陳軍 孫嫘 惠建榮 李秀玉 胡蓉 李靜

2019年國(guó)家癌癥中心發(fā)布了最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，中國(guó)女性乳腺癌每年發(fā)病約30.4萬(wàn)，高居女性腫瘤發(fā)病的首位，尤其是三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)發(fā)病率逐年升高，常規(guī)治療十分有限，是目前亟待解決的公共衛(wèi)生難題。現(xiàn)已證實(shí)，TNBC的惡性表型及放、化療耐受均與其腫瘤細(xì)胞代謝方式密切相關(guān)[1]。糖酵解是惡性腫瘤顯著的生化特征，即使氧供充足，腫瘤細(xì)胞依然采用糖酵解作為其獲得能量的主要方式，這種代謝稱為“瓦伯格效應(yīng)”[2]。現(xiàn)代研究證實(shí)艾灸的生物學(xué)機(jī)制與干預(yù)機(jī)體能量代謝模式有關(guān)。如，艾灸較針刺可以更有效調(diào)節(jié)骨骼肌能量代謝[3]；艾灸足三里可提升其穴位局部Na+/K+-ATP酶活性[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，艾灸可緩解晚期腫瘤患者癌因性疲乏，改善生活質(zhì)量[5]。以上均證明，艾灸可有效參與能量代謝的調(diào)節(jié)。

本次研究以三陰性乳腺癌細(xì)胞移植瘤小鼠為研究模型，觀察艾灸對(duì)于荷瘤小鼠的干預(yù)作用，探究艾灸調(diào)控腫瘤代謝的機(jī)制是否與抑制瓦伯格效應(yīng)有關(guān)，為探尋TNBC的中西醫(yī)綜合治療提供研究借鑒和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株

BALB/c雌性野生小鼠80只，體質(zhì)量25～30 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006；飼養(yǎng)于26～27℃、12/12小時(shí)光照/黑暗交替的環(huán)境中；Luci-MB-231細(xì)胞株購(gòu)自于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心。

1.2 主要試劑與儀器

缺氧誘導(dǎo)因子-1的RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche公司，批號(hào)：RAB1057)。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)(批號(hào)：ab92498)、α-酮戊二酸(2-Ketoglutaric acid，α-KG)(批號(hào)：ab83431)、己糖激酶(hexokinase2，HK2)(批號(hào)：ab273721)、丙酮酸激酶M2型(pyruvate kinase M2，PKM2)(批號(hào)：ab89364)、乳酸脫氫酶-A(lactate dehydrogenase A，LDHA)(批號(hào)：ab300637)抗鼠單克隆抗體均購(gòu)自abcam公司。蛋白裂解液RIPA裂解液(批號(hào)：P0013C)、特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(批號(hào)：P0018AS)、顯影定影試劑盒(批號(hào)：P0019)均購(gòu)自碧云天公司。

1.3 動(dòng)物造模

Luci-MB-231細(xì)胞株從液氮中取出，常規(guī)復(fù)蘇并傳代至3～4代，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107/mL收集予以皮下移植。小鼠常規(guī)麻醉，仰臥位固定，于右側(cè)上肢腋窩下注入，緩慢推入Luci-MB-231細(xì)胞混懸液0.2 mL，成瘤后觀察。

1.4 艾灸干預(yù)

成瘤后90只小鼠隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組各45只，其中每組再隨機(jī)選出30只用于觀察小鼠體質(zhì)量與生存率并評(píng)估；另15只用于樣本采集，不計(jì)入小鼠體質(zhì)量及生存率統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)組采用艾灸干預(yù)(見(jiàn)圖1)：穴位參考李忠仁主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》，選取關(guān)元穴、氣海穴、中脘穴。小鼠每日抓取放入固定器固定，每天每穴灸20分鐘，連續(xù)艾灸6周。對(duì)照組進(jìn)行相同操作，但灸條不點(diǎn)燃。

圖1 實(shí)驗(yàn)組艾灸干預(yù)流程示意圖

1.5 指標(biāo)觀測(cè)

1.5.1 體質(zhì)量曲線 模型建立后第2、4、6、8周結(jié)束時(shí)用電子天平稱取動(dòng)物的體質(zhì)量，單位g，分析荷瘤小鼠體質(zhì)量變化的差異。

1.5.2 腫瘤增殖測(cè)定 模型建立后第2、4、6、8周，分別于兩組樣本采集模型小鼠中隨機(jī)選取3只，若第8周用于樣本采集的小鼠存活數(shù)不足3只，可從觀察生存期的相對(duì)應(yīng)兩組模型小鼠中隨機(jī)選取補(bǔ)充至3只，剝離小鼠皮下瘤體獲得樣本，電子天平稱取瘤重，單位mg。

1.5.3 荷瘤小鼠生存曲線 模型建立后每天觀察小鼠生存情況，時(shí)間結(jié)點(diǎn)為滿8周，統(tǒng)計(jì)死亡個(gè)數(shù)與剩余個(gè)數(shù)，并繪制動(dòng)物生存曲線。

1.5.4 乳酸水平及乳酸脫氫酶檢測(cè) 模型建立后第2、4、6、8周，分別于兩組樣本采集模型小鼠中隨機(jī)選取3只存活小鼠采血獲得血清，若第8周用于樣本采集的小鼠存活數(shù)不足3只，可從觀察生存期的相對(duì)應(yīng)兩組模型小鼠中隨機(jī)選取補(bǔ)充至3只。采用Premier 3000血?dú)馍治鰞x測(cè)定乳酸值，比色法測(cè)定乳酸脫氫酶含量。

1.5.5 實(shí)時(shí)熒光PCR分析HIF-1α的mRNA水平 在腫瘤增殖測(cè)定的基礎(chǔ)上，裂解組織并TRIzol提取總RNA，紫外吸收測(cè)定RNA溶液濃度和純度，DEPC去除RNA酶；取3 μg的RNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先95℃干浴3分鐘，得到終溶液即為cDNA溶液；上樣，加入引物反應(yīng)體系，隨之將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于實(shí)時(shí)PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：93℃預(yù)變性2分鐘，然后按93℃、1分鐘，55℃、1分鐘，72℃、1分鐘，最后72℃、7分鐘延伸。HIF-1α(Gene ID 54632127)引物設(shè)計(jì)：Forward primer：CAGGTTCCTTTCCGTCACCC CCCG；Reverse primer: CAGGCGGGCGACGGAACTTGAAG。

1.5.6 蛋白免疫印跡法分析HIF-1α及糖酵解激酶的表達(dá)水平 模型建立后第2、8周，在腫瘤增殖測(cè)定的基礎(chǔ)上，獲取樣本，RIPA裂解液裂解后、離心后獲得蛋白樣本，加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100℃沸水浴充分變性蛋白；室溫冷卻，上樣到SDS-PAGE膠加樣孔、轉(zhuǎn)膜、BSA封閉，加入稀釋好的一抗，4℃孵育過(guò)夜；二抗室溫孵育1小時(shí)，ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，壓片后曝光，顯影、定影。檢測(cè)HIF-1α、α-KG、HK2、PKM2、LDHA的表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 艾灸對(duì)移植瘤增殖的影響

解剖獲得腫瘤組織進(jìn)行稱量(單位mg)，實(shí)驗(yàn)組瘤體質(zhì)量與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)圖2，表1。

圖2 各組三陰性乳腺癌移植瘤小鼠瘤體增殖情況

表1 各組三陰性乳腺癌移植瘤小鼠瘤體增殖情況

2.2 艾灸對(duì)荷瘤小鼠體質(zhì)量與生存率的影響

對(duì)照組小鼠體質(zhì)量增加緩慢，且于第6周時(shí)體質(zhì)量出現(xiàn)下降，實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量未見(jiàn)明顯降低，6周時(shí)兩組比較尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；至第8周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量維持良好，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。并且，實(shí)驗(yàn)組8周生存率46.67%，對(duì)照組生存率16.67%，實(shí)驗(yàn)組生存率明顯優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

表2 各組三陰性乳腺癌荷瘤小鼠體質(zhì)量比較

注：與對(duì)照組相比，P<0.05。

2.3 艾灸對(duì)荷瘤小鼠血清乳酸、LDHA水平的影響

實(shí)驗(yàn)組小鼠血清乳酸及LDHA水平在第6周時(shí)均較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)，至第8周時(shí)，出現(xiàn)顯著性降低(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 艾灸對(duì)三陰性乳腺癌荷瘤小鼠血清乳酸及LDHA水平的影響

2.4 艾灸對(duì)荷瘤小鼠HIF-1α的mRNA表達(dá)的影響

至第4周時(shí)，可以看出實(shí)驗(yàn)組HIF-1α的mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.01)，且該差異隨時(shí)間延續(xù)持續(xù)存在，至6周、8周仍具有顯著差異。見(jiàn)表4。

表4 各組三陰性乳腺癌荷瘤小鼠HIF-1α的mRNA表達(dá)比較

2.5 艾灸對(duì)荷瘤小鼠糖酵解相關(guān)激酶及HIF-1α蛋白表達(dá)的影響

于第2、8周時(shí)收集腫瘤組織樣本。如圖4所示，2周時(shí)，各組蛋白比較未見(jiàn)明顯差異；至第8周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組HIF-1α與α-KG、HK2、PKM2、LDHA的蛋白表達(dá)都顯著降低。

圖4 各組三陰性乳腺癌荷瘤小鼠HIF-1α、α-KG、HK2、PKM2、LDHA蛋白表達(dá)情況

3 討論

關(guān)于腫瘤細(xì)胞能量代謝特性，諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Otto Warburg提出了著名的“瓦伯格效應(yīng)”(Warburg effect)：腫瘤細(xì)胞偏好于采用糖酵解方式進(jìn)行葡萄糖代謝，而不是產(chǎn)生ATP效率更高的線粒體氧化磷酸化方式[6]。這也部分解釋了為什么能量剝奪往往并沒(méi)有起到控瘤的作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，TNBC之所以較其他類型乳腺癌進(jìn)展迅速、更容易耐藥[8]，晚期患者出現(xiàn)的惡液質(zhì)、乏力、疼痛[9]，均與瓦伯格效應(yīng)關(guān)系密切。

《靈樞·官能》曰“針?biāo)粸?，灸之所宜”“陰?yáng)皆虛，火自當(dāng)之”，中醫(yī)認(rèn)為，艾灸具有扶正、固陽(yáng)等作用，能有效扶助人體正氣。正氣泛指人體各臟腑、氣血的正常功能和抗病能力，當(dāng)然也包括人體正常而高效的能量代謝模式。翟道蕩等研究表明，艾灸關(guān)元穴可明顯提高肝細(xì)胞內(nèi)ATP分子水平，顯著增加了肝細(xì)胞的磷酸化潛力，從能量代謝的角度闡述了艾灸抗腫瘤的部分機(jī)制[10]。本次研究發(fā)現(xiàn)，艾灸確有提高移植瘤小鼠“正氣”的作用，能夠提高荷瘤鼠的體質(zhì)量并顯著增加其生存率。

研究表明，乳酸及LDHA水平能夠精確反映生物體能量獲取方式的變化[11]。乳酸、LDHA的水平越高越反映機(jī)體在糖酵解應(yīng)激下的調(diào)節(jié)模式，即瓦伯格效應(yīng)越占優(yōu)勢(shì)，LDHA越高腫瘤惡性程度越高、進(jìn)展越快[12]。本次實(shí)驗(yàn)以Luci-MB-231系構(gòu)建荷瘤小鼠，采用艾灸為干預(yù)措施，發(fā)現(xiàn)艾灸能夠降低移植瘤小鼠腫瘤組織的乳酸與LDHA水平，艾灸能夠影響瓦伯格效應(yīng)得到了初步驗(yàn)證。

研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α是觸發(fā)瓦伯格效應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子[13-14]，會(huì)啟動(dòng)下游一系列糖酵解代謝激酶諸如α-KG、HK2、PKM2[15]、LDHA[16]的激活。腫瘤惡性程度越高，HIF-1α表達(dá)也越高，并且與惡液質(zhì)、多藥耐藥、放療耐受、免疫逃逸均密切相關(guān)[17-18]。研究表明，溫度感受器TRPV1、壓力感受器PIEZO1和PIEZO2等都能將體表溫度或者壓力刺激傳入機(jī)體，撬動(dòng)神經(jīng)或免疫反應(yīng)[19-20]。然而，艾灸如何影響腫瘤目前的基礎(chǔ)研究還比較少。本研究發(fā)現(xiàn)，艾灸可顯著降低HIF-1α的mRNA與蛋白的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析下游糖酵解激酶活化水平，發(fā)現(xiàn)艾灸能夠顯著降低α-KG、HK2、PKM2、LDHA的表達(dá)。本研究初步證實(shí)，艾灸影響瓦伯格效應(yīng)是通過(guò)HIF-1α并進(jìn)一步影響下游糖酵解激酶實(shí)現(xiàn)的。

本次研究發(fā)現(xiàn)艾灸可有效提高TNBC模型鼠的體質(zhì)量及生存率，且初步證實(shí)其作用與瓦伯格效應(yīng)的抑制有關(guān)，對(duì)于艾灸廣泛整合入乳腺癌的綜合治療有現(xiàn)實(shí)的科學(xué)意義，為傳統(tǒng)中醫(yī)外治手段的專病運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。然而，瓦伯格效應(yīng)機(jī)制十分復(fù)雜，影響腫瘤功能也呈現(xiàn)多種多樣，艾灸是否也可影響其他轉(zhuǎn)錄因子；再者，其對(duì)于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體影響有無(wú)作用；又或者，其對(duì)于免疫的調(diào)節(jié)是否也經(jīng)由代謝實(shí)現(xiàn)，這些都有賴于將來(lái)更多的發(fā)掘與探索。