蘇 慧

(江西中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校工程中心,江西 撫州 344000)

附子，又名烏頭或附片，為毛茛科、烏頭屬植物多年生草本子根的加工品。附子屬溫里藥，為中藥“回陽救逆第一品”，臨床上廣泛用于陽虛寒凝證，但生附子有毒，因此臨床上通常采用加工炮制減毒后的附子[1]。甘草附子湯源自《傷寒雜病論》，又名四物附子湯，由炙甘草、黑順片、白術(shù)和桂枝4味中藥組成，是治療風(fēng)濕兼陽虛證的代表方劑之一[2]?！敖ú龓汀睂儆凇敖魉帋汀?，飲片炮制的工具、輔料、工藝等獨具本幫傳統(tǒng)風(fēng)格，采用煨制、蒸制、炒制及烤制法將附子加工成煨附子、淡附子、陰附子和陽附子，適應(yīng)各種臨床需要，盛譽業(yè)界[3，4]。

附子中化學(xué)成分主要為生物堿類，現(xiàn)從烏頭屬生物堿中分離出來的已知化學(xué)結(jié)構(gòu)主要是二萜類生物堿，其中單雙酯型生物堿為當(dāng)前研究最多的一類生物堿[5]?！吨腥A人民共和國藥典》[6]以烏頭堿新、烏頭堿、次烏頭堿3個雙酯型生物堿總量評價附子毒性，以苯甲酰烏頭堿、苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿3個單酯型生物堿總量評價其有效性?，F(xiàn)代研究多集中于甘草附子湯中化學(xué)成分及臨床應(yīng)用的研究，對不同附子炮制品規(guī)格在復(fù)方湯劑生物堿含量差異的研究未見報道，但附子不同炮制品規(guī)格與臨床療效密切相關(guān)，臨床上可合理炮制削減附子毒性來滿足臨床需求。

實驗選取建昌幫附子(煨附子、淡附子、陰附子、陽附子)及臨床上使用最多的黑順片為研究對象，參照《傷寒論》的煎煮方法，分別制備甘草附子湯，以單酯型生物堿總量為評價指標(biāo)，對建昌幫附子及黑順片在甘草附子湯中單酯型生物堿含量進(jìn)行了比較，從其有效成分含量的角度研究附子不同炮制品規(guī)格對甘草附子湯的影響，為甘草附子湯的臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent1260 Ⅱ型高效液相色譜儀(UV檢測器，安捷倫科技有限公司)，PWN124型萬分之一分析天平(奧克斯儀器有限公司)，Smart-N15UV型超純水機(jī)[美國密理博(Millipore)有限公司]，Strike300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器有限公司)。

1.2 試劑 除乙腈為色譜純試劑(TEDIA)，其余試劑均為分析純；對照品：苯甲酰新烏頭堿(MUST21022704)、苯甲酰次烏頭堿(MUST21031111)、苯甲酰烏頭堿(MUST22042014)純度≥98%，購自曼斯特(成都)生物科技有限公司；黑順片購于四川江油飲片廠，炙甘草購于江西德惠中藥飲片有限公司，桂枝購于江西彭氏國藥堂飲片有限公司，白術(shù)購于江西同善堂中藥飲片有限公司；建昌幫煨附子、淡附子、陰附子、陽附子由江西中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中藥炮制團(tuán)隊負(fù)責(zé)制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 成品外觀性狀比較 抽取建昌幫附子與黑順片，于自然光下觀察其成品外觀性狀，結(jié)果顯示，煨附子：呈灰棕色半透明，不規(guī)則卵圓形薄中片；陰附子：呈棕黃色半透明，不規(guī)則卵圓形薄片；陽附子：呈白黃色不規(guī)則卵圓形厚片，表面不平整，斷面鼓起；淡附子：呈灰白色不規(guī)則卵圓形極薄片；黑順片：外皮黑褐色。見圖1。

A煨附子；B陰附子；C陽附子；D淡附子；E黑順片圖1 建昌幫附子和黑順片外觀性狀圖

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取苯甲酰新烏頭堿(Benzoylmesaconine，BM)、苯甲酰次烏頭堿(Benzoylhypaconine，BH)對照品1 mg，分別用0.05%鹽酸-甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的單一成分的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 甘草附子湯煎劑的制備參考《傷寒論》，分別稱取5份(甘草6 g，桂枝12 g，白術(shù)6 g)，其中再分別加入6 g樣品，依次為煨附子、陰附子、陽附子、淡附子、黑順片，加10倍蒸餾水浸泡30 min，微沸提取2次，提取時間分別為60 min和40 min，合并提取液后，雙層紗布過濾，將過濾液轉(zhuǎn)移至容量瓶中并定容至250 mL，精密量取100 mL旋轉(zhuǎn)蒸干，殘渣用甲醇8 mL、氨水8 mL、三氯甲烷40 mL混合液溶解，加熱回流2 h，放冷濾過。濾液60 ℃水浴蒸干，移至10 mL容量瓶中用0.05%鹽酸-甲醇溶解，進(jìn)樣前提取液用微孔濾膜過濾。

2.4 陰性供試品溶液的制備 稱取甘草6 g，桂枝12 g，白術(shù)6 g，按照2.3項下制備，即得陰性供試品溶液。

2.5 高效液相色譜法工作條件 檢測波長235 nm；Agilent C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相A：20 mmoL/L乙酸銨，流動相B：乙腈∶甲醇(1∶1)；洗脫程序：0～10 min，95%～80%A；10～20 min，80%～70%A；20～35 min，70%～55%A。柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.6 色譜分析 吸取混合BM、BH的對照品溶液、甘草附子湯全方煎液(煨附子、陰附子、陽附子、淡附子、黑順片)、陰性供試品溶液，色譜分析結(jié)果見圖2。

A陰性供試品；B煨附子；C陰附子；D陽附子；E黑順片；F淡附片；G 1:BM對照品、2:BH對照品圖2 甘草附子湯高效液相色譜圖

2.7 方法學(xué)驗證

2.7.1 線性關(guān)系 用0.05%鹽酸-甲醇稀釋，得一系列濃度BM、BH對照品溶液，根據(jù)峰面積積分和對應(yīng)濃度的XY軸數(shù)據(jù)，得BM在2.5～110.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：Y=7.2343X+3.9492，r=0.9999；BH在2.0～15.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程；Y=15.187X+1.1457，r=0.9998。數(shù)據(jù)顯示，BM、BH對應(yīng)濃度和峰面積積分呈良好的線性關(guān)系。

2.7.2 精密度 吸取10 μL BM、BH對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，測得BM峰面積RSD為0.79%，出峰時間RSD為0.04%；BH峰面積RSD為0.36%，出峰時間RSD為0.82%。結(jié)果表明，方法精密度良好。

2.7.3 重復(fù)性 制備陰附子全方煎液6份，結(jié)果測得BM的分離時間RSD為0.07%，峰面積RSD為1.19%；BH的分離時間RSD為0.04%，峰面積RSD為2.77%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.4 穩(wěn)定性 取陰附子全方煎液，室溫條件下于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，結(jié)果測得BM的分離時間RSD為0.06%，峰面積RSD為2.31%；BH的分離時間RSD為0.05%，峰面積RSD為2.58%。表明陰附子全方煎液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.5 加樣回收率實驗 取已知含量的陰附子供試品液，分別加入適量的BM、BH對照品溶液，平行操作3次，進(jìn)行加樣后的提取和回收。各組分的回收率見表1，BM的加樣回收率在99.41%～103.18%，BH的加樣回收率在102.53%～102.94%，說明該方法較為可靠。

表1 陰附子供試品液中BM、BH加樣回收數(shù)據(jù)

2.7.6 樣品含量測定 分別精密稱取建昌幫附子(煨附子、陽附子、淡附子、陰附子)和黑順片，各平行制備甘草附子湯全方煎液3份，測定煎煮液中BM、BH含量，見表2。

表2 甘草附子湯中單酯型生物堿含量測定結(jié)果

3 討論

大多數(shù)生物堿是以鹽的形式存在于中藥中，生物堿鹽溶于水且不溶于有機(jī)試劑，考慮甘草附子湯蒸發(fā)干后需用有機(jī)試劑溶解，所以實驗加熱回流中加入氨水使其轉(zhuǎn)為游離態(tài)生物堿，方便測定甘草附子湯中單酯型生物堿。鹽酸可以抑制單酯型生物堿水解，所以BM、BH對照品溶液溶劑選擇加入0.05%鹽酸。

分析甘草附子湯單酯型生物堿時，分別考察了有機(jī)相為甲醇、乙腈及二者混合3種流動相，結(jié)果顯示，乙腈∶甲醇(1∶1)分離效果較好。因甘草附子湯單酯型生物堿為弱堿性樣品，考慮在水相中加入乙酸銨，增加單酯型生物堿在柱子中分析的保留時間。結(jié)果顯示，水相加入20 mmoL/L乙酸銨后，譜圖分離效果明顯改善，且峰分布均勻，故選擇乙腈∶甲醇(1∶1)-20 mmoL/L乙酸銨為流動相。

《中華人民共和國藥典》采用3個單酯型生物堿總量評價其附子有效性，雙酯型生物堿不耐高溫，在附子湯中雙酯型生物堿可轉(zhuǎn)化為單酯型生物堿。因此實驗以單酯型生物堿總量為評價指標(biāo)，對建昌幫附子及黑順片在甘草附子湯中單酯型生物堿含量進(jìn)行了比較研究，但苯甲酰烏頭堿在檢測中含量較低，未被檢測到，所以并未對苯甲酰烏頭堿進(jìn)行含量測定。結(jié)果顯示，不同附子炮制方法會影響其在甘草附子湯中的單酯型生物堿成分含量，還會影響附子成品外觀和顏色，在5種炮制品甘草附子湯全方煎液中，采用煨制法制備的煨附子全方煎液單酯型生物堿成分含量最高，采用膽水浸泡后硫熏制備的黑順片全方煎液單酯型生物堿成分含量最低，符合建昌幫藥幫炮制附子的目的，表明建昌幫附子替代甘草附子湯中黑順片的可行性。