袁敏艷，張敏，張碩，曹思源，2，季嘉城，2，王鵬嬌，張榮平，高秀麗，2#（.省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室/貴州醫(yī)科大學藥學院，貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學微生物與生化藥學工程中心，貴陽 550025；.貴州醫(yī)科大學實驗動物中心，貴陽 550025；.昆明醫(yī)科大學藥學院，昆明 650500）

抗宮炎軟膠囊（Kanggongyan soft capsule，KSC）是由抗宮炎片更改劑型而來的中藥第九類新藥，包含廣東紫珠、烏藥、益母草3味中藥[1]。其中，廣東紫珠具有抗炎、止血、抗結(jié)核和抗血小板聚集的作用[2]；烏藥具有促進循環(huán)、止痛和散寒的作用[3]；益母草可用于治療痛經(jīng)經(jīng)閉、惡露不盡、月經(jīng)不調(diào)等婦科疾病[4]。KSC在臨床主要用于治療慢性宮頸炎、慢性盆腔炎、宮頸柱狀上皮異位等婦科疾病。

對于KSC的質(zhì)量控制研究，目前多集中于對其中單一成分的含量測定[5－6]。中藥成分種類多、作用靶點多，以任何單一成分作為指標都不能全面反映中藥的整體質(zhì)量[7]。為確保中藥及中藥制劑發(fā)揮穩(wěn)定的治療效果，需要對其進行合理的質(zhì)量控制。中藥指紋圖譜是一種能夠全面反映中藥或中藥制劑整體化學特征的質(zhì)量分析方法[8]，被廣泛應(yīng)用于中藥及中藥制劑的質(zhì)量控制。近年來，超高效液相色譜（UPLC）法因其靈敏度高、操作方便等優(yōu)點被廣泛用于中藥及中藥制劑的質(zhì)量控制[9]。網(wǎng)絡(luò)藥理學可整合大量信息，通過計算并結(jié)合相關(guān)實驗，揭示“藥物-基因-靶點-疾病”相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系[10]。分子對接技術(shù)可以模擬藥物活性成分治療疾病的過程，具有快速、準確等優(yōu)點，有助于縮短藥物開發(fā)周期[11]。網(wǎng)絡(luò)藥理學與分子對接的結(jié)合已成為中藥研究的常用方法[12]。因此，本研究將指紋圖譜、含量測定、網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接技術(shù)相結(jié)合，分析KSC的潛在質(zhì)量標志物（quality marker，Q-marker），以期為KSC的質(zhì)量控制及后續(xù)研究提供科學參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Agilent 1290型UPLC儀（美國Agilent公司）、TB-215型電子天平（美國Denver Instrument公司）、KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、WP-UP-YJ-20型純水儀（四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

廣東紫珠干浸膏（批號200601）、益母草干浸膏（批號200601）、烏藥干浸膏（批號200501）均由貴州匯正制藥有限責任公司提供；去甲異波爾定對照品（批號P10M9L61140）、鹽酸益母草堿對照品（批號R04N8F-47273）、連翹酯苷B對照品（批號R14N9F74963）、金石蠶苷對照品（批號H29M3X1）、毛蕊花糖苷對照品（批號W14O10C100217）、異毛蕊花糖苷對照品（批號W17J10C90785）均購自上海源葉生物科技有限公司，純度均不低于98%。KSC（批號分別為200101、200102、200303、200501、200502、200503、200504、200602、200603、200701、200702、200704、200705、200801、200805、200806、200902、200903、201001、201002，規(guī)格每粒裝0.65 g，編號依次為S1～S20）均由貴州匯正制藥有限公司提供。乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC指紋圖譜分析

2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取去甲異波爾定、鹽酸益母草堿、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、金石蠶苷、異毛蕊花糖苷對照品各適量，置于同一10 mL量瓶中，加50%甲醇使溶解，稀釋至刻度，搖勻，制成上述對照品質(zhì)量濃度分別為0.052、0.175、0.150、0.146、0.168、0.175 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取KSC內(nèi)容物約1.0 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，回流1 h，放冷，再次稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.1.3 色譜條件 色譜柱為CAPCELL PAK C18IF2（100 mm×2.1 mm，2 μm）；以乙腈（A）-0.5%磷酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～20 min，88%B→83%B；20～35 min，83%B→65%B；35～37 min，65%B→10%B；37～40 min，10%B→88%B）；流速為0.2 mL/min；柱溫為35℃；進樣量為2 μL；檢測波長在0～10 min時為280 nm，10～40 min時為332 nm。

2.1.4 精密度試驗 精密稱取KSC內(nèi)容物（編號S4），按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。以5號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.00%（n＝6），相對峰面積的RSD均小于5.00%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.1.5 重復性試驗 精密稱取KSC內(nèi)容物（編號S4），按“2.1.2”項下方法平行制備供試品溶液，共6份，再按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以5號峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.00%（n＝6），相對峰面積的RSD均小于5.00%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱取KSC內(nèi)容物（編號S4），按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以5號峰為參照峰，計算各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.00%（n＝6），相對峰面積的RSD均小于5.00%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 指紋圖譜建立、相似度評價及共有峰指認 取20批KSC內(nèi)容物，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將各樣品色譜圖以“AIA”格式文件導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》進行分析。以S1為參照圖譜，設(shè)置時間窗寬度為0.1 min，對色譜峰進行多點校正，隨后進行Mark峰匹配，生成20批KSC的疊加指紋圖譜，并采用中位數(shù)法生成對照指紋圖譜（R），見圖1。20批KSC樣品圖譜與對照指紋圖譜（R）的相似度分別為1.000、0.997、0.999、0.999、0.999、1.000、0.999、1.000、0.999、0.999、0.999、0.999、0.999、1.000、0.998、0.999、0.999、0.999、0.999、1.000，均大于0.99，說明各批次樣品的質(zhì)量較穩(wěn)定、一致。共標記了12個共有峰；通過對比KSC供試品溶液（編號S4）和混合對照品溶液的色譜圖，共指認出6個色譜峰，分別為去甲異波爾定（1號峰）、鹽酸益母草堿（3號峰）、連翹酯苷B（5號峰）、毛蕊花糖苷（6號峰）、金石蠶苷（7號峰）、異毛蕊花糖苷（9號峰），結(jié)果見圖2。

圖1 20批KSC樣品的UPLC疊加指紋圖譜及對照指紋圖譜（R）

圖2 KSC供試品溶液和混合對照品溶液的UPLC疊加圖

2.2 含量測定

2.2.1 專屬性試驗 取“2.1.1”項下混合對照品溶液、“2.1.2”項下供試品溶液和空白對照溶液（50%甲醇），按“2.1.3”項下色譜條件下進樣測定，記錄色譜圖（圖略）。結(jié)果顯示，空白對照溶液對6種成分的檢測無干擾，提示方法專屬性良好。

2.2.2 線性關(guān)系考察 按“2.1.1”項下方法制備混合對照品溶液，用50%甲醇作溶劑，配制成系列濃度梯度的對照品混合溶液：去甲異波爾定質(zhì)量濃度分別為1.625、3.250、6.500、13.000、26.000、52.000 μg/mL，鹽酸益母草堿質(zhì)量濃度分別為2.734、5.469、10.938、21.875、43.750、87.500 μg/mL，連翹酯苷B質(zhì)量濃度分別為4.688、9.375、18.750、37.500、75.000、150.000 μg/mL，毛蕊花糖苷質(zhì)量濃度分別為4.563、9.125、18.250、36.500、73.000、146.000 μg/mL，金石蠶苷質(zhì)量濃度分別為 5.250、10.500、21.000、42.000、84.000、168.000 μg/mL，異毛蕊花糖苷質(zhì)量濃度分別為5.469、10.938、21.875、43.750、87.500、175.000 μg/mL。取上述系列對照品混合溶液，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各成分的質(zhì)量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，6種成分在其相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。

表1 KSC中6種成分的回歸方程與線性范圍

2.2.3 精密度試驗 精密稱取KSC內(nèi)容物（編號S1），按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，6種成分峰面積的RSD均小于3.00%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.2.4 重復性試驗 精密稱取KSC內(nèi)容物（編號S1），共6份，按“2.1.2”項下方法平行制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并用外標法計算6種成分的含量。結(jié)果顯示，6種成分含量的RSD均小于3.00%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 精密稱取KSC內(nèi)容物（編號S1），按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、6、12、24 h時按“2.1.3”項下色譜條件測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，6種成分峰面積的RSD均小于3.00%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的KSC內(nèi)容物（編號S1）6份，每份約0.5 g，分別按與已知成分含量1∶1的比例加入混合對照品溶液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結(jié)果顯示，去甲異波爾定、鹽酸益母草堿、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、金石蠶苷、異毛蕊花糖苷的平均加樣回收率分別為94.53%、100.55%、99.92%、102.98%、97.85%、101.16%，RSD均小于3.00%（n＝6），表明方法準確度良好。

2.2.7 樣品測定 取20批KSC內(nèi)容物，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。每批樣品平行測定3次，根據(jù)外標法計算樣品中各成分的含量，取平均值。結(jié)果見表2。

表2 20批KSC樣品中6個成分的含量（n＝3，mg/g）

2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學研究

通過分析20批KSC的指紋圖譜及含量測定結(jié)果，推測金石蠶苷、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、去甲異波爾定、鹽酸益母草堿可能為KSC的Q-marker，遂采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法進行進一步的分析。

2.3.1 活性成分靶點及宮頸炎相關(guān)靶點篩選 將金石蠶苷（poliumoside）、連翹酯苷B（forsythoside B）、毛蕊花糖苷（acteoside）、異毛蕊花糖苷（isoacteoside）、去甲異波爾定（norisoboldine）、鹽酸益母草堿（leonurine hydrochloride）作為關(guān)鍵詞輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫與分析平臺（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），共獲取到這6個成分的126個靶點，通過UniProt數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）將靶點名轉(zhuǎn)換為對應(yīng)的基因名。通過PubChem數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）進行檢索，將所得成分分子結(jié)構(gòu)文件導入SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）進行靶點預(yù)測。檢 索 GeneCards（http：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）數(shù)據(jù)庫獲取與宮頸炎相關(guān)的靶點。將GeneCard、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索到的宮頸炎的靶點結(jié)果合并，去除重復數(shù)據(jù)，獲得宮頸炎相關(guān)疾病靶點1 447個。對藥物靶點與疾病靶點取交集，得到KSC治療宮頸炎的作用靶點52個，將結(jié)果導入Cytoscape 3.7.2軟件，獲得“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)（圖3）。

圖3 KSC治療宮頸炎的“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)

2.3.2 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 將KSC治療宮頸炎的52個潛在靶點導入STRING在線數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），限定物種為“Homo sapiens”，設(shè)置最低置信度為0.9，同時隱藏游離的靶點，將所得靶點的相互作用信息導入Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化分析，構(gòu)建蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。利用“Analyze Network”功能對PPI網(wǎng)絡(luò)進行拓撲學分析，計算各節(jié)點的度值（degree）、介數(shù)中心性（betweenness centrality，BC）和接近中心性（closeness centrality，CC），以degree、BC、CC的中位數(shù)為閾值篩選得到14個核心靶點（圖4），即為KSC治療宮頸炎的關(guān)鍵靶點。按照degree對關(guān)鍵靶點進行排序，將排名前2位的靶點即蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）作為核心靶點進行分析。

圖4 KSC治療宮頸炎關(guān)鍵靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.3.3 基因本體和KEGG通路富集分析 將潛在核心靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。KEGG通路富集分析顯示，潛在靶點參與了94條通路，主要包括炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激、癌癥通路及細胞生長、增殖、凋亡等，其中磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3 kinase，PI3K）-AKT通路是最重要的一條通路。GO富集分析共涉及230條信息，其中生物學過程184條，主要涉及炎癥反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導、藥物反應(yīng)；細胞組分25條，主要與胞液、細胞核等有關(guān)；分子功能21條，主要包括調(diào)控蛋白激酶、PI3K活性等。

2.4 分子對接

從“成分-核心靶點”網(wǎng)絡(luò)中將基因靶點以degree值的高低進行排序，選取前2個關(guān)鍵靶點（AKT1、TNF）分別與6個成分進行分子對接。從RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫（https：//rcsb.org/）中獲得靶點（TNF、AKT1）的三維結(jié)構(gòu)文件，通過AutoDockTools軟件對蛋白晶體結(jié)構(gòu)進行初始化處理，并轉(zhuǎn)換為對接所需“pdbqt”格式文件。通過Chem3D Pro 14.0軟件對化學成分的三維結(jié)構(gòu)進行MM2力場優(yōu)化，并通過AutoDockTools軟件設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)并轉(zhuǎn)換為對接所需“pdbqt”格式文件。采用AutoDock Vina分子對接軟件進行分子對接打分。較低的自由結(jié)合能更有利于受體和配體之間的結(jié)合[13]。6個成分與靶點的最低結(jié)合能均小于0，其中6個成分與AKT1的結(jié)合能均小于－6.6 kJ/mol，與TNF的結(jié)合能均小于－6.4 kJ/mol，提示分子間具有很好的結(jié)合親和力。KSC的主要活性成分和核心靶點的高結(jié)合能力表明KSC可能是通過調(diào)節(jié)以上靶點發(fā)揮治療作用的。

3 討論

中藥質(zhì)量控制是保證中藥臨床用藥安全和有效的重要措施[14]。目前，僅見廖春玲[15]對抗宮炎制劑（片劑、顆粒劑、膠囊）展開過HPLC指紋圖譜研究。本研究建立了KSC的UPLC指紋圖譜，同時對其中的6個成分進行了含量測定，并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接研究分析出去甲異波爾定、鹽酸益母草堿、連翹酯苷B、金石蠶苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷可作為KSC的Q-marker。

KSC清濕熱、止帶下的功效與其主要活性成分的抗菌、抗炎等作用密切相關(guān)。據(jù)文獻報道，廣東紫珠為KSC方中君藥，主要活性成分為苯乙醇苷類，包括金石蠶苷、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷；益母草的主要活性成分為益母草堿；烏藥的活性成分為去甲異波爾定。從KEGG通路富集結(jié)果來看，PI3K-AKT通路是最重要的一條通路，該通路已被證明是免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵通路[16]。PI3K-AKT通路可通過激活A(yù)KT下游的核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、雷帕霉素靶蛋白、缺氧誘導因子1來促進促炎細胞因子的產(chǎn)生，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)[17]。鹽酸益母草堿可通過NF-κB信號通路抑制炎癥反應(yīng)并改善骨關(guān)節(jié)炎大鼠的軟骨退化，同時對酒精性肝損傷也有保護作用[18]；連翹酯苷B可通過抑制NF-κB信號通路減輕阿爾茨海默病的神經(jīng)炎癥[19]；毛蕊花糖苷具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗病原微生物、保護神經(jīng)等多種藥理作用[20]，其作用機制可能與抑制NF-κB信號通路從而抑制TNF-α、IL-6的釋放有關(guān)[21]；金石蠶苷具有抗炎、抗氧化、保護神經(jīng)等作用，可通過抑制NF-κB信號通路減輕TNF-α誘導的細胞損傷[22]；去甲異波爾定具有抗炎、調(diào)節(jié)脂代謝、治療急性肺損傷等作用，可通過下調(diào)絲裂原激活蛋白激酶來抑制脂多糖刺激的RAW264.7細胞中促炎細胞因子的產(chǎn)生[23]。由此可見，KSC可能通過相關(guān)靶點調(diào)節(jié)PI3K-AKT通路及其下游靶點通路來抑制炎癥因子的釋放，從而起到抗炎作用。

綜上，去甲異波爾定、鹽酸益母草堿、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、金石蠶苷、異毛蕊花糖苷可作為KSC的Q-marker。