胡貝爾

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤血液科，湖南 長沙 410000)

溫郁金作為抗腫瘤復(fù)方中較常見的一種藥物,其抗腫瘤作用已有相關(guān)報道,但是關(guān)于其對胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF)的影響相關(guān)報道較少[1]。對此,該項目就溫郁金對胃癌細(xì)胞的抑制作用進(jìn)行探討分析,且觀察其對IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ表達(dá)的影響,以期指導(dǎo)臨床疾病治療?，F(xiàn)將相關(guān)情況總結(jié)報道如下。

1 材料及方法

1.1 材料

項目研究所需材料包括:(1)胃腺癌細(xì)胞(SGC-7901)株;(2)RPMI-1640培養(yǎng)基;(3)噻唑藍(lán)(MTT);(4)胰蛋白酶;(5)氟尿嘧啶;(6)IGF-Ⅰ放免試劑盒及IGF-Ⅱ放免試劑盒;(7)二甲基亞砜;(8)溫郁金;(9)超臨界萃取裝置;(10)二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱;(11)酶標(biāo)儀;(12)放射免疫r計數(shù)器等。

1.2 方法

(1)細(xì)胞培養(yǎng)。將SGC-7901細(xì)胞放置于含100ml/L滅活胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,按照常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng),在將其放在培養(yǎng)箱中開始培養(yǎng),其中,培養(yǎng)箱的條件設(shè)置:37℃;50ml/L的二氧化碳;飽和濕度。

(2)溫郁金提取物制備。對溫郁金的有效成分進(jìn)行提取處理,萃取的溫度調(diào)節(jié)40℃,壓力調(diào)節(jié)3×107Pa,時間調(diào)節(jié)120min/循環(huán),二氧化碳流量調(diào)節(jié)50kg/h。分離1反應(yīng)條件設(shè)置:壓力1.25×107Pa,溫度50℃;分離2條件:壓力5.5×106Pa,溫度40℃。得到溫郁金提取物1和2之后,基于4℃條件下,避光冷藏保存。先取適量的DMSO溶解,再用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋。

(3)MTT還原法。MTT還原法就是細(xì)胞增生抑制試驗,對數(shù)生長期細(xì)胞選用含有100ml/L胎牛血清的1640培養(yǎng)液進(jìn)行調(diào)整,促使細(xì)胞懸液濃度達(dá)到1.0×107/L,且接種細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板,200μl/孔,放置于培養(yǎng)箱其環(huán)境條件如下:37℃、50ml/L二氧化碳、飽和濕度。24h之后,更換成不含胎牛血清的1640培養(yǎng)液,繼續(xù)24h的培養(yǎng),促使細(xì)胞同步化。換含濃度25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的溫郁金提取物1、2的完全培養(yǎng)液,加入濃度25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L的5-Fu完全培養(yǎng)液設(shè)為陽性對照組,每一藥物濃度設(shè)置6個復(fù)孔,分別繼續(xù)培養(yǎng)48h,每孔加入 20μl 5g/L MTT溶液,37℃條件下孵育4h,再添加150μl DMSO,放置于微量振蕩器進(jìn)行10min振蕩處理,立即通過酶標(biāo)儀,對490nm波長吸光度值(A)進(jìn)行檢測分析。

(4)IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ測定。對數(shù)生長期細(xì)胞選用含100ml/L胎牛血清的1640培養(yǎng)液進(jìn)行調(diào)整,促使細(xì)胞懸液濃度5.0×107/L,接種細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板中,每一孔1000μl,37℃、50ml/L二氧化碳、飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng),24h后,更換為不含胎牛血清的1640培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24h,促使細(xì)胞同步化。換含濃度25mg/L、50mg/L、100mg/L的溫郁金提取物1、2的完全培養(yǎng)基,陰性對照組細(xì)胞選擇1000μl完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48h,收集各組培養(yǎng)液,參照IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ放免試劑盒操作說明書,規(guī)范測定IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ濃度,通過自動r計數(shù)器直接給出相關(guān)參數(shù)。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察比較細(xì)胞抑制率及IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ濃度。其中,控制率的計算公式如下:抑制率(%)=[(陰性對照組A-空白組A)-(實驗組A-空白組A)]/(陰性對照組A-空白組A)×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 抑制率

數(shù)據(jù)分析顯示,隨著劑量增加,溫郁金提取物1、2對胃癌細(xì)胞的抑制率呈增加趨勢,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中,200mg/L溫郁金提取物1、2與5-Fu對胃癌細(xì)胞的抑制作用差異不大(P>0.05)。如表1所示。

表1 不同藥物對胃癌細(xì)胞生長的抑制作用

2.2 IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ濃度

數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),提取物1、2的IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ含量低于對照組,差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。如表2所示。

表2 觀察溫郁金對IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ的影響

3 討論

溫郁金屬于姜科植物,有些呈卵形、長卵形,有些呈紡錘形?！侗静菥V目》記載溫郁金具有殺菌、鎮(zhèn)痛、利膽等功效。溫郁金的根莖經(jīng)過加工處理,不僅可抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗血栓,而且在保肝以及增強(qiáng)免疫力等方面有著顯著作用[2]。近二十年來,超臨界二氧化碳萃取技術(shù)得到顯著進(jìn)步,成為提取中藥有效成分的新手段,優(yōu)勢明顯。該項目中,采用超臨界二氧化碳萃取技術(shù),得到提取物1(主要含姜黃素)與提取物2(主要是揮發(fā)油成分),經(jīng)MTT分析發(fā)現(xiàn),且濃度增加,抑制率呈增加趨勢。細(xì)胞增生、分化及凋亡、突變等過程中,IGF發(fā)揮著重要作用。近些年,學(xué)者們就IGF在腫瘤細(xì)胞生長及發(fā)展中的作用進(jìn)行了大量研究,證實IGF與多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展均有關(guān)。1990年,Thompson 等人最先報道人胃癌細(xì)胞系LIM-1839中可見IGF-Ⅱ。1992年,Chung and Antoniades對3個人的胃癌標(biāo)本進(jìn)行原位雜交法分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅰ mRNA表達(dá)[3]。該項目觀察發(fā)現(xiàn),溫郁金提取物1、2對胃癌細(xì)胞培養(yǎng)液中的IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ有明顯影響,促使IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ含量下降,由此可推測溫郁金可通過對胃癌細(xì)胞IGF分泌的影響,發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述,溫郁金具有抑制胃癌細(xì)胞生長的作用,而且這種抑制作用可能與IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ表達(dá)存在關(guān)聯(lián)。