張璠璠，王轍遠(yuǎn)，王隆隆，陳恒文，劉菊，黃霞，于曉濤，王瑞#（.漯河市中心醫(yī)院藥學(xué)部，河南 漯河 600；.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院藥劑科，北京 0005；.鄭州市中醫(yī)院藥劑科，鄭州 50007；.河南省食品藥品檢驗(yàn)所中藥研究室，鄭州 5000）

清胰合劑（Qingyi mixture，QM）是漯河市中心醫(yī)院消化內(nèi)科醫(yī)生根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成的有效經(jīng)驗(yàn)方，由枳實(shí)、砂仁、蒲公英、牡丹皮、黃芩、厚樸、地黃、丹參、大黃、川芎、陳皮、敗醬草共12味中藥組成。方中蒲公英能清熱解毒、消腫散結(jié)，尤善治濕熱癰滯，丹參能活血祛瘀、涼血消癰，二者共為君藥。全方理氣與行血相合，清熱與逐瘀共用，共奏逐瘀行血、清熱通腑之功。

QM于2021年獲得河南省醫(yī)療機(jī)構(gòu)院內(nèi)制劑備案批準(zhǔn)文號(hào)（豫藥制備字Z20210113000），但其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅為簡單的薄層鑒別，無法有效反映該制劑的質(zhì)量水平。為了有效控制該制劑的質(zhì)量，筆者擬采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法建立該制劑的指紋圖譜，對(duì)其進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別分析，同時(shí)擬測(cè)定該方君藥蒲公英中綠原酸、菊苣酸和丹參中丹酚酸B等8種有效成分的含量，從定性和定量2個(gè)角度為QM的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有1260型HPLC儀（美國Agilent公司）、SB25-12D型超聲清洗機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）、FAUW-120D型分析天平（日本Shimadzu公司）、5810R型高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

15批QM來自漯河市中心醫(yī)院，批號(hào)分別為20200715、20200812、20200908、20201008、20201120、20201230、20210202、20200310、20210420、20210610、20210710、20210811、20210909、20211009、20211115，編號(hào)為S1～S15，規(guī)格均為100 mL/瓶。枳實(shí)、砂仁、蒲公英、牡丹皮、黃芩、厚樸、地黃、丹參、大黃、川芎、陳皮、敗醬草藥材由漯河市中心醫(yī)院提供。綠原酸對(duì)照品（批號(hào)110753-201817，純度96.8%）、阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)110773-201614，純度99.0%）、黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)112002-201702，純度98.5%）、黃芩素對(duì)照品（批號(hào)111514-201706，純度98.9%）、丹皮酚對(duì)照品（批號(hào)110708-201407，純度99.9%）均購自中國食品藥品鑒定研究院；菊苣酸對(duì)照品（批號(hào)DSTDJ003901，純度98.54%）、橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)DST200517-038，純度98.79%）、丹酚酸B對(duì)照品（批號(hào)DST190918-009，純度99.28%）均購自成都德斯特生物科技有限公司。乙腈、甲醇為色譜純，均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；磷酸為色譜純，購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；水為飲用水或超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Agilent SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～10 min，11%B；10～20 min，11%B→19%B；20～50 min，19%B；50～60 min，19%B→28%B；60～75 min，28%B；75～95 min，28%B→55%B；95～100 min，55%B；100～101 min，55%B→11%B；101～110 min，11%B）；柱溫為35 ℃；流速為0.6 mL/min；檢測(cè)波長為254 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取綠原酸、阿魏酸、菊苣酸、橙皮苷、黃芩苷、丹酚酸B、黃芩素和丹皮酚對(duì)照品各適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1.86、1.79、1.54、2.14、1.96、2.11、2.26、2.13 mg/mL 的單一對(duì)照品貯備液。精密量取以上各貯備液適量，混勻，制得綠原酸、阿魏酸、菊苣酸、橙皮苷、黃芩苷、丹酚酸B、黃芩素和丹皮酚質(zhì)量濃度分別為289.877、245.784、117.712、167.384、780.605、109.242、200.592、136.521 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，密閉保存，備用。

2.2.2 供試品溶液 取15批QM各1 mL，以13 000 r/min離心3 min，取上清液，即得供試品溶液。

2.2.3 單味飲片供試液 依據(jù)QM制備工藝（藥材加10倍量水浸泡40 min后煎煮90 min，再加8倍量水煎煮60 min）同法制備丹參、蒲公英、黃芩、牡丹皮等12味中藥的提取液，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得各單味飲片供試液。

2.3QM指紋圖譜研究

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液（S1），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄色譜圖。以黃芩苷峰（峰14）為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD≤1.1%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD≤1.2%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（S1），共6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以黃芩苷峰（峰14）為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD≤0.9%（n＝6），相對(duì)峰面積的RSD≤1.5%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（S1），分別于室溫下放置0、3、9、24、48 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以黃芩苷峰（峰14）為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD≤1.2%（n＝5），相對(duì)峰面積的RSD≤1.4%（n＝5），表明供試品液在室溫下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià) 取“2.2”項(xiàng)下15批供試品溶液（S1～S15）及混合對(duì)照品溶液，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。取S1～S15的色譜圖，通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》建立指紋圖譜[設(shè)定時(shí)間窗寬度0.1 min，進(jìn)行多點(diǎn)校正和全譜峰匹配生成HPLC指紋圖譜，采用中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜（R），圖1]并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，15批QM與對(duì)照指紋圖譜的相似度均超過0.975；共標(biāo)定了22個(gè)共有峰，其峰面積之和占總峰面積的86.74%，表明其能夠代表QM色譜圖的概況。色譜圖中黃芩苷峰（峰14）的保留時(shí)間適中、分離度好、峰面積較大且穩(wěn)定，故以其作為參照峰（S），計(jì)算得15批QM各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD≤1.2%，表明15批QM的出峰時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定；各共有峰峰面積的RSD為2.96%～16.31%，表明15批QM所含成分存在批次間差異。

圖1 15批QM的HPLC指紋圖譜及對(duì)照指紋圖譜

2.3.5 色譜峰的歸屬及指認(rèn) 分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液（S1）及單味飲片供試液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖（圖2）。通過色譜圖比對(duì)，共歸屬了22個(gè)共有峰，指認(rèn)了8個(gè)共有峰。其中，峰3、峰5歸屬于枳實(shí)，峰4（綠原酸）、峰9（菊苣酸）歸屬于蒲公英，峰22（丹皮酚）歸屬于牡丹皮，峰14（黃芩苷）、峰19、峰21（黃芩素）歸屬于黃芩，峰11、峰13、峰15（丹酚酸B）、峰16歸屬于丹參，峰7、峰12、峰17、峰18、峰20歸屬于大黃，峰6、峰8（阿魏酸）歸屬于川芎，峰10（橙皮苷）歸屬于陳皮，峰1為枳實(shí)、蒲公英、牡丹皮、地黃、大黃、川芎、陳皮和敗醬草的共有成分，峰2為牡丹皮、大黃和川芎的共有成分。

圖2 QM共有峰的歸屬及指認(rèn)

2.4 化學(xué)模式識(shí)別分析

2.4.1 聚類分析 將22個(gè)共有峰的峰面積數(shù)據(jù)采用ZScore標(biāo)準(zhǔn)化處理后，通過SPSS 20.0軟件進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示，當(dāng)平方歐氏距離為10時(shí)，可將15批QM聚為2類，其中S1～S4及S9、S10聚為一類，其余批次樣品聚為另一類（圖3）。這表明QM存在批次間差異，可能與中藥飲片產(chǎn)地、廠家、批次等存在差異有關(guān)，提示保持飲片來源及廠家穩(wěn)定對(duì)QM的質(zhì)控具有重要意義。

圖3 15批QM的聚類分析樹狀圖

2.4.2 主成分分析 將22個(gè)共有峰的峰面積數(shù)據(jù)采用Z-Score標(biāo)準(zhǔn)化處理后導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行主成分分析[1]。以特征值≥1作為提取標(biāo)準(zhǔn)，共得到5個(gè)主成分，其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到了93.6%，提示提取出的5個(gè)主成分能夠概括QM中絕大部分信息。15批QM可被分為2類，其中S1～S4及S9、S10為一類，其余批次樣品為另一類，與聚類分析結(jié)果一致，詳見圖4。

圖4 15批QM的主成分分析結(jié)果

2.4.3 正交偏最小二乘法-判別分析 將22個(gè)共有峰的峰面積數(shù)據(jù)采用Z-Score標(biāo)準(zhǔn)化處理后導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行正交偏最小二乘法-判別分析，得到載荷散點(diǎn)圖、得分散點(diǎn)圖和變量投影重要性（variable importance of projection，VIP）圖，如圖5所示。由圖5可知，在置信區(qū)間（95%）范圍內(nèi)，15批QM可被分為2類，其中S1～S4及S9、S10為一類，其余批次樣品為另一類，與聚類分析、主成分分析結(jié)果一致。載荷散點(diǎn)圖中每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)共有峰自變量，其與原點(diǎn)距離越近，對(duì)樣品差異的貢獻(xiàn)率越小，反之貢獻(xiàn)率就越大；而VIP圖可以篩選出導(dǎo)致樣品差異貢獻(xiàn)較大的成分[2－3]。本研究以VIP值≥1.0作為參考值，共提取出了5個(gè)特征性成分，依次為峰14（黃芩苷）、峰9（菊苣酸）、峰18、峰21（黃芩素）和峰19，說明這5種成分可能是造成QM質(zhì)量差異的標(biāo)志物。

圖5 15批QM的正交偏最小二乘法-判別分析結(jié)果

2.5 8種成分含量測(cè)定

2.5.1 專屬性試驗(yàn) 取供試品溶液（S1）和混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，8種待測(cè)成分的色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，峰形對(duì)稱性良好；理論板數(shù)以黃芩苷峰計(jì)算均大于6 000。在與綠原酸、阿魏酸、菊苣酸、橙皮苷、黃芩苷、丹酚酸B、黃芩素和丹皮酚對(duì)照品色譜圖相對(duì)應(yīng)的位置上，供試品溶液色譜圖中均有相應(yīng)色譜峰出現(xiàn)（圖2B）。

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，加甲醇逐級(jí)稀釋0、1.5、3、4.5、6、7倍，使之成為不同質(zhì)量濃度的系列對(duì)照品混合溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 綠原酸等8種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5.3 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，綠原酸、阿魏酸、菊苣酸、橙皮苷、黃芩苷、丹酚酸B、黃芩素和丹皮酚峰面積的RSD均不大于1.8%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取QM樣品（S1），共6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。結(jié)果顯示，綠原酸、阿魏酸、菊苣酸、橙皮苷、黃芩苷、丹酚酸B、黃芩素和丹皮酚含量的RSD均不大于1.1%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（S1），在室溫下放置0、6、12、24、48 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，綠原酸、阿魏酸、菊苣酸、橙皮苷、黃芩苷、丹酚酸B、黃芩素和丹皮酚峰面積的RSD均不大于1.9%（n＝5），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品（S1）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備9份供試品溶液。精密量取“2.2.1”項(xiàng)下各對(duì)照品貯備液適量，制備與樣品中成分含量相同的混合對(duì)照品溶液。將該混合對(duì)照品溶液按樣品含量的0.5、1.0、1.5倍加至供試品溶液中，混勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，綠原酸、阿魏酸、菊苣酸、橙皮苷、黃芩苷、丹酚酸B、黃芩素和丹皮酚的平均加樣回收率為98.69%～101.99%，RSD≤2.0%（n＝9），表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.5.7 QM含量測(cè)定 取15批QM，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算樣品含量。每批樣品平行測(cè)定3次，取平均值。結(jié)果顯示，15批QM中綠原酸、阿魏酸、菊苣酸、橙皮苷、黃芩苷、丹酚酸B、黃芩素和丹皮酚的含量分別為0.077～0.094、0.165～0.190、0.100～0.114、0.083～0.107、0.556～0.615、0.288～0.314、0.152～0.188、0.114～0.128 mg/g，詳見表2。

表2 15批QM中綠原酸等8種成分的含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 色譜條件考察

本研究前期考察了不同色譜柱（YMC C18、GLSciences ODS-3、Agilent SB-C18）、流動(dòng)相（水-乙腈、0.2%磷酸溶液-乙腈、0.1%磷酸溶液-乙腈）、柱溫（40、35、30℃）、流速（1.0、0.8、0.6 mL/min）、檢測(cè)波長（220、254、276 nm）對(duì)色譜圖的影響。結(jié)果顯示，在以Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱、0.1%磷酸溶液-乙腈為流動(dòng)相（梯度洗脫）、柱溫為35℃、流速為0.6 mL/min、檢測(cè)波長為254 nm時(shí)，供試品溶液的整體色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰大小適中、分離度較高且分布較為合理，故選其作為本研究的色譜條件。

3.2 指標(biāo)成分的選定

本研究比對(duì)了供試品溶液、單味飲片供試液及混合對(duì)照品溶液的色譜圖信息，確認(rèn)了22個(gè)共有峰的歸屬情況，指認(rèn)了綠原酸、阿魏酸、菊苣酸、橙皮苷、黃芩苷、丹酚酸B、黃芩素和丹皮酚8種成分的色譜峰；正交偏最小二乘法-判別分析以VIP值≥1.0作為提取特征，共篩選出5種成分，分別為峰9（菊苣酸）、峰14（黃芩苷）、峰18、峰19、峰21（黃芩素）。結(jié)合文獻(xiàn)資料及中藥活性成分的藥理作用研究可知，蒲公英中的綠原酸、菊苣酸在抗菌、抗炎等方面有較強(qiáng)的藥理活性[4]；陳皮中的橙皮苷具有保護(hù)心血管、抗炎、抗菌、抗氧化等多種藥理活性[5]；川芎中的阿魏酸具有抗氧化、抗血栓、降血脂、降低心肌缺血和耗氧量、抗菌、抗病毒、抗癌等作用[6]；黃芩中的黃芩苷和黃芩素具有清熱瀉火、抗炎、抗病毒等藥理活性[7]；丹酚酸B為丹參中主要的水溶性成分，具有抗氧化、清除自由基、抑制細(xì)胞凋亡等藥理活性[8]；丹皮酚為牡丹皮中主要有效成分，具有抗炎、抗腫瘤、代謝調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛等藥理作用[9]。以上化學(xué)成分的藥理活性均與本方抗炎、解痙、止痛、改善微循環(huán)等治療理念聯(lián)系緊密，故選擇以上8種成分進(jìn)行含量測(cè)定，以期為QM的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。

綜上，本研究建立了QM的HPLC指紋圖譜和方中8種成分含量測(cè)定的方法，可為該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考依據(jù)。