)功能缺損；1分：提尾時，對側(cè)前肢不能前伸；2分：向缺血對側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：不能承受對側(cè)自身重量；4分：意識障礙或無自主運(yùn)動。評分越高，表明大鼠行為障礙越嚴(yán)重[14]。

2.5.3 大鼠腦組織病理觀察 采用TTC染色法進(jìn)行觀察。給藥后，各組大鼠腹腔注射4%戊巴比妥鈉麻醉猝死后立即摘除全腦，用預(yù)冷的1×PBS洗凈，濾紙吸干，分為2份。其中一份腦組織置于－20℃冰箱速凍30 min，取出后在冰上切成5片（厚度2 mm）。將切片置于2%TTC染液中，用錫箔紙蓋住后，置于37℃恒溫箱中放置30 min，翻動腦組織切片，使其均勻接觸到染液。取出切片用PBS洗滌3～5 min，立即拍照，采用Image J 1.8.0軟件計算每一片腦組織的梗死區(qū)面積，分層計算面積，每一層的梗死面積之和稱為梗死體積。TTC染色為紅色表示正常組織，白色表示梗死區(qū)。

2.5.4 大鼠腦組織中Akt、p-Akt、Src、p-Src蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法進(jìn)行檢測。將“2.5.3”項下另一份大鼠腦組織用預(yù)冷的1×PBS洗凈后剪碎，稱取20 mg，用含1%蛋白酶抑制劑的4℃預(yù)冷的RIPA裂解液裂解，組織裂解液在12 000×g、4℃下離心10 min，收集上清液，保存待用。其余步驟同“2.4.4”項。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 KAE-靶點(diǎn)-CI/R網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

通過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測得到KAE靶點(diǎn)，并使用UniProtKB數(shù)據(jù)庫使靶點(diǎn)名稱標(biāo)準(zhǔn)化后，共獲得148個KAE靶點(diǎn)。從GeneCards、NCBI和Drugbank 3個數(shù)據(jù)庫中分別篩選出1 065、73和78個CI/R靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，共收集到1 124個CI/R靶點(diǎn)。利用Venny在線繪圖工具，將148個KAE靶點(diǎn)和1 124個CI/R靶點(diǎn)進(jìn)行比對，最后得到61個共同靶點(diǎn)（圖1A）。利用Cytoscape 3.7.1軟件獲得基于KAE-靶點(diǎn)-CI/R之間相互作用的由63個節(jié)點(diǎn)和122條邊線組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)（圖1B）。

圖1 共同靶點(diǎn)的Venny圖和KAE-靶點(diǎn)-CI/R復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)

3.2 核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

使用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建61個共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)。以綜合得分＞0.4和“Homo sapines”作為選擇標(biāo)準(zhǔn)，獲得由141個節(jié)點(diǎn)和1 152條邊線組成的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2A）。通過CytoHubba插件獲得PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前10位的核心靶點(diǎn)，依次為前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase，MMP9）、JUN、Akt1、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、胱天蛋白酶3（caspase-3，CASP3）、絲裂原激活蛋白激酶8（mitogenactivated protein kinase 8，MAPK8）、細(xì)胞間黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM1）、血管細(xì)胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM1）、Src（圖2B）。

圖2 共同靶點(diǎn)和核心靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

3.3 分子對接實驗結(jié)果

為進(jìn)一步篩選KAE治療CI/R的關(guān)鍵靶點(diǎn)，將KAE分別與排名前10位的核心靶點(diǎn)——PTGS2、MMP9、JUN、Akt1、TNF、CASP3、MAPK8、ICAM1、VCAM1、Src進(jìn)行分子對接。結(jié)果表明，KAE與上述10個核心靶點(diǎn)的結(jié)合位點(diǎn)依次為5、4、4、2、3、5、4、5、5、4個（表1），主要包括丙氨酸（alanine，ALA）、絲氨酸（serine，SER）、酪氨酸（tyrosine，TYR）、甲硫氨酸（methionine，MET）、賴氨酸（lysine，LYS）等。分子對接后的配體-蛋白質(zhì)相互作用分析結(jié)果顯示，每個小分子與目標(biāo)蛋白的結(jié)合主要依賴于氫鍵。其中，KAE與核心靶點(diǎn)Akt、Src的結(jié)合能均不高于－9.0 kcal/mol，說明結(jié)合較穩(wěn)定，提示KAE可能通過作用于Akt、Src發(fā)揮治療作用。因此，本研究以Akt、Src為靶點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)實驗驗證。

表1 KAE和排名前10位核心靶點(diǎn)的分子對接結(jié)果

3.4 體外細(xì)胞實驗驗證結(jié)果

3.4.1 KAE對OGD/R致HT22細(xì)胞損傷的影響 細(xì)胞活力檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，OGD/R組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05），提示OGD/R導(dǎo)致HT22細(xì)胞損傷；與OGD/R組比較，KAE低、中、高劑量組細(xì)胞存活率均顯著升高（P＜0.05），提示KAE可明顯促進(jìn)HT22細(xì)胞存活，并呈劑量依賴趨勢。結(jié)果見圖3。

圖3 KAE對HT22細(xì)胞存活率的影響

3.4.2 KAE對OGD/R損傷HT22細(xì)胞中Akt、Src蛋白磷酸化的影響 Western blot法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，OGD/R組細(xì)胞中Akt、Src蛋白的磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05）；與OGD/R組比較，KAE中、高劑量組細(xì)胞中Akt蛋白的磷酸化水平和KAE高劑量組細(xì)胞中Src蛋白的磷酸化水平均顯著升高（P＜0.05），且呈劑量依賴趨勢。結(jié)果見圖4。

圖4 KAE對HT22細(xì)胞中Akt、Src蛋白磷酸化的影響

3.5 大鼠體內(nèi)實驗驗證結(jié)果

3.5.1 KAE對MCAO模型大鼠神經(jīng)功能的影響 神經(jīng)功能評分結(jié)果顯示，與Sham組比較，MCAO組大鼠神經(jīng)功能評分顯著升高（P＜0.05）；與MCAO組比較，KAE組大鼠神經(jīng)功能評分顯著降低（P＜0.05），提示KAE能夠減輕MCAO造成的腦損傷。結(jié)果見圖5。

圖5 各組大鼠的神經(jīng)功能評分

3.5.2 KAE對MCAO模型大鼠腦組織病理學(xué)的影響 TTC染色結(jié)果顯示，與Sham組比較，MCAO組大鼠腦梗死體積顯著增加（P＜0.05）；與MCAO組比較，KAE組大鼠腦梗死體積顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖6。

圖6 各組大鼠腦組織的TTC染色圖

3.5.3 KAE對MCAO模型大鼠腦組織中Akt、Src蛋白磷酸化的影響 Western blot法檢測結(jié)果顯示，與Sham組比較，MCAO組大鼠腦組織中Akt、Src蛋白磷酸化水平均顯著降低（P＜0.05）；與MCAO組比較，KAE組大鼠腦組織中Akt、Src蛋白磷酸化水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖7。

4 討論

CI/R損傷是一種復(fù)雜的級聯(lián)性病理生理過程，其發(fā)生機(jī)制尚未完全明確。CI/R引起的腦損傷涉及多種生物過程，如炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能調(diào)節(jié)和血管內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)等[15－17]。本研究為闡明KAE治療腦卒中的作用機(jī)制，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究和分子對接篩選出了KAE的主要作用靶點(diǎn)，隨后用細(xì)胞和動物實驗驗證了篩選的結(jié)果。

本網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，KAE可能作用于PTGS2、MMP9、JUN、Akt1、TNF、CASP3、MAPK8、ICAM1、VCAM1、Src 10個核心靶點(diǎn)，從而發(fā)揮其治療CI/R損傷的作用。分子對接結(jié)果表明，KAE與10個核心靶點(diǎn)的結(jié)合親和力均較低，提示KAE與靶點(diǎn)結(jié)合穩(wěn)定。KAE 與PTGS2、MMP9、JUN、Akt1、TNF、CASP3、MAPK8、ICAM1、VCAM1、Src 10個核心靶點(diǎn)的結(jié)合位點(diǎn)分別有5、4、4、2、3、5、4、5、5、4個，主要包括ALA、SER、TYR、MET、LYS等，提示KAE可通過與核心靶點(diǎn)多位點(diǎn)結(jié)合發(fā)揮作用，這與中醫(yī)的“多靶點(diǎn)、多通路”治療疾病理論相呼應(yīng)。其中，KAE與核心靶點(diǎn)Akt、Src的結(jié)合能均不高于－9.0 kcal/mol，提示KAE可能通過作用于Akt、Src發(fā)揮治療作用。

以往網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果顯示，在血管內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)方面，KAE通過作用于Akt1、MMP9、Src、MAPK8等靶點(diǎn)，調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子、松弛素等信號通路進(jìn)而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能。Src是一種非受體蛋白酪氨酸激酶，在缺血腦組織中可調(diào)節(jié)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶，繼而發(fā)揮腦保護(hù)作用[18]。在腦缺血后再灌注初期，Src可通過調(diào)節(jié)閉鎖連接蛋白1和血管生成素1的表達(dá)，影響血管通透性，從而介導(dǎo)腦損傷[19]。下調(diào)Src蛋白磷酸化水平，抑制Src家族激酶信號通路激活，可發(fā)揮CI/R保護(hù)作用[20]。本研究結(jié)果表明，OGD/R損傷HT22細(xì)胞及MCAO模型大鼠腦組織中Src蛋白的磷酸化水平均顯著降低，表明CI/R損傷可能導(dǎo)致Src失活，引發(fā)腦組織損傷；給予KAE能夠顯著升高OGD/R損傷HT22細(xì)胞及MCAO模型大鼠腦組織中Src蛋白的磷酸化水平，提示Scr可能是發(fā)揮腦保護(hù)作用的重要靶點(diǎn)。

磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）-Akt是維持機(jī)體細(xì)胞正常生理活動的關(guān)鍵信號通路，廣泛存在于腦組織中，其中Akt作為PI3K的下游蛋白，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長和存活[21]。激活PI3K-Akt通路后可通過減少氧化應(yīng)激、抑制炎癥細(xì)胞因子表達(dá)、減少細(xì)胞凋亡，從而改善CI/R造成的腦損傷。研究表明，激活PI3K-Akt通路可抑制OGD/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生，減輕氧化應(yīng)激[22]。另外，激活PI3K-Akt-核因子E2相關(guān)因子2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可減輕CI/R損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激[23]。本研究結(jié)果表明，OGD/R損傷HT22細(xì)胞及MCAO模型大鼠腦組織中Akt蛋白的磷酸化水平均顯著降低，表明CI/R損傷可能導(dǎo)致Akt失活，引發(fā)腦組織損傷；給予KAE能夠顯著升高OGD/R損傷HT22細(xì)胞及MCAO模型大鼠腦組織中Akt蛋白的磷酸化水平，提示Akt可能是KAE發(fā)揮腦保護(hù)作用的重要靶點(diǎn)。

綜上所述，KAE可能通過調(diào)控Akt、Src蛋白的磷酸化水平來發(fā)揮腦保護(hù)作用，從而改善CI/R損傷。