鄺 輝,尚 娟,努爾比葉,鄭偉萍,楊 凡

（1.喀什地區(qū)第二人民醫(yī)院檢驗科，新疆喀什 844000；2.上海市同濟醫(yī)院檢驗科，上海 200065）

靜 脈 血 栓 栓 塞 癥（venous thromboembolism,VTE）是一種臨床漏診率和死亡率都很高的疾病，其發(fā)病原因至今尚不十分清楚[1]。南疆地區(qū)維吾爾族人群由于種族特性、生活方式和飲食習(xí)慣等的特殊性，VTE發(fā)病率較漢族人群更高，發(fā)病年齡也更早，給當(dāng)?shù)厝嗣駧韲乐氐纳徒】低{[2]。研究證實，VTE的發(fā)生與人體免疫功能缺陷密切相關(guān)，VTE患者普遍存在細胞免疫平衡功能的紊亂[3]。輔 助 性T細 胞 17（T helper 17 cells，Th17）通 過分泌多種細胞因子促進炎癥反應(yīng)，而調(diào)節(jié)性 T細胞（regulatory T cells，Treg）可以抑制T細胞免疫活性降低炎癥導(dǎo)致的損傷[4]。Th17/Treg平衡對于維持人體免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定意義重大，Th17/Treg平衡失調(diào)是包括靜脈血栓在內(nèi)的多種疾病發(fā)生的重要影響因素[5]。另外研究表明，細胞黏附與血栓的形成有關(guān)，其黏附分子家族中選擇素家族、整合素家族及免疫球蛋白超家族等可通過介導(dǎo)內(nèi)皮細胞、血小板、白細胞等細胞與細胞之間或細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用，參與血栓的溶解過程及深靜脈血栓的形成[6-7]。因此本研究通過檢測新疆維吾爾族VTE患者外周血中Th17/Treg細胞及其相關(guān)細胞因子和黏附分子的水平變化，來探討Th17/Treg在維吾爾族VTE患者中的表達及其對VTE的臨床診斷價值，以期為尋找新的診斷標志物和治療靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 回顧性選擇2017年1月～2019年6月喀什地區(qū)第二人民醫(yī)院確診的維吾爾族VIE患者63例作為研究對象，VTE診斷標準：①具備術(shù)后、長期臥床、炎癥、腫瘤、妊娠、高齡和肥胖等高危因素；②具有胸痛、呼吸困難、下肢腫脹等臨床癥狀；③臨床wells危險評分達到3分以上或2分以上并發(fā)D-二聚體陽性；④所有病例均經(jīng)螺旋CT，多普勒超聲或靜脈造影明確診斷。VIE患者中男性35例，女性29例，年齡28～76（54.15±12.64）歲。同時以排除靜脈血栓和VTE高危因素的維吾爾族體檢健康人群70例作為對照組，其中男性38例，女性32例，年齡在29～75（52.63±11.25）歲。兩組患者性別、年齡及實驗室各項血細胞檢測參數(shù)等比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表1，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過，所有患者均簽署知情同意書。

表1 VTE組與對照組一般資料比較[±s，n(%)]

表1 VTE組與對照組一般資料比較[±s，n(%)]

?

1.2 儀器和試劑 PerCP-Cy5.5標記的抗CD3，異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的抗CD4，藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）標記的抗CD194和CD127，別藻藍蛋白(Allophycocyanin，APC)標記的抗CD25和CD196單克隆抗體（北京同生時代生物技術(shù)有限公司）；流式細胞儀（FACS Via，美國BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 血液樣本采集：入院后采集VTE組患者外周靜脈血2 ml，對照組于體檢當(dāng)日采集外周靜脈血2 ml，均肝素抗凝保存。

1.3.2 Th17細胞檢測：取新鮮抗凝全血100 μl，每管加入PerCP-Cy5.5標記的抗CD3，F(xiàn)ITC標記的抗CD4，PE標記的抗CD194和APC標記的抗CD196單克隆抗體各10 μl，充分混勻后室溫避光孵育25 min；加溶血素1 ml，37 ℃孵育25 min，洗滌三次后上流式細胞儀檢測。

1.3.3 Treg細胞檢測：取新鮮抗凝全血100 μl，每管加入PerCP-Cy5.5標記的抗CD3，F(xiàn)ITC標記的 抗CD4，APC標記 的 抗CD25和PE標 記的 抗CD127單克隆抗體各10 μl，充分混勻后室溫避光孵育25 min；加溶血素1 ml，37 ℃孵育25 min，洗滌3次后上流式細胞儀檢測。

1.3.4 細胞因子檢測：采用RAISECARE多重微球流式免疫熒光發(fā)光法試劑盒檢測，取新鮮抗凝全血2 ml，離心吸取25 μl血漿加入到已加有25μl實驗緩沖液樣本管中，標準曲線管則加25 μl基質(zhì)和25 μl校準品；所有管中加入25 μl捕獲微球抗體和25 μl檢測抗體，室溫避光震蕩孵育2 h（400～500 r/min）；加入25 μl藻紅蛋白標記的鏈霉親和素（SA-PE），室溫避光震蕩孵育0.5 h（400～500 r/min），洗滌2次后加入150 μl緩沖液重懸微球上流式細胞儀檢測。

1.3.5 整合素檢測：取3管，每管加入肝素抗凝血100 μl，分別加入藻紅蛋白（PE）標記的抗CD29和異硫氰酸熒光素（FITC）標記的抗CD4（整合素β1，CD4+CD29+）、抗CD18（整合素β2）、抗CD61（整合素β3）單克隆抗體（Invitrogen），室溫避光孵育30 min后加入溶血素500 μl，37 ℃孵育30 min后洗滌三次后上流式細胞儀檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSSl8.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有計量資料采用均數(shù)±標準差(±s)的方式表述，組間表達差異比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料采用例數(shù)（%）表示，組間差異比較采用χ2檢驗；臨床診斷價值分析采用受試者工作曲線（ROC曲線）。所有統(tǒng)計分析均采用雙側(cè)檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者Th17/Treg表達情況比較 見表2。與對照組相比，VTE組患者Th17細胞（CD3+CD4+CD194+CD196+）和Treg細 胞（CD3+CD4+CD25+CD127+，CD127為弱陽性）表達水平均明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），且Th17升高幅度大于Treg，導(dǎo)致Th17/Treg比例增大。

表2 VTE組和對照組Th17/Treg表達比較（±s）

表2 VTE組和對照組Th17/Treg表達比較（±s）

?

2.2 兩組患者Th17，Treg相關(guān)細胞因子表達比較見表3。與對照組相比，VTE組患者Th17細胞和Treg細胞分泌的相關(guān)細胞因子IL-6，IL-17，IL-2，IL-10和TNF-α均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），其中IL-6，IL-17升高最為明顯。

表3 VTE組和對照組Th17，Treg相關(guān)細胞因子表達（±s, pg/ml）

表3 VTE組和對照組Th17，Treg相關(guān)細胞因子表達（±s, pg/ml）

?

2.3 兩組患者整合素β分子表達比較 見表4。VTE組患者整合素β1，β2和β3分子表達均值明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

表4 VTE組和對照組整合素β1，β2，β3分子表達比較［（±s ）%］

表4 VTE組和對照組整合素β1，β2，β3分子表達比較［（±s ）%］

?

2.4 ROC曲線預(yù)測Th17，Treg細胞及整合素β對VTE的診斷效能 見圖1和表5。以臨床診斷結(jié)果為標準，經(jīng)繪制ROC曲線分析顯示，Th17，Treg細胞及Th17/Treg比值最佳截斷值分別取27.45%，11.26%，2.51時診斷靈敏度、特異度均較高，診斷VTE的AUC值分別為0.826，0.809和0.745，均＞0.7，診斷效能良好。當(dāng)整合素β1，β2，β3最佳截斷值分別取13.97%，93.75%和12.88%時診斷VTE的AUC值分別為0.723，0.706和0.698，診斷靈敏度、特異度均較高。

3 討論

目前，靜脈血栓發(fā)病機制仍不十分清楚，但多項研究表明其發(fā)生與細胞免疫平衡破壞關(guān)系密切。研究表明，VTE患者自然殺傷細胞和T淋巴細胞功能顯著下調(diào)[8]。急性VTE患者組普遍存在CD3，CD8，NK和CD19表達顯著降低或表達失衡[9]。指出靜脈血栓細胞免疫功能失衡存在多種細胞因子的表達異常，如白細胞介素、腫瘤壞死因子等多種炎性因子和細胞間黏附分子-1，整合素等多種黏附分子的表達異常增高是靜脈血栓形成的重要特征[10]。故積極探究細胞免疫功能失衡在VTE形成中的意義及其臨床價值具有重要意義。

Th17和Treg是重要的細胞免疫功能性調(diào)節(jié)分子，均由初始T細胞分化而來，但在功能上互相拮抗，其中Th17主要通過分泌IL-17，IL-21，IL-6和TNF-α等多種細胞因子促進炎癥反應(yīng)[4]，而Treg通過分泌IL-2，IL-10和TGF-β等細胞因子可抑制炎性細胞因子和抗體的產(chǎn)生，抑制Th17的作用[11]。在機體內(nèi)Th17和Treg保持動態(tài)平衡，共同維持機體免疫內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，其平衡被打破就會導(dǎo)致感染性疾病、自身免疫性疾病及腫瘤等多種疾病的發(fā)生[12]，也是近年臨床實驗研究的一大熱點。在靜脈血栓的研究中，既往王彬等[13]曾研究表明，急性期下肢深靜脈血栓（DVT）患者體內(nèi)Treg亞群比例降低，Th17亞群比例及IL-17水平明顯升高，DVT急性期Th17亞群占主導(dǎo)地位。一項動物實驗中孫濤等[14]表明，DVT模型大鼠發(fā)病過程中Th17亞群比例亦升高，Treg亞群比例亦降低，Th17/Treg＞1失衡，均提示Th17/Treg失衡參與DVT的發(fā)生。另據(jù)近年報道，白介素（IL-1，IL-2，IL-6，IL-10等）參與DVT過程，DVT患者血漿IL-17A高表達，其通過促進中性粒細胞浸潤、血小板聚集及內(nèi)皮細胞激活促進了DVT形成[6]。且研究發(fā)現(xiàn)，大鼠血清IL-17表達升高與DVT形成呈正相關(guān)，IL-17A上調(diào)血小板聚集率，可通過調(diào)節(jié)巨噬細胞炎性蛋 白（macrophage inflammatory protein 2, MIP-2）表達和中性粒細胞外誘捕網(wǎng)的釋放，促進中性粒細胞向血栓的浸潤，加重DVT[15]。IL-6可通過調(diào)節(jié)巨噬細胞的募集，增強其在血栓中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和尿激酶型纖溶酶原激活物（PLAU）表達，促進血栓溶解[16]。IL-10啟動子多態(tài)性及IL-10-1082A/G基因多態(tài)性與VTE形成相關(guān)，IL-10可作為血栓形成的重要臨床預(yù)測指標[17]。而本研究在對南疆地區(qū)維吾爾族靜脈血栓患者的研究中發(fā)現(xiàn)，VTE患者Th17和Treg細胞表達明顯升高，Th17升高程度較Treg大，反映在Th17/Treg比例明顯增高，這說明靜脈血栓發(fā)生時存在細胞免疫內(nèi)環(huán)境的破壞，Th17/Treg平衡失調(diào)。相關(guān)細胞因子檢測結(jié)果也證實Th17和Treg細胞分泌的細胞因子明顯增加，特別是炎癥因子IL-6和特征性細胞因子IL-17增加更為顯著。IL-17是T細胞介導(dǎo)的炎癥反映的早期啟動因子，可以促進血管局部炎癥發(fā)生[18]。而IL-6則有誘導(dǎo)分化Th17細胞，抑制Treg分化的作用，可以導(dǎo)致免疫失衡，產(chǎn)生細胞因子風(fēng)暴，使炎癥反應(yīng)放大[19]。IL-6和IL-17的異常升高反映血栓形成時炎癥反應(yīng)被不斷放大，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致免疫功能的進一步失衡，使病情加重[6,15]。

另一方面，由于炎癥和細胞因子的作用，淋巴細胞分泌整合素，介導(dǎo)白細胞和血小板在血管局部聚集，破壞血管內(nèi)皮細胞最終導(dǎo)致血栓形成整合素是一種細胞黏附分子亞單位，負責(zé)細胞內(nèi)外信號傳導(dǎo)及調(diào)控細胞間相互作用，是靜脈血栓形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[21]。整合素在動脈粥樣硬化、血栓、血管新生或重構(gòu)及動脈瘤等心血管疾病中發(fā)揮重要作用，是心血管疾病治療的新靶點[21]。且發(fā)現(xiàn)整合素與血栓形成關(guān)系密切，并研究表明整合素αⅡaβ3與載脂蛋白A4結(jié)合能夠抑制血栓的形成[22]。炎性小體NLRP3通過IL-1β能夠調(diào)控αⅡaβ3進而影響血栓形成，提示血栓與炎癥之間存在一種新的分子連接[23]。而本研究檢測發(fā)現(xiàn)維吾爾族靜脈血栓患者整合素β1，β2和β3分子均高表達，說明整合素分子在靜脈血栓的形成中具有重要作用。繪制ROC曲線，顯示Th17/Treg細胞及整合素β對VTE均具有良好的預(yù)測價值，診斷AUC值及靈敏度和特異度均較高，提示其對VTE具有一定的臨床診斷價值，可將其作為南疆地區(qū)維吾爾族患者VTE發(fā)生與否的診斷標志物。然而本研究為單中心樣本分析，樣本有限，Th17/Treg細胞及整合素β對VTE的診斷界值尚需繼續(xù)探究驗證。

綜上所述，Th17/Treg平衡失調(diào)及相關(guān)細胞因子和黏附分子的異常增高是VTE發(fā)生機制中的重要特征，可以通過監(jiān)測Th17/Treg及其細胞因子和整合素的變化來預(yù)測評估是否發(fā)生血栓，為VTE早期診斷和療效評定提供客觀依據(jù)，并為將來開發(fā)新型藥物來調(diào)整免疫內(nèi)環(huán)境，重新恢復(fù)細胞免疫平衡來控制炎癥、防治VTE提供新的思路。