楊春光，劉海紅，王鳳東，王曉靜，張學(xué)郁，張海波

（承德市婦幼保健院 a.新生兒科；b.檢驗科；c.兒科，河北承德 067020）

特發(fā)性肺動脈高壓（idiopathic pulmonary arterial hypertension，IPAH）成人發(fā)病率為15～50例/100萬人/年，無特異性臨床癥狀，易引起右心功能衰竭甚至死亡[1-2]。相較于成人，兒童處于生長發(fā)育狀態(tài)，肺血管生理和病理改變更加特殊，IPAH患兒的肺動脈壓力、肺血管阻力和心臟指數(shù)升高更明顯，預(yù)后更差，未經(jīng)治療者平均存活時間僅為10個月，1，3，5年生存率分別為89%，84%和75%[3]。目前認(rèn)為IPAH可能與遺傳多態(tài)性、多基因缺陷、細(xì)胞因子和生長因子分泌異常有關(guān)[4-5]。微小核糖核酸（micro RNA，miR）-182對細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物效應(yīng)具有關(guān)鍵的調(diào)控作用，與肺癌關(guān)系密切[6]。細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、氣道柱狀上皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞表面，主要作用是介導(dǎo)細(xì)胞黏附、參與免疫應(yīng)答和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[7]。既往研究[8]顯示，微小核糖核酸（micro RNA）miRNA可能通過某種機制對ICAM-1表達(dá)產(chǎn)生影響。本研究旨在探究血清miR-182和ICAM-1在IPAH患兒中的表達(dá)及對患兒預(yù)后的預(yù)測價值，以期為臨床診治、改善IPAH患兒預(yù)后提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2016年6月～2020年12月就診于承德市婦幼保健院肺動脈高壓中心的76例IPAH患兒為研究對象（觀察組），其中男性45例，女性31例；年齡1～10（5.63±4.26）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷均符合PAH指南[9]；②超聲心動圖檢查估測肺動脈收縮壓（systolic pulmonary artery pressure，sPAP）＞36 mmHg（1 mmHg=0.133kPa）；③靜 息狀態(tài)下右心導(dǎo)管檢查肺毛細(xì)血管楔壓（pulmonary capillary wedge pressure，PCWP）≤15mmHg，肺血管阻力（pulmonary vascular resistance，PVR）＞3 Wood·U，肺動脈平均 壓（mean pulmonary artery pressure，mPAP）＞25 mmHg；④均具備用藥指征；⑤患兒監(jiān)護(hù)人對本研究均知情同意并簽字確認(rèn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①診斷為先天性心臟病、結(jié)締組織病相關(guān)性PAH者；②由原發(fā)肺部疾病或肺栓塞及其他原因引起的PAH者；③并發(fā)嚴(yán)重的肝腎功能不全者；④中途轉(zhuǎn)院或放棄治療者；⑤存在用藥禁忌證者。另選取同期在醫(yī)院進(jìn)行體檢的健康兒童30例作為對照組，其中男性18例，女性12例；年齡1～9（5.27±3.82）歲。兩組一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過。

1.2 儀器與試劑 SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；miR-182，ICAM-1試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 治療方案：參照兒童PAH指南[10]給予治療。

1.3.2 血清miR-182，ICAM-1檢測：抽取健康對照組兒童及IPAH患兒入院24h內(nèi)的外周靜脈血3 ml，離心收集上層血清。以U6為內(nèi)參，提取血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，PCR共進(jìn)行40個循環(huán)，重復(fù)三次，采用2-ΔΔCt法計算血清miR-182相對表達(dá)水平。miR-182上游引物：5'-GCGCGTGGTTCTAGA CTTGC-3，下游引物：5'-ATCCAGTGCAGGGTC CGAGG-3'；U6上游引物：5'-GCTTCGGCAGCACA TATACTAAAAT-3'；下游引物：5'-AACGCTTCACG AATTTGCGT-3'，均由上海生工生物工程有限公司合成。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）測定血清ICAM-1水平。

1.3.3 隨訪及預(yù)后分組：隨訪至2021年12月，主要以電話、微信及門診等形式進(jìn)行，記錄終點事件（隨訪終點為全因死亡或接受肺移植術(shù)）[10]，根據(jù)終點事件發(fā)生與否將所有入組患兒分為存活組和死亡組。

1.3.4 資料收集：收集IPAH患兒的相關(guān)臨床資料，包括性別、年齡、體重、臨床癥狀（青紫、暈厥、咯血、水腫）、P波高尖、NYHA心功能分級、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）、尿酸（uric acid，UA）、總膽紅素（total bilirubin，TB）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、紅細(xì)胞分布寬度（red cell volume distribution width，RDW），sPAP，mPAP，全肺阻力（total pulmonary resistance，TPR）、肺血管 阻 力 指 數(shù)（pulmonary vascular resistance index，PVRI）、心臟指數(shù)（cardiac index，CI）、經(jīng)皮血氧飽和度、三尖瓣反流速率、左心室舒末徑、X線心胸比、治療方案（單藥治療、雙藥聯(lián)合治療、三藥聯(lián)合治療）、血清miR-182和ICAM-1水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS26.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料經(jīng)正態(tài)分布和方差齊性檢驗后采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，若方差不齊，則采用t'檢驗；預(yù)測效能分析采用ROC曲線，獲取曲線下面積、95%可信區(qū)間、敏感度、特異度及cut-off值，不同預(yù)測方案間曲線下面積（area under curve，AUC）比較采用DeLong檢驗，聯(lián)合診斷實施Logistic二元回歸擬合，返回預(yù)測概率logit(p)，將其作為獨立檢驗變量。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組與對照組血清miR-182，ICAM-1水平比較 觀察組血清miR-182（1.91±0.20），ICAM-1（305.67±32.46 ng/ml）水平均高于對照組（0.15±0.02，203.22±21.51 ng/ml），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t'=-73.624，-33.698，均P＜0.001）。

2.2 隨訪結(jié)果 對76例IPAH患兒進(jìn)行隨訪，共獲得72例隨訪結(jié)果，總體隨訪率為94.74%，失訪4例，失訪率為5.26%；獲得隨訪的72例IPAH患兒死亡21例（29.17%），其中因感染、腹瀉等所致右心衰竭死亡15例（71.43%），因大咯血窒息死亡6例（28.57%），存活51例（70.83%）。

2.3 存活組與死亡組IPAH患兒臨床資料比較 見表1。死亡組NYHA心功能分級（高級）占比、BNP，TB，RDW，sPAP，TPR，miR-182，ICAM-1水平均高于存活組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；兩組性別、年齡、體重、臨床癥狀、P波高尖、UA，LDH，mPAP，PVRI，CI，經(jīng)皮血氧飽和度、三尖瓣反流速率、左心室舒末徑、X線心胸比、治療方案比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

表1 存活組與死亡組IPAH患兒臨床資料比較[±s, n（%）]

表1 存活組與死亡組IPAH患兒臨床資料比較[±s, n（%）]

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2.4 影響IPAH患兒預(yù)后的多因素Logistic回歸分析 見表2。多因素Logistic回歸分析顯示，NYHA心功能分級（高級）、RDW，sPAP，miR-182，ICAM-1是影響IPAH患兒預(yù)后的危險因素（P＜0.05）。

表2 影響IPAH患兒預(yù)后的多因素Logistic回歸分析

2.5 血清miR-182，ICAM-1對IPAH患兒預(yù)后的預(yù)測價值 見表3，圖1。血清miR-182，ICAM-1預(yù)測IPAH患兒預(yù)后有較高的敏感度和特異度，同時聯(lián)合檢測的效能高于獨立檢測（Z=-3.236，P=0.012；Z=-3.211，P=0.009）。

表3 血清miR-182，ICAM-1對IPAH患兒預(yù)后的預(yù)測價值

圖1 血清miR-182，ICAM-1對IPAH患兒預(yù)后的預(yù)測價值

3 討論

目前研究認(rèn)為特發(fā)性肺動脈高壓（IPAH）發(fā)病機制主要與細(xì)胞、體液介質(zhì)、分子遺傳等多個因素有關(guān)[11]。肺血管系統(tǒng)較復(fù)雜，易受多種血管活性物質(zhì)影響，如血管緊張素Ⅱ、血栓素A2等能使肺循環(huán)微動脈收縮，心房利鈉肽、一氧化氮等可使肺血管舒張，上述血管介質(zhì)一旦失衡就易引發(fā)IPAH[12]。相關(guān)資料[13]顯示，大部分IPAH患者的血清炎癥細(xì)胞因子呈現(xiàn)異常高表達(dá)，且免疫指標(biāo)（如抗核抗體）為陽性，并具有免疫系統(tǒng)疾病特有的雷諾現(xiàn)象，推測免疫炎癥紊亂可能參與了IPAH的發(fā)病機制。國外報道兒童IPAH發(fā)病率為10例/100萬，但該病起病隱匿，患兒癥狀差異較明顯，臨床診斷難度較大，極易導(dǎo)致漏診和誤診[5]。故尋找安全高效的血清學(xué)診斷或預(yù)后預(yù)測指標(biāo)尤為重要。

在本研究中，IPAH患兒血清miR-182和ICAM-1水平明顯高于健康兒童，提示血清miR-182和ICAM-1水平在IPAH患兒中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，上述指標(biāo)可能與IPAH發(fā)病機制有關(guān)，臨床診斷或治療中需要給予重點監(jiān)測。miR-182通常被認(rèn)為是原癌基因在腫瘤的高表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，例如miR-182在乳腺癌中高表達(dá)，通過靶向叉頭蛋白F2促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移；在結(jié)腸癌中高表達(dá)，通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路維持腫瘤細(xì)胞的干細(xì)胞狀態(tài)；在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，通過靶向果糖-2,6-二磷酸酶2提高腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲能力[14-16]。近年來大量臨床研究或基礎(chǔ)研究均表明，miRNA在心血管系統(tǒng)信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中起到重要作用，參與IPAH中血管收縮和重構(gòu)中多物質(zhì)的調(diào)控[17-18]。此外，研究者發(fā)現(xiàn)還有更多的miRNA在IPAH患者中存在異常表達(dá)，但迄今為止，僅有數(shù)種miRNA被通過實驗證明確實在IPAH的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定的作用。目前研究顯示，IPAH患者miRNA表達(dá)譜中共有78個差異表達(dá)位點，其中62個顯示上調(diào)，16個下調(diào)，包括miR-17-92，miR-143/145，miR-21和miR-124等，在肺血管收縮和重構(gòu)各個環(huán)節(jié)中發(fā)揮功能，不僅調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖、凋亡、促進(jìn)血管新生，還參與血管平滑肌細(xì)胞增殖、凋亡及表型轉(zhuǎn)化等過程[19]。如郭天聰?shù)萚20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-182在IPAH患者中上調(diào)，并通過調(diào)節(jié)肌細(xì)胞增強因子2C促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖，參與IPAH發(fā)病機制。在IPAH患者中，內(nèi)皮細(xì)胞無序增殖即為肺血管重塑形成，顯示為叢狀病灶，而肺組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)該病灶周圍存在T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞浸潤，提示炎癥細(xì)胞可能參與IPAH發(fā)生發(fā)展[21]。ICAM-1是一種細(xì)胞表面糖蛋白，參與并介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的相互黏附，是炎性反應(yīng)形成的基礎(chǔ)，在體外循環(huán)肺損傷的炎癥反應(yīng)過程中起重要作用[22]。如鐘士杰等[23]研究顯示，車前草提取物可通過降低缺氧性肺動脈高壓SD大鼠模型泡灌洗液中ICAM-1等炎癥因子水平，改善肺動脈及氣道重塑。基于上述分析不難發(fā)現(xiàn)，miR-182與ICAM-1極有可能參與IPAH發(fā)生發(fā)展，當(dāng)然這需要進(jìn)一步驗證。

隨著PAH靶向藥物的應(yīng)用，發(fā)達(dá)國家IPAH患兒的生存率得到了明顯改善，但不同國家對這些藥物的使用并不完全相同，我國IPAH患兒的預(yù)后也尚未完全清楚。在本研究中，獲得隨訪的72例IPAH患兒死亡率為29.17%（21/72），與朱燕等[24]報道的28.9%（11/38）基本一致。死亡組NYHA心功能分級（高級）占比，BNP，TB，RDW，sPAP，TPR，miR-182和ICAM-1水平均高于存活組，Logistic回歸分析顯示，NYHA心功能分級（高級）、RDW，sPAP，miR-182和ICAM-1是影響IPAH患兒預(yù)后的危險因素。上述研究結(jié)果再次提示miR-182和ICAM-1在IPAH的發(fā)生發(fā)展中占據(jù)重要地位，兩種因子聯(lián)合預(yù)測IPAH患兒預(yù)后的AUC為0.883，敏感度和特異度分別為87.10%，62.50%，優(yōu)于各指標(biāo)單獨預(yù)測，提示miR-182，ICAM-1與IPAH患兒預(yù)后關(guān)系密切，可能是反映IPAH患兒預(yù)后的敏感指標(biāo)，聯(lián)合檢查可在一定程度上提高預(yù)測效能，為臨床預(yù)測IPAH患兒預(yù)后提供更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)參考，對該類IPAH預(yù)防、控制與治療具有重要意義。但本研究病例樣本有限，可能存在一定的數(shù)據(jù)偏倚，后續(xù)需收集更多病例做更深入研究，以獲取更為可靠的數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，IPAH患兒血清miR-182和ICAM-1表達(dá)水平較高，二者聯(lián)合檢測在預(yù)測其預(yù)后情況方面具有較高臨床應(yīng)用價值，可為IPAH患兒的診斷、預(yù)防及治療提供參考。